亲和层析法纯化华支睾吸虫抗原的研究

目的探索华支睾吸虫特异性抗原的纯化方法。方法从华支睾吸虫病流行区的淡水鱼中分离华支睾吸虫囊蚴,接种动物,收集成虫,制备匀浆液(粗抗原),借助偶联华支睾吸虫病人血清抗体的Sepharose4B亲和层析柱,提取特异性抗原,用浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(CG-PAGE)和免疫印迹方法鉴定纯化抗原的纯度和特异性。结果亲和层析法纯化抗原经CG-PAGE显示5条蛋白带,免疫印迹试验鉴定均有抗原性,强阳性带蛋白分子质量单位为31ku,各区带蛋白与并殖吸虫、血吸虫血清抗体无交叉反应。粗抗原有16条蛋白带。结论经亲和层析法纯化的华支睾吸虫抗原特异性高。亲合层析是获取华支睾吸虫诊断用抗原的较佳方法。     

排泄分泌抗原以ELISA法用于华支睾吸虫病血清学诊断优于粗抗原

粪检法是华支睾吸虫病的标准诊断方法 ,但由于依从性较差 ,应用起来有困难。为有效控制华支睾吸虫病 ,需要进行高效的群体检测。血清学诊断已快速发展起来并逐渐取代粪检法。虽然皮试法简单快速 ,但特异性较差 ,目前广为应用的是ELISA法。传统ELISA法用华支睾吸虫的粗抗原进行检测 ,敏感性和特异性较好 ,但存在交叉反应 ,因此需要更加敏感和特异的血清学诊断方法以检测华支睾吸虫病。本研究对华支睾吸虫的排泄分泌抗原 (ESA)检测抗体的ELISA法和粗抗原 (CA)检测抗体的ELISA法的诊断价值进行了比较和评估。收集流行区的华支睾吸虫…     

成虫切片免疫酶染色诊断华支睾吸虫病

采用华支睾吸虫石蜡包埋成虫切片做抗原片,应用酶联葡萄球菌A蛋白间接过氧化物酶试验(PPA-IIP)检测华支睾吸虫病犬血清中特异性抗体的效果。 以成虫纵横两种切片检测病犬及正常犬血清(共32例)、正常人血清(30例)、血吸虫病兔血清(10例),结果表明:病犬血清最适稀释度为1:200,酶联葡萄球菌A蛋白适宜工作浓度为1:40。诊断犬华支睾吸虫     

华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶用于血清学调查的效果评价

目的 以华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶(CsCp)为ELISA包被抗原检测流行人群血清特异性抗体水平,与成虫粗抗原比较,评价其用于华支睾吸虫病血清学调查的价值. 方法 以佛山市南海区的1个行政村为调查点,用改良加藤厚涂片法检查粪便华支睾吸虫虫卵.同时采集血清,分别以rCsCP与成虫粗抗原(CsCAA)的ELISA方法检测血清特异性抗体水平,对粪检及两种抗原的ELISA结果进行统计学分析. 结果 接受血清检测的97人中,华支睾吸虫虫卵阳性率60.8%,CsCAA-ELISA阳性率75.3%,rCsCP-ELISA阳性率76.3%,特异性抗体阳性率高于虫卵阳性率(P<0.05),不同抗原ELISA阳性率差异无统计学意义(P>0.05);CsCAA-ELISA、rCsCP- ELISA结果与粪检结果的符合率分别为56.7%和55.7%,两种抗原ELISA结果的符合率为82.5%.59例粪检阳性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率均为76.3%,38例粪检阴性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率分别为73.7%和76.3%. 结论 以rCsCP为包被抗原,用ELISA检测华支睾吸虫病流行区人群血清特异性IgG抗体与使用CsCAA的检测结果有较高的符合率,但同样不能区分现症与既往感染.     

两种方法纯化的抗体筛选华支睾吸虫模拟抗原表位的比较

目的比较用不同方法纯化的IgG从噬菌体随机12肽库中筛选出的华支睾吸虫模拟抗原表位。方法用饱和硫酸铵沉淀法和饱和硫酸铵沉淀法加层析法(两步法)纯化提纯的华支睾吸虫病患者血清IgG筛选华支睾吸虫模拟抗原表位,扩增随机挑取噬菌斑并进行序列分析和免疫学鉴定。结果硫酸铵沉淀法纯化IgG筛选的20个噬菌体克隆,6个有不同的DNA插入序列,Western blot显示6个克隆均可与华支睾吸虫患者血清反应,斑点免疫金银染色法有3个克隆可被华支睾吸虫患者血清识别。两步法纯化IgG筛选的20个噬菌体克隆,9个有DNA插入序列,其中有2个序列相同;Western blot和斑点免疫金银染色法显示9个克隆均可与华支睾吸虫患者血清反应。结论两种方法纯化的IgG均筛选到了可与华支睾吸虫患者血清结合的模拟抗原表位,用两步法纯化IgG筛选的模拟抗原表位更具有潜在的诊断价值。     

不同抗原的免疫学方法诊断华支睾吸虫病的实验观察

近来有人将纯化抗原应用于华支睾吸虫病的诊断,取得了较满意的结果。我们进一步应用硫酸铵分段沉淀华支睾吸虫不同抗原,进行酶联免疫吸附试验及皮内试验,以评价其应用阶值,报道如如下。一、材料与方法(一)华支睾吸虫抗原1.粗提抗原:自人工感染华支睾吸虫囊蚴的猫肝脏中取华支睾吸虫成虫200余条。以生理盐水洗     

亲和层析法纯化华支睾吸虫抗原的研究

目的 探索华支睾吸虫特异性抗原的纯化方法。方法从华支睾吸虫病流行区的淡水鱼中分离华支睾吸虫囊蚴，接种动物，收集成虫，制备匀浆液（粗抗原），借助偶联华支睾吸虫病人血清抗体的Sepharose4B亲和层析柱，提取特异性抗原，用浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（CG-PAGE）和免疫印迹方法鉴定纯化抗原的纯度和特异性。结果亲和层析法纯化抗原经CGPAGE显示5条蛋白带，免疫印迹试验鉴定均有抗原性，强阳性带蛋白分子质量单位为31ku，各区带蛋白与并殖吸虫、血吸虫血清抗体无交叉反应。粗抗原有16条蛋白带。结论经亲和层析法纯化的华支睾吸虫抗原特异性高。亲合层析是获取华支睾吸虫诊断用抗原的较佳方法。     

华支睾吸虫天然蛋白的纯化及其在免疫诊断中应用

已从华支睾吸虫粗抗原中纯化获得多种纯化抗原,其中部分纯化抗原已初步应用于华支睾吸虫病免疫诊断。本文就华支睾吸虫纯化抗原的纯化方法、免疫诊断效果及应用前景作一综述。     

免疫金电转移印斑技术检测华支睾吸虫病人血清抗体

我们应用电转移印斑结合免疫金技术,进行了华支睾吸虫病人血清中抗体的研究,以寻找一个敏感、特异的华支睾吸虫病免疫诊断方法。一、材料和方法 (一)抗原的制备自人工感染华支睾吸虫囊蚴的猫肝中取华支睾吸虫成虫100条,以生理盐水洗涤数次.超声粉碎100w,10min,4℃冰箱冷浸72h,5000r/min离心15min,取上清液。 (二)实验血清1.华支睾吸虫病人血清:采自山东金乡县及宁阳县,经粪便检查,华支睾吸虫虫卵阳性     

华支睾吸虫成虫14～33 ku抗原诊断价值的研究

目的探讨纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原在华支睾吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法使用SDS-PAGE和电洗提法,从可溶性华支睾吸虫成虫抗原中分离纯化14~33 ku抗原,用此抗原经ELISA方法检测华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、日本血吸虫病、姜片虫病患者血清及健康人血清特异性IgG抗体,并与粗制可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA结果相比较。结果检测63例华支睾吸虫病患者血清,纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原ELISA阳性率为76.2%,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA阳性率均为100%;检测25例卫氏并殖吸虫病、85例日本血吸虫病、27例姜片虫病患者血清,14~33 ku抗原的ELISA交叉反应阳性率分别为8.0%、3.5%、0,而可溶性成虫抗原分别为80.0%、62.4%、14.8%,可溶性成虫脱脂抗原分别为64.0%、55.3%、7.4%;检测127例健康人血清,14~33 ku抗原的ELISA假阳性率为0,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原的假阳性率分别为5.5%、3.1%。结论纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原用于华支睾吸虫病免疫诊断的特异性优于粗抗原,但敏感性较低。     

斑点金免疫渗滤法检测华支睾吸虫病患者血清抗体的研究

目的　建立一种检测华支睾吸虫病血清抗体的简便、快速、敏感和特异的新方法。方法　以华支睾吸虫成虫抗原为包被抗原 ,金标记葡萄球菌A蛋白 (SPA)为显色剂 ,建立检测华支睾吸虫病患者血清抗体的斑点金免疫渗滤法 (DIGFA) ;并以dot ELISA作平行对照。结果　DIGFA和dot ELISA分别检测 119例华支睾吸虫病患者血清抗体 ,其阳性率分别为 96 6 %和 92 4% ,两法差异无显著性。DIGFA分别检测正常人血清 40例、囊虫病患者血清 2 0例、日本血吸虫病患者血清 2 5例 ,前者均为阴性 ,后两者的交叉反应率分别为 5 %和 4%。DIGFA与dot ELISA两法的符合率达 90 9%。结论　DIGFA的敏感性和特异性与dot ELISA相近 ,且具简便、快速及不需特殊设备等优点 ,是一种检测华支睾吸虫病患者血清抗体的新方法。     

ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG_4的诊断价值

目的　探讨用ELISA检测华支睾吸虫病患者血清中特异性IgG4 的诊断价值。　方法　用华支睾吸虫成虫可溶性抗原进行ELISA分别检测华支睾吸虫病患者 (76例 )血清中的特异性IgG和IgG4 抗体及日本血吸虫病、并殖吸虫病、囊尾蚴病患者 (分别为 63、3 5、41例 )和健康者 (65人 )血清中的交叉抗体。　结果　检测 76例华支睾吸虫病患者血清中IgG4 的检出率为 93 .42 % ,检测 65例健康者血清中的IgG4 均为阴性 ,分别与检测IgG结果比较差异均无显著性意义 (P均 >0 .0 5 ) ;与其它寄生虫病的交叉反应率 ,IgG4 显著低于IgG ;诊断效率及阳性、阴性预告值分别为 96.45 %、10 0 %和 92 .85 %。　结论　用ELISA检测华支睾吸虫病患者血清中特异性IgG4 具有较高的诊断应用价值。     

重组抗原应用于SPG-ELISA检测华支睾吸虫循环抗体的效果评价

目的评价重组抗原用于SPG-ELISA诊断华支睾吸虫感染的价值。方法分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（Cs-CysB）与华支睾吸虫成虫可溶性抗原（CAA）,以SPG-ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG,比较两种抗原包被SPG-ELISA方法的敏感性与特异性。结果检测50份华支睾吸虫感染者血清,重组Cs-CysB与CAA包被的SPG-ELISA阳性率均为94.00%,健康人血清50例均为阴性;检测日本血吸虫病血清20份、并殖吸虫病血清20份、囊虫病血清10份,交叉反应率分别为5.00%、10.00%、20.00%和5.00%、0、20.00%。结论以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性,检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因表达与在ELISA诊断上的应用研究

目的 探讨重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫病血清学诊断上的应用价值。方法 以成虫cDNA为模板PCR扩增GenBank中一个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(No．AF093242，简称CysB)的部分基因片段，亚克隆到pTrcHis表达载体，转化入大肠埃希菌DH5α。表达出的重组蛋白经亲合层析纯化后用于ELISA检测华支睾吸虫及其他寄生虫感染血清，评价其诊断应用价值。结果 成功克隆与表达CysB基因片段，纯化后的重组蛋白用于华支睾吸虫病诊断的敏感性达96．0％(48／50)，与其他寄生虫病的总交叉反应为3．8％(1／26)，而对比实验中可溶性粗抗原(CAA)用于检测的敏感性为88．0％(44／50)．与其他寄生虫感染血清无交叉反应。结论 重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)用于ELISA诊断技术具有较高的敏感性及特异性，有希望成为可溶性粗抗原的替代之一。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因表达与在ELISA诊断上的应用研究

目的探讨重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫病血清学诊断上的应用价值. 方法以成虫cDNA为模板PCR扩增GenBank中一个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(No. AF093242,简称CysB)的部分基因片段,亚克隆到pTrcHis表达载体,转化入大肠埃希菌DH5α.表达出的重组蛋白经亲合层析纯化后用于ELISA检测华支睾吸虫及其他寄生虫感染血清,评价其诊断应用价值. 结果成功克隆与表达CysB基因片段,纯化后的重组蛋白用于华支睾吸虫病诊断的敏感性达96.0%(48/50),与其他寄生虫病的总交叉反应为3.8%(1/26),而对比实验中可溶性粗抗原(CAA)用于检测的敏感性为88.0%(44/50),与其他寄生虫感染血清无交叉反应. 结论重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)用于ELISA诊断技术具有较高的敏感性及特异性,有希望成为可溶性粗抗原的替代之一.     

华支睾吸虫病金标诊断试剂盒的研制和现场初步实验

目的　研制华支睾吸虫病金标快速免疫诊断试剂盒 ,评价其敏感性、特异性和现场试用效果。　方法　以华支睾吸虫成虫水溶性抗原、分泌排泄抗原和重组抗原磷酸甘油酸激酶 (PGK)作为诊断试剂 ,制备胶体金免疫层析检测 (Im-munochromatography test,ICT)试剂盒 ,检测患者血清和唾液中抗华支睾吸虫 Ig G,并与常规 EL ISA血清学检测方法和粪便虫卵检查法相比较。　结果　实验室检测临床确诊的华支睾吸虫病人血清中特异的 Ig G,3种抗原的敏感性均为10 0 %。天然抗原除与慢性血吸虫病人血清有较强的交叉反应外 ,与囊虫、包虫、弓形虫病人血清没有交叉反应。重组PGK抗原同慢性血吸虫病人血清也没有交叉反应。用分泌排泄抗原制备的 ICT检测试剂盒在流行区现场检测被调查者的血清和唾液 ,总符合率为 92 .31% ;ICT与 EL ISA血清检测的总符合率为 81.5 4 %。现场获取了 9人的粪便样本 ,其中 4人检出华支睾吸虫卵 ,其血清 ICT和 EL ISA检测均呈强阳性 ,另外未检出虫卵的 5人中 ,1人血清 ICT和 EL ISA均呈阳性 ,另 1人仅血清 EL ISA呈弱阳性。　结论　诊断华支睾吸虫感染的 ICT抗体检测技术 ,尤其是无创性唾液检测技术 ,简便、快速、准确、安全 ,优于血清 EL ISA检测和粪便虫卵检测 ,适用于临床检验和现场大规模流行病     

卫氏并殖吸虫TPx基因的克隆、表达和免疫学诊断价值

目的免疫筛选卫氏并殖吸虫成虫c DNA表达文库,克隆并表达卫氏并殖吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx),初步评价其免疫诊断价值。方法用卫氏并殖吸虫病患者的混合血清筛选卫氏并殖吸虫成虫λZAP c DNA表达文库,取阳性噬菌体进行克隆、测序和序列比对分析。将TPx基因全长片段和前端截短片段分别克隆至原核表达质粒pET28a (+)中,构建r Pw TPx (全长型)和r Pw TPx1 (截短型)表达载体。构建的重组蛋白经1 mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。使用蛋白抽提剂、溶菌酶和核酸酶裂解表达细菌,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化r Pw TPx和r Pw TPx1, SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。以r Pw TPx、r Pw TPx1和粗抗原作为检测抗原,间接ELISA法检测36份卫氏并殖吸虫病、 15份华支睾吸虫病、 15份日本血吸虫病、 15份片形吸虫病和15份猪囊尾蚴病的患者血清,以及36份健康人血清,评价该重组蛋白的免疫诊断价值。以健康人血清对照组的平均值加上4个标准差作为阳性判断值。所有数据均采用SAS 9.2软件进行统计学分析。结果克隆的卫氏并殖吸虫TPx基因,经原核表达、纯化,获得其可溶性重组蛋白r Pw TPx和r Pw TPx1,相对分子质量(Mr)分别为25 000和22 000。以r Pw TPx作为检测抗原的ELISA检测结果显示,卫氏并殖吸虫病患者、健康者、华支睾吸虫病患者、日本血吸虫病患者、片形吸虫病患者和猪囊尾蚴病患者血清组的吸光度(A450值)分别为0.150±0.092、 0.036±0.014、 0.043±0.019、 0.047±0.013、 0.060±0.022和0.048±0.021。卫氏并殖吸虫病患者血清阳性率为58.3%(21/36), 36份健康人血清、 15份华支睾吸虫病患者血清、 15份日本血吸虫病患者血清、 15份猪囊尾蚴病患者血清均未检出阳性,15份片形吸虫病患者血清假阳性为2/15。以r Pw TPx1作为检测抗原ELISA检测结果则为0.144±0.092、 0.022±0.009、 0.027±0.015、 0.033±0.022、 0.036±0.015和0.032±0.018。卫氏并殖吸虫病患者血清阳性率为88.9%(32/36),健康人血清未检出阳性,15份华支睾吸虫病患者血清仅1份存在交叉反应,15份日本血吸虫病患者血清假阳性为3份,15份片形吸虫病患者和15份猪囊尾蚴病患者血清假阳性均为2份。重组蛋白r Pw TPx的ELISA检测敏感性为58.3%,特异性为97.9%,总符合率为87.1%;r Pw TPx1则分别为88.9%、 91.7%、 90.9%。r Pw TPx1敏感性高于r Pw TPx (P <0.05)。以成虫粗抗原为检测抗原的ELISA检测结果显示,36份健康者血清A450值为0.012,标准差为0.006。敏感性为100%,特异性为83.3%,总符合率为87.9%,与r Pw TPx-ELISA和r Pw TPx1-ELISA检测的总符合率差异无统计学意义(P> 0.05)。结论筛选并克隆了卫氏并殖吸虫TPx基因,表达并纯化全长型和截短型两种重组TPx抗原,构建的全长型和截短型重组TPx抗原作为人体卫氏并殖吸虫病的免疫诊断抗原具有一定的诊断意义。     

华支睾吸虫病金标诊断试剂盒的研制和现场初步实验

目的 研制华支睾吸虫病金标快速免疫诊断试剂盒，评价其敏感性、特异性和现场试用效果。方法 以华支睾吸虫成虫水溶性抗原、分泌排泄抗原和重组抗原磷酸甘油酸激酶(PGK)作为诊断试剂，制备胶体金免疫层析检测(Immunochromatography test，ICT)试剂盒，检测患者血清和唾液中抗华支睾吸虫IgG，并与常规ELISA血清学检测方法和粪便虫卵检查法相比较。结果 实验室检测临床确诊的华支睾吸虫病人血清中特异的IgG，3种抗原的敏感性均为100％。天然抗原除与慢性血吸虫病人血清有较强的交叉反应外，与囊虫、包虫、弓形虫病人血清没有交叉反应。重组PGK抗原同慢性血吸虫病人血清也没有交叉反应。用分泌排泄抗原制备的ICT检测试剂盒在流行区现场检测被调查者的血清和唾液，总符合率为92．31％；ICT与ELISA血清检测的总符合率为81．54％。现场获取了9人的粪便样本，其中4人检出华支睾吸虫卵，其血清ICT和ELISA检测均呈强阳性，另外未检出虫卵的5人中，1人血清ICT和ELISA均呈阳性，另1人仅血清ELISA呈弱阳性。结论 诊断华支睾吸虫感染的ICT抗体检测技术，尤其是无创性唾液检测技术，简便、快速、准确、安全，优于血清ELISA检测和粪便虫卵检测，适用于临床检验和现场大规模流行病学调查。     

华支睾吸虫的器官特异性抗原

随着群众依从性的下降,进行华支睾吸虫病的病原学诊断—粪便检查日益困难。为控制华支睾吸虫病的流行,进行人群筛查十分必要,且血清学诊断正快速地取代病原学检查。该研究的目的在于通过对华支睾吸虫的一些器官的蛋白进行分析,以获得特异性的抗原蛋白。从自然感染华支睾吸虫的淡水鱼获取的囊尾蚴,经口感染兔,8周后解剖获取成虫。解剖并收集华支睾吸虫的睾丸、储精囊、卵黄腺、子宫以及肠道液体。整个虫体或分离的器官分别搅匀并离心,上清液作为粗抗原或单一器官抗原。将100条活的华支睾吸虫在PBS中饲养并收集排泄-分泌抗原。分别对获取的…     

华支睾吸虫未脱脂和脱脂成虫抗原的免疫印迹分析

目的 寻找华支睾吸虫成虫抗原中具有特异性诊断价值的抗原组分。方法 应用SDS—PAGE和Westernblot分析华支睾吸虫成虫未脱脂、脱脂的可溶性抗原蛋白组分的血清学反应特征。结果 未脱脂成虫抗原有14条蛋白带可与华支睾吸虫病病人血清反应，其中分子质量单位为180、170、100、67、41、37、35、32、26ku是主带，180、170、37、35ku条带还可与日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病病人血清发生交叉反应。脱脂成虫抗原有10条蛋白带可与华支睾吸虫病病人血清反应，其中分子质量单位为180、100、67、37、35、24、20ku是主带，此外，180ku带可与日本血吸虫病和卫氏并殖吸虫病病人血清发生交叉反应，78ku带可以与血吸虫病病人血清发生交叉反应。结论 华支睾吸虫成虫抗原经脱脂处理后可减少与日本血吸虫病和卫氏并殖吸虫病病人血清交叉反应的蛋白组分数量。华支睾吸虫未脱脂和脱脂成虫抗原中主要的特异性抗原组分分别是100、67、41、32、26ku和100、67、37、35、24、20ku，这些组分抗原可用于华支睾吸虫病的免疫诊断。