重组幽门螺杆菌多表位疫苗工程菌株的构建及其微生物学特性研究

目的 构建含有幽门螺杆菌尿素酶（\ureI、ureB）及霍乱毒素B亚单位（\ctB）融合片段的多表位疫苗工程菌,并研究其微生物学特性。方法 通过生物信息学方法从\ureI、ureB基因中筛选出T细胞和B细胞优势表位,通过柔性Linker相连,并在其N端加入分子内佐剂序列\ctB,按照大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏好性进行密码子优化,即为BIB序列。人工合成之后,插入原核表达质粒pET28a(+)中,构建pET28a(+)/\ctB-ureI-ureB〔pET28a(+)/BIB〕重组质粒。经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序鉴定正确后,将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。BIB工程菌经乳糖诱导表达后,SDS-PAGE检测重组蛋白BIB的表达情况,并对其N端氨基酸序列和相对分子质量进行测定,Western blot对其进行抗原性鉴定。结果 原核表达质粒pET28a(+)/BIB经双酶切和测序鉴定构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量33×10^\3处有一条明显条带,其N端氨基酸序列和相对分子质量与设计序列100%一致,Western blot结果显示BIB可以与抗幽门螺杆菌悉尼株（SS1株）小鼠血清及鼠抗CTB单抗产生特异性反应。结论 成功构建了幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌,该工程菌表达的BIB蛋白抗原性良好。     

幽门螺杆菌双基因多表位重组原核表达工程菌的构建及其表达特性的研究

目的构建含幽门螺杆菌尿素酶保守基因序列ureI和ureB的双基因（简称IB）多表位原核表达质粒以及原核表达T程菌,并研究其微生物学特性。方法通过生物信息学方法从ureI和ureB基凶中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成所选择的表位基因序列并构建原核重组表达质粒pET28a（＋）／IB。经限制性内切酶（EcoR I,XhoI）鉴定及DNA测序鉴定后,将重组质粒导人大肠杆菌BL21（DE3）。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（riB）的表达情况,用Westernblot检测riB的免疫反应性。结果构建的双基因多表位基因序列与所设计的一致;工程菌经IPTG诱导后做SDS-PAGE电泳显示,在28kD左右有一条明显蛋白条带,Westernblot结果显示在28kD左右出现特异反应条带。结论成功构建含ureI和ureB双基因序列的原核表达质粒pET28a（＋）／IB及工程菌,该工程菌表达的重组蛋白riB能被抗幽门螺杆菌悉尼株（H．pylori SSl）的特异抗体所识别,表明该新重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

脑源性神经营养因子原核表达载体的构建及其生物学活性分析

目的：构建含有脑源性神经营养因子（BDNF）的原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后研究其生物学活性。方法按照大肠杆菌BL21（DE3）的密码子偏好性进行密码子优化,人工合成大鼠BDNF的基因序列并构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF。经限制性内切酶（Bam HI ,Hind Ⅲ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,用SDS‐PAGE检测重组蛋白的表达情况,以BDNF特异性抗体采用Western blot法鉴定BDNF蛋白抗原性,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测BDNF蛋白对 PC12细胞活力的影响。结果构建的pET28a（＋）／BDNF经双酶切和测序鉴定与设计序列100％一致;工程菌经IPTG诱导后在相对分子质量17×103左右有1条明显蛋白条带,Western blot显示目的蛋白能够与特异性BDNF抗体反应;不同浓度BDNF蛋白处理组与对照组比较细胞活力均有不同程度的增加,其中50 ng／mL BDNF处理组效果最优。结论成功构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,该工程菌表达的BDNF蛋白具有良好的生物学活性。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）截短C基因和前S1基因重组原核表达质粒,获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析．方法：PCR扩增获得截短C基因片段和前S1基因,双酶切后克隆至原核表达质粒pET28a,转化E．coli DH5α,酶切鉴定得阳性重组质粒pET28a并测序;然后转化E．coli B121,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成;可溶性分析后用Ni^2＋ -NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白,Westem Blot分析特异性和抗原性．结果：成功构建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表达质粒pET28a—Ct—preS1,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni^2＋ -NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性．结论：HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化,为研究新型乙肝疫苗奠定了基础．     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST的构建及其表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28a-Sj26GST,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET28a中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为36×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的26%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28d-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

CEA的多表位疫苗基因的设计及构建的表达载体在原核表达系统中的表达

目的 本研究设计肿瘤相关抗原CEA的多表位疫苗基因和构建的重组表达载体在原核表达系统中成功表达融合蛋白.方法 根据预测分析得到的表位氨基酸序列,选取预测分值较高的CTL表位(IMIGVLVGV)和B细胞表位(SNNSKPVEDK),并结合“非选择性”辅助T细胞表位(AKFVAAWTLKAAA)串联起来,按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化,委托生物技术公司合成寡核苷酸,退火获得目的基因,并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内.将此重组载体转化E.coli BL21(DE3)表达融合蛋白,并经SDS-PAGE、Western blot分析鉴定.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表位融合蛋白ozlf-86/87.结果 嵌合有多表位目的基因的原核重组质粒pET32a(+)/ozlf-86/87,进行酶切和测序鉴定,构建成功.SDS-PAGE分析表明,重组质粒在37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h能很好地表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为20kDa,与预期Mr大小吻合;蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20％.,并经Western blot鉴定为目的蛋白.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化成功获得表位融合蛋白,即ozlf-86/87,纯度达到90％以上.结论 本研究获得的多表位融合蛋白对胃肠道恶性肿瘤诊断试剂的研究和进一步的疫苗研究奠定了基础.     

人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法：根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果：酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论：成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。     

水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达

目的:构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂(leech derived tryptase inhibitor,LDTI)原核表达载体,并在大肠埃希菌[BL21(DE3)]中高效表达重组蛋白。方法:以含有目的核酸序列的质粒为模板,通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列,构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pET28a-LDTI重组质粒亚克隆,进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析,然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导,以Tricine-SDS-PAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达。结果:成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28a-LDTI,并获得相应的融合蛋白;本实验证明,LDTI在大肠埃希菌工程菌中高效表达,在温度为33℃,IPTG浓度为0.7 mmol,诱导时间为1 h,所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右。结论:成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达,为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础。     

梅毒螺旋体重复蛋白K的克隆表达

目的体外克隆并表达梅毒螺旋体重复蛋白K，为制备预防性疫苗奠定基础。方法利用PCR反应及基因重组技术，扩增重复蛋白K编码基因，构建重组质粒pET28b（＋）／TprK，IPTG诱导表达。结果PCR法扩增出了1350bp的目的片段，原核表达质粒pET28b（＋）／TprK酶切鉴定正确，测序结果与Gengbank上公布的该基因序列完全一致，并可在大肠杆菌中高效表达。结论成功构建人pET28b（＋）／TprK原核表达载体，并能高效表达TprK蛋白，为梅毒的预防性疫苗的制备以及进一步研究其血清学诊断试剂奠定了基础。     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

乙型肝炎核心抗原基因的合成及其原核表达载体的构建

目的:合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因并构建原核表达载体.方法:根据大肠杆菌偏嗜性密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条相互重叠的寡核苷酸片段,采用PCR法扩增获得完整的HBcAg基因,经BamH I和Xho I双酶切后定向克隆到pET30a(+),得pET30a(≠)-HB-cAg,经PCR扩增、酶切及测序鉴定后,定点突变法改正错误位点.之后将重组子转入BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western Blot检测蛋白抗原性.结果:成功构建了重组质粒pET30a(≠)-HBcAg,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌表达,表达效率64%左右;Wesbern Blot显示表达产物具有较好的抗原性.结论:成功合成HBcAg基因并构建了原核表达载体.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的 克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论 成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。     

蓝氏贾第鞭毛虫甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因的克隆、表达与纯化

目的 蓝氏贾第鞭毛虫（简称为贾第虫）甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因（GlMSR）,进行原核表达获得其重组蛋白。方法 依据GenBank中GlMSR序列设计引物,以贾第虫中国C2 克隆株基因组DNA 为模板,通过PCR扩增编码序列,将所得片段连接至质粒pET28a以构建原核表达载体pET28a-GlMSR,将pET28a-GlMSR导入大肠杆菌E.coli JM109并挑取阳性克隆进行基因测序和鉴定。用化学方法将经测序验证的重组质粒pET28a-GlMSR转化至E.coli BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白表达结果。收集沉淀中的重组表达产物,镍柱亲和层析纯化带组氨酸标签的重组蛋白,并通过免疫印迹鉴定纯化结果。结果 电泳结果显示在约624 bp处出现目的DNA条带,表明成功得到GlMSR编码序列;PCR 鉴定、酶切鉴定以及基因测序结果表明成功构建重组表达载体pET28a-GlMSR,经IPTG诱导后在沉淀中获得目的蛋白,目的蛋白分子量（Mr）约为25 000,与预期分子量（Mr）22 800基本相符。经Western blot分析显示该重组蛋白含有His6标签。结论 本研究克隆、表达了蓝氏贾第虫GlMSR基因,并纯化获得重组蛋白,为进一步探索该酶的功能奠定了基础。     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。     

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及应用研究

目的在原核系统中表达全长HIV-1p24抗原,对其抗原性进行鉴定,探讨其对HIV早期诊断的价值。方法利用PCR技术从含有HIV-1gag基因质粒PTM-1中扩增p24蛋白基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,表达p24抗原。通过ELISA和Westernblotting（WB）法检测表达产物的免疫反应活性及特异性。结果PCR产物和构建的重组质粒pET28a—p24经双酶切均显示约690bpDNA片段,与预期p24抗原全基因片段大小-致。SDS—PAGE电泳可见纯化蛋白为1条相对分子量约26x10,Mr的外源表达蛋白带,与预期大小-致。ELISA及WB实验证实表达的p24抗原具有较好的活性及特异性。时间分辨荧光免疫双抗体夹心法显示与市售p24抗原线性-致。结论构建了HIV-1p24／pET28a原核高效表达系统,表达产物与市售的p24抗原具有相似的抗原性。