ptsA58H质粒转化人胚腱细胞的生物学特性研究

目的 研究经ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒转染的转化人胚腱细胞的生物学特性及致瘤性。方法 体外培养转化人胚腱细胞，对细胞进行形态学、超微结构及一般特征的观察。绘制细胞生长曲线，平板克隆实验检测克隆形成率，软琼脂培养，植入鼠体内观察有无致瘤性，Ｂｒｄｕ标记细胞，检测细胞植入体内的转归及细胞的分泌功能。结果 转化人胚腱细胞能４长期传代，增殖能力强，在软琼脂中不生长，接种裸鼠不致瘤。且在裸鼠体内细胞存活，增殖能力旺     

ptsA58H质粒体外转染人胚肌腱细胞生长特性的研究

目的 探讨电穿孔法将ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒体外转染人胚肌腱细胞（ＨＥＴＣ）的条件，转化人胚肌腱细胞（ＴＨＥＴＣ）体外培养的生长特性。方法 体外分离培养ＨＥＴＣ，电穿孔法导入ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒，并经潮霉素Ｂ筛选，获得阳性克隆，扩增后建立ＴＨＥＴＣ系。体外传代培养，冻存，复苏ＴＨＥＴＣ，并分别绘制ＨＥＴＣ和ＴＨＥＴＣ在不同培养条件的生长曲线。结果 通过潮霉素Ｂ０￣１０００ｍｇ／Ｌ终冻度梯度的培养，选择２０     

人胚腱细胞体外培养及生物学特性研究

应用显微外科手术剥除人胚肌腱外膜组织外，经过胰蛋白酶及胶原酶分步消化分离出人胚腱细胞，使用含２０％新生小牛血清的Ｆ－１２培养液将其传代培养１５代后全部冻存。该细胞贴壁生长，具有接触抑制的性质。细胞群体倍增时间大致为４天与细胞有丝分裂高峰时间相符。在传代培养过程中探索了体外培养的腱细胞生长的最适宜条件。通过冻存后复苏的细胞继续培养发现，冻存对其生长、形态、遗传学等特征无明显影响。本研究测定了培养细胞     

原代人胚成肌细胞体外培养增殖及分化特性

目的 分离培养人胚胎成肌细胞,观察原代细胞体外增殖与分化特性。方法 选择健康妇女损赠的胎儿骨骼肌标本,参照Blau等的胰蛋白酶与胶原酶混合、多步消化法分离成肌细胞。经美速贴壁法纯化后,在含20％胎牛血清的生长培养基中培养,以生长曲线评价及其增殖情况;含5％胎牛血清的融合培养基中培养,以磷酸肌酸激酶－MM型合成量及成肌细胞融合率评价及其分化能力。通过光镜、透射电镜、免疫细胞化学方法（小鼠抗人肌球蛋白单克隆抗体）鉴定所得细胞。结果 电镜下可见所得细胞含大量游离核糖体,肌球蛋白免疫细胞化学染色强阳性,能合成磷酸肌酸激酶,能融合形成肌小管,证明其为骨骼肌成肌细胞。在生长培养基中原代细胞倍增时间为4．8天,在融合培养基作用下,肌小管融合率及磷酸肌酸激酶合成量明显增加。结论 多步酶消化法与差速贴壁法能获得足量、纯净成肌细胞,所得细胞增殖能力强,能表达骨骼肌特异的收缩蛋白;融合培养基能促进其体外分化。     

SV40与细胞永生化

目的 探讨ＳＶ４０如何介导细胞永生化,与细胞永生化现象相关的因素及它们的作用。方法 复习近十年来有关细胞永生化与复制衰老现象研究的文章,对ＳＶ４０介导的细胞永生化及其相关因素进行综述。结果 细胞永生化涉及病毒ＤＮＡ的整合,端粒酶的活化,生长抑制因子的失活等多方面的因素,它们的作用机制密切相关。结论 细胞永生化的研究有助于更广义地理解细胞生物学现象,并可作为标准细胞在细胞工程及组织工程的研究中发挥作     

人胚肋软骨静止区细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:研究体外培养的人胚肋软骨静止区细胞的生物学特性及分化规律,为组织工程生长板的研究提供种子细胞.方法:采用Ⅱ型胶原酶消化的方法获取人胚肋软骨静止区细胞,观察细胞形态学变化;测定细胞生长曲线;借助特殊染色、免疫荧光染色的方法了解糖胺聚糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原酶的合成情况.结果:贴壁后细胞呈多角形,从第6代开始绝大多数细胞转变为成纤维细胞状,细胞培养至第2代开始分泌大量Ⅱ型胶原.结论:体外单层培养的人胚肋软骨静止区细胞具有正常的生长增殖与分化能力,可分化至成熟期软骨细胞.     

转化人胚腱细胞致瘤性实验研究

目的研究用SV40温度依赖株质粒ptsA58H转化人胚腱细胞是否具有致瘤性。方法采用不同梯度细胞密度(5×10     

人端粒酶逆转录酶真核表达质粒转染人成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

目的　　分析人端粒酶逆转录酶 (h TERT)真核表达质粒 p GRN14 5转染人成纤维细胞的生物学特性。方法　体外分离培养小儿包皮成纤维细胞 ,脂质体法将构建的 p GRN14 5转染人成纤维细胞 ,经潮霉素 B筛选 ,扩增培养阳性克隆。 RT- PCR法、TRAP- PCR法分析细胞端粒酶活性。流式细胞术检测细胞增殖周期及细胞凋亡率 ,对转染后细胞行染色体核型分析及免疫组织化学法检测胶原分泌能力。结果　转染后培养的人成纤维细胞形态与转染前相比无明显改变 ,转染细胞稳定地表达端粒酶活性 ,流式细胞术分析转染前后成纤维细胞的增殖周期无明显改变 ,细胞凋亡率较转染前降低。经 p GRN14 5转染的人成纤维细胞保持正常的二倍体核型 ,具有正常分泌 、 型胶原的能力。结论　 p GRN14 5转染的人成纤维细胞稳定地表达端粒酶活性 ,细胞寿命明显延长。初步证实了用这种方法建立组织工程标准化种子细胞系的可行性     

人胚肋软骨静止区细胞的体外培养及生物学特性研究

目的：研究体外培养的人胚肋软骨静止区细胞的生物学特性及分化规律，为组织工程生长板的研究提供种子细胞。方法：采用Ⅱ型胶原酶消化的方法获取人胚肋软骨静止区细胞．观察细胞形态学变化；测定细胞生长曲线；借助特殊染色、免疫荧光染色的方法了解糖胺聚糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原酶的合成情况。结果：贴壁后细胞呈多角形，从第6代开始绝大多数细胞转变为成纤维细胞状，细胞培养至第2代开始分泌大量Ⅱ型胶原。结论：体外单层培养的人胚肋软骨静止区细胞具有正常的生长增殖与分化能力，可分化至成熟期软骨细胞。     

高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

目的 观察高表达人Salvadorl(hSav1)蛋白对人胚肾293(HEK293)细胞增殖的影响.方法 构建含有绿色荧光蛋白(GFP)的hSav1质粒GFP-N1-hSav1;将构建好的GFP-N1-hSav1质粒在脂质体Lipofectamine 2000的介导下转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察质粒转染效率;分别在转染后12、24、36、48 h通过噻唑蓝(MTT)比色法计算细胞增殖抑制率,抑制率=[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)×100%;转染后36 h加入5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU),通过其掺入比率来显示hSav1对细胞增殖的影响.结果 质粒GFP-N1-hSav1构建成功,转染效率为70%-80%左右,蛋白hSav1明显高表达;MTT结果显示转染质粒后12、24、36、48 h,高表达蛋白hSav1组的细胞增殖抑制率分别为2%、5%、15%、23%,而阴性对照分别为2%、3%、2%、2%;BrdU结果显示,在HEK293细胞中高表达蛋白hSav1后细胞增殖抑制率为(27.3±3.8)%,阴性对照组的细胞增殖抑制率为(12.9±5.3)%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在人胚肾HEK293中高表达蛋白hSav1可明显抑制细胞增殖能力.     

转化人胚肌腱细胞的体外培养及生物学特性研究

目的 研究经ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒转化的人胚肌腱细胞的生物学特性,探讨细胞生长特性与体外培养条件改变的关系,方法 取人胚肌腱细胞和经ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒转化的人胚肌腱细胞,进行体外培养,对细胞进行形态学,超微结构及一般特征的观察。在不同培养条件下进行生长曲线绘制,平板克隆实验和软琼脂培养以及免疫组织化学法胶原染色,结果 在正常培养条件下,人胚肌腱细胞和转经人胚肌腱细胞的生长性状几乎无差异,且冻存复苏并不     

重建端粒酶活性的正常人成纤维细胞的成骨潜能研究

目的　通过重建端粒酶活性延长人成纤维细胞寿命 ,并对其成骨潜能进行研究 ,为解决组织工程骨修复种子细胞老化问题提供实验依据。方法　将人端粒酶催化亚基 (h TERT)基因用电穿孔法导入正常人原代成纤维细胞 ,用 TRAP- PCR检测细胞端粒酶活性 ,用β-半乳糖苷酶活性测定评价细胞衰老情况。在此基础上用骨形成蛋白(BMP- 2 )和肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)联合诱导已重建端粒酶活性的成纤维细胞在体外培养条件下成骨 ,用四环素活体标记和茜素红染色显示钙盐结节形成。结果　转染 h TERT的人成纤维细胞能稳定表达端粒酶活性 ,培养超过 5 0代后细胞仍保持β-半乳糖苷酶阴性。经 BMP- 2和 TNF-α诱导后 ,转染后传 80代的人成纤维细胞仍可形成四环素标记和茜素红染色均为阳性的钙盐结节。结论　重建端粒酶活性、寿命延长的人成纤维细胞仍然维持了其本身所具有的成骨潜能     

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的探讨将成人骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法,并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定. 方法分离人骨髓,梯度离心并结合全骨髓法进行培养,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸.贴壁细胞传代,取第3代细胞鉴定其成骨特性;在倒置相差显微镜下观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原表达,原位杂交检测骨连接素(ON)、骨桥素(OP)表达,Von Kossa 染色检测钙结节形成. 结果第3代人MSCs呈典型的成骨细胞形态,可连续传代10次;ALP染色阳性率达85%;Ⅰ型胶原、ON和OP表达阳性;Von Kossa 染色可见钙结节形成. 结论成功地将人MSCs诱导分化为成骨细胞,所诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性.