辣椒素诱导人黑色素瘤A375-S2细胞凋亡的研究

目的研究辣椒素对人黑色素瘤A375-S2细胞凋亡的诱导作用,探讨其抗癌作用机制。方法采用噻唑蓝（MTT）法观察辣椒素对细胞生长的抑制作用,荧光显微镜下观察细胞的形态学变化,通过DNA凝胶电泳进行DNA片段化分析,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法分析DNA酶抑制剂（ICAD）蛋白的表达。结果辣椒素可诱导A375-S2细胞凋亡,呈剂量、时间依赖性。250μmol／L辣椒素处理24h,A375-S2细胞出现明娩的亚二倍体峰;处理36h,Hoechst 33258荧光染色有明显的凋亡小体出现,DNA电泳出现阶梯状图谱。在辣椒素作用下,caspase激活的ICAD蛋白表达量随时间延长而减少。结论辣椒素对A375-S2细胞的杀伤作用主要通过诱导细胞凋亡实现,降低ICAD蛋白的表达为其诱发A375-S2细胞凋亡的机制之一。     

三氧化二砷诱导恶性黑色素瘤A375和B16细胞凋亡的研究

目的: 研究不同浓度的三氧化二砷(As-2O-3)对恶性黑色素瘤人A-{375}细胞和小鼠B-{16}细胞的凋亡诱导作用,为As-2O-3治疗恶性黑色素瘤提供新的理论和实验依据.方法:用流式细胞术(FCM)检测A-{375}细胞和B-{16}细胞的凋亡诱导及杀伤作用:用不同剂量的As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}、0.25 mmol*L{-1}和0.5 mmol/L{-1}),对小鼠进行腹腔注射(10 ml*kg{-1},连续注射10 d后,检测小鼠血清与心、肝、肾有关的生化指标.结果:As-2O-3浓度分别为5 μmol*L{-1}、10 μmol*L{-1}和20 μmol*L{-1}时,A-{375}和B-{16}细胞的凋亡率分别为11.85 %、55.51 %、54.90 %和9.81 %、26.45 %、9.93 %:As-2O-3诱导A-{375}和B-{16}细胞总的凋亡和坏死率分别为11.90 %、55.71 %、57.40 %和12.96 %、26.99 %、87.13 %;不同剂量的As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}～0.5 mmol*L{-1})对小鼠肝、肾和心肌等功能无明显影响,与对照组各项指标无显著性差异(P>0.05).结论:不同浓度的As-2O-3能明显诱导恶性黑色素瘤A-{375}及B-{16}细胞凋亡和坏死,对A-{375}细胞的凋亡诱导作用强于B-{16}细胞.As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}～0.5 mmol*L{-1})对小鼠肝、肾和心肌等功能无明显损伤.     

G6PD缺陷诱发人黑色素瘤A375细胞凋亡机制研究

目的：探讨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）缺陷对A375细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法：以A375-WT和A375-G6PDΔ细胞为模型,用Real-time PCR检测G6PD mRNA表达,蛋白质印迹法检测G6PD、Bcl-2、Bcl-xL、STAT5和P-STAT5蛋白的表达,紫外分光光度法测定G6PD酶活性,Heochst 33342/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,免疫组化观察STAT5蛋白核迁移。结果：A375-WT和A375-G6PDΔ细胞中G6PD mRNA分别为0.545±0.13和0.207±0.03,降低了62.02%,t=-5.854,P=0.028;G6PD蛋白分别为0.975±0.16和0.227±0.10,降低了76.72%,t=-21.593,P=0.002;G6PD酶的比活性分别为（0.088±0.023）和（0.024±0.008）U/mg;降低了72.23%,t=-7.390,P=0.018;A375-G6PDΔ细胞的凋亡率为（8.62±1.67）%,比A375-WT细胞的（2.37±0.78）%升高了3.64倍,t=-12.163,P=0.007;A375-G6PDΔ细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量为0.245±0.037,比A375-WT细胞的0.578±0.073降低了57.61%,t=-16.021,P=0.004;Bcl-xL的表达量为0.138±0.019,比A375-WT细胞的0.287±0.067降低了51.92%,t=-5.377,P=0.033;A375-G6PDΔ细胞的P-STAT5/STAT5比值为0.72±0.201,比A375-WT细胞的2.28±0.367降低了68.4%（P=0.004）,细胞核内STAT5表达为0.051±0.012,比A375-WT细胞核的STAT5蛋白（0.093±0.018）降低了45%（P=0.007）,STAT5核迁移减少。结论：转录因子STAT5磷酸化降低、活性下降是G6PD缺陷所诱发的人黑色素瘤A375细胞凋亡的重要因素之一,为黑色素瘤发生及治疗的研究提供了新的思路。     

三氧化二砷对恶性黑色素瘤A375细胞端粒酶活性的抑制作用

背景与目的 :研究三氧化二砷(As2O3)对人恶性黑色素瘤A375 细胞端粒酶活性的抑制作用,探讨砷及其化合物治疗恶性黑色素瘤的作用机制 ,为砷及其化合物治疗恶性黑色素瘤提供新的理论和实验依据。 材料与方法 :用TRAP_ELISA和TRAP_PAGE银染法测定A375 细胞端粒酶活性。结果 :As2O3 对人恶性黑色素瘤A375 细胞端粒酶活性抑制有明显的浓度和时间依赖关系。结论 :As2O3 对恶性黑色素瘤A375 细胞端粒酶活性抑制率随药物浓度的增加或作用时间的延长而提高     

赖氨匹林诱导人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的研究

[目的]研究赖氨匹林（aspis01）对人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的诱导作用,并初步探讨其诱导A375细胞凋亡的可能机制。[方法]采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测赖氨匹林对A375细胞增殖的抑制作用：采用吖啶橙（AO）／溴化乙啶（EB）双染法进行A375细胞形态学观察：流式细胞仪（FCM）检测不同浓度的赖氨匹林诱导A375细胞的早期凋亡率：应用Westernblot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。[结果]（1）不同浓度的赖氨匹林对A375细胞均有明显的生长抑制作用,且其作用具有时间和浓度相关性（P〈0．01）。（2）AO／EB双染后可见：给药组早期凋亡细胞多于对照组．并且随着赖氨匹林浓度的增加．早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞均增多。（3）不同浓度的赖氨匹林对A375细胞作用24h后．均可诱导其发生早期凋亡．并且呈浓度相关性。（4）赖氨匹林可上调Bax蛋白的表达,下调Bel-2蛋白的表达。[结论]赖氨匹林可以抑制A375细胞的增殖,诱导其凋亡．此作用可能与调节Bax／Bcl-2蛋白的表达水平有关．     

siRNA对恶性黑色素瘤A375细胞中HOXB7基因的干涉作用研究

目的：观察靶向siRNA抑制恶性黑色素瘤细胞株A375同源盒基NHOXB7表达后．对相应生长因子bFGF表达水平及A375细胞生物学特性的影响：方法：根据HOXB7基N设计3条序列特异性的siRNA（si-HOXB7-1，si—HOXB7—2，si—HOXB7—3），在脂质体Lipofectamine2000的介导下转染A375细胞，采用RT—PCR和FCM法来观察HOXB7及bFGF的基因沉默效应：MTT法检测A375细胞体外增殖活性，结果：3条siRNA均能不同程度地下调A375细胞HOXB7表达水平，第3条序列能更有效地封闭HOXB7基因，而空转组与对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）结论：靶向HOXB7基因的siRNA可有效沉默HOXB7基因及其调控的基bFGF的表达，并控制恶性黑色素瘤细胞的生长。     

miRNA-375对胰腺癌细胞Panc-1增殖和凋亡的影响

  目的  探讨miRNA-375的外源性表达对人胰腺癌细胞Panc-1增殖和凋亡的影响。   方法  将miRNA-375表达质粒或对照质粒转染Panc-1细胞, qRT-PCR方法检测miRNA-375在转染细胞中的表达水平, 细胞计数法、流式细胞术分别检测外源性miRNA-375表达后Panc-1细胞增殖、凋亡和周期的变化情况。   结果  miRNA-375表达质粒组与对照组比较, 其miRNA-375表达诱导性升高, 细胞增殖受到抑制, 细胞凋亡率增加, 细胞周期阻滞于G₀~G₁期。   结论  在胰腺癌细胞Panc-1中增加miRNA-375的表达, 可抑制细胞增殖, 促进细胞凋亡和细胞周期阻滞, miRNA-375在胰腺癌细胞Panc-1中可能发挥潜在的抑癌基因作用。      

沉默ERK增强A375黑素瘤细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性

目的:探讨直接抑制细胞外信号调节激酶(extra cellular signal-regulated kinase,ERK)表达后,对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)对黑素瘤细胞杀伤作用的影响及其作用机制.方法:用携带ERK特异或对照shRNA的慢病毒感染A375黑素瘤细胞,48 h后加入终浓度为100 μg/ml基因重组TRAIL蛋白继续培养6h,收获细胞,碘化丙啶染色,用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡和TRAIL受体的表达;Western blotting检测相关蛋白的表达水平.结果:亚型特异的ERK shRNA分别沉默ERK1或ERK2,导致A375细胞出现G1期阻滞(对照shRNA组的G1期细胞比例为71％,ERK1、ERK2、ERK1 +2 shRNA组分别增加到85％、90％和81％,P＜0.01);S期细胞从对照组的11％减少到2％左右(P＜0.001)、G2/M期细胞也从对照组的17％减少到3％(P＜0.01).细胞周期改变伴有P21、P27蛋白上调和Cyclin D1蛋白降低,但未见明显的细胞凋亡.经对照shRNA和TRAIL处理的细胞,仅有15％的凋亡率,而ERK shRNA和TRAIL联合处理则使凋亡率达到40％ ～60％ (P＜0.01).抑制ERK蛋白表达能显著上调细胞表面TRAIL受体DR4的表达(从对照组32％增加到75％～80％,P＜0.01),但DR5变化不明显.ERK抑制还明显降低A375细胞的葡萄糖转运受体1(Glut 1)和己糖激酶Ⅱ(HK-Ⅱ)的蛋白表达水平.结论:直接抑制ERK不仅可以抑制肿瘤细胞周期的进展,而且可以增强TRAIL对A375黑素瘤细胞的杀伤作用,其机制与上调细胞表面DR4的表达和干扰肿瘤细胞糖代谢有关.     

加热处理后人黑色素瘤A375细胞对NK和DC细胞免疫活性的影响

目的： 研究经加热处理的人黑色素瘤细胞A375对外周血单个核细胞来源的自然杀伤(NK)细胞及树突状细胞(DC)免疫活性的影响并探讨其作用机制。方法：体外培养人外周血单个核细胞来源的NK和DC细胞,并使其与43 ℃水浴加热后的A375细胞共孵育24 h。应用CCK-8法测定加热和非加热组效靶比(NK∶DC∶A375)分别为1∶2∶1、3∶6∶1、6∶12∶1时NK/DC细胞的杀伤率;应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上述各效靶比组NK细胞培养液中γ-干扰素(γ-INF)的释放情况。结果：在每个效靶比,与非加热组比较,加热组NK/DC的杀伤率均明显提高(P<0.05),且其杀伤率随NK/DC细胞的浓度升高而升高(P<0.05)。在加热组和非加热组,含有DC较不含DC组杀伤率均明显提高(P<0.05)。加热组NK细胞γ-INF释放均较非加热组明显增加(P<0.05)。结论：经加热处理后的黑色素瘤细胞A375能够刺激NK细胞分泌更多的γ-INF,明显提高NK细胞的杀伤活性,且DC在其中起着重要作用。     

中药单体对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用及对酪氨酸酶活性的影响

目的:研究五种中药单体对人恶性黑色素瘤细胞A375体外增殖的影响和对细胞内酪氨酸酶活性的作用。方法:将具有美白功效的五种中药单体（熊果苷、丹参素、芦荟大黄素、姜黄素和丹参酮ⅡA）分别与A375细胞作用。MTT比色法观察这五种中药单体对A375细胞体外增殖的影响;多巴速率氧化法研究这些中药单体对A375细胞内酪氨酸酶活性的作用。结果:五种中药单体对A375细胞增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性（P<0.05）。熊果苷、丹参素、芦荟大黄素、姜黄素均可抑制A375细胞内酪氨酸酶的活性;且作用48 h后,高浓度的熊果苷和丹参素仍可显著抑制酪氨酸酶活性(P<0.05),而芦荟大黄素及姜黄素虽对酪氨酸酶活性仍有抑制作用,但无统计学差异。丹参酮ⅡA在不同浓度下均未检测到对酪氨酸酶活性的抑制作用。结论:五种中药单体对A375细胞增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性;一定浓度的熊果苷和丹参素对A375细胞增殖抑制的同时亦可显著抑制细胞内酪氨酸酶活性;而芦荟大黄素、姜黄素、丹参酮ⅡA对细胞内酪氨酸酶活性均未见明显抑制作用。我们推测对酪氨酸酶活性的抑制作用可能是具有美白功效的中药单体熊果苷和丹参素抑制A375细胞增殖的作用机理之一,而芦荟大黄素、姜黄素及丹参酮ⅡA可能是通过其他机制来抑制细胞增殖。     

Triptolide inhibits proliferation and induces apoptosis of human melanoma A375 cells

Triptolide, a diterpenoid obtained from Tripteryglum wilfordii Hook.f, has attracted interest for its anti- tumor activities against human tumor cell lines in recent years. This report focuses on anti-proliferative and pro-apoptotic activities in human melanoma A375 cells assessed by CCK8 assay, Hoechst 33258 staining and flow cytometry. In addition, triptolide-induced arrest in the S phase was also observed. Caspase assays showed the apoptosis induced by triptolide was caspase-dependent and probably through intrinsic apoptotic pathways. Furthermore, expression of NF-κB (p65) and its downstream factors such as Bcl-2, Bcl-XL was down-regulated. Taken together, the data indicate that triptolide inhibits A375 cells proliferation and induces apoptosis by a caspase-dependent pathway and through a NF-κB-mediated mechanism.     

Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth

Amino acids, especially leucine and glutamine, are important for tumor cell growth, survival and metabolism. A range of different transporters deliver each specific amino acid into cells, some of which are increased in cancer. These amino acids consequently activate the mTORC1 pathway and drive cell cycle progression. The leucine transporter LAT1/4F2hc heterodimer assembles as part of a large complex with the glutamine transporter ASCT2 to transport amino acids. In this study, we show that the expression of LAT1 and ASCT2 is significantly increased in human melanoma samples and is present in both BRAF^WT (C8161 and WM852) and BRAF^V600E mutant (1205Lu and 451Lu) melanoma cell lines. While inhibition of LAT1 by BCH did not suppress melanoma cell growth, the ASCT2 inhibitor BenSer significantly reduced both leucine and glutamine transport in melanoma cells, leading to inhibition of mTORC1 signaling. Cell proliferation and cell cycle progression were significantly reduced in the presence of BenSer in melanoma cells in 2D and 3D cell culture. This included reduced expression of the cell cycle regulators CDK1 and UBE2C. The importance of ASCT2 expression in melanoma was confirmed by shRNA knockdown, which inhibited glutamine uptake, mTORC1 signaling and cell proliferation. Taken together, our study demonstrates that ASCT2‐mediated glutamine transport is a potential therapeutic target for both BRAF^WT and BRAF^V600E melanoma.     

DKC1影响黏膜型黑色素瘤细胞的增殖、凋亡和细胞周期且与MEKERK通路相关

目的：研究角化不良素假尿苷合成酶1（dyskerin pseudouridine synthase 1,DKC1）对黏膜型黑色素瘤细胞的增殖、细 胞周期和凋亡的影响及其可能的机制。方法：qPCR检测DKC1 mRNA在黏膜型黑色素瘤细胞系HMV Ⅱ、GAK和正常皮肤细胞 株BJ中的表达水平; 用DKC1 siRNA（si-DKC1 组）和对照 siRNA（si-Ctrl 组）转染 HMV Ⅱ和GAK细胞,干扰48 h后用qPCR和 Western blotting验证敲减效率,CCK-8法检测敲减DKC1对黏膜型黑色素瘤细胞增殖的影响,流式细胞技术检测对细胞凋亡和周 期的影响,Western blotting和qPCR检测MEK-ERK通路相关分子表达变化。结果：HMV Ⅱ、GAK细胞的DKC1 mRNA和蛋白表 达水平均显著高于BJ细胞（均P<0.01）。转染siRNA48 h后, 与si-Ctrl组相比,si-DKC1组HMV Ⅱ和GAK细胞中DKC1 mRNA和 蛋白水平均显著降低（均P<0.01）,细胞的增殖水平显著下降(P<0.05或P<0.01）,细胞的凋亡率显著升高（均P<0.01）且促凋亡分 子caspase 9、BAK和PUMA mRNA的表达显著升高（P<0.05或P<0.01）,发生细胞周期阻滞(P<0.05或P<0.01）,MEK和ERK1/2 的磷酸化水平显著下调（P<0.05）。结论：敲减DKC1可抑制黏膜型黑色素瘤细胞的增殖,促进细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡, 其 机制可能与MEK/ERK信号通路有关。