沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR快速检测体系的初步探讨

目的建立能在12小时内同时快速检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR体系。方法碱性蛋白胨水（BPW）非选择性增菌6h；100℃10min制备DNA模板；根据大肠杆菌O157：H7的uidA基因、志贺菌的ipaH基因及沙门菌的invA基因序列设计各菌引物，进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系，测定体系灵敏度和特异性。结果该多重PCR体系能在12h内同时检测3种目的菌；灵敏度为10～30cfu／ml；通过对23株目的菌和15株非目的菌检测，提示该体系特异性高。结论初步探讨出能在12h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR体系。     

多重PCR检测粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157:H7方法的研究

[目的]建立12h内快速检测粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的多重PCR方法。[方法]探讨已报道的多重PCR体系检测粪便中3种目的菌的可行性,根据沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因及大肠杆菌O157︰H7rfbE基因筛选设计新引物,优化反应条件,测定方法灵敏度和特异性。8h短时增菌后,对24份模拟粪便样品进行检测。[结果]已报道的多重PCR体系不适用于粪便中3种目的菌的检测;新建立的体系适用于粪便样品的检测,能在12h内同时检测3种目的菌。通过短时增菌,该体系对粪便样品中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的灵敏度分别为:8.5cfu/10ml增菌液,27cfu/10ml增菌液,5cfu/10ml增菌液。对28株目的菌和13株非目的菌的检测结果表明该方法具有良好特异性。[结论]成功建立能在12h内同时检测粪便样品中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的多重PCR检测方法,该方法特别适用于健康带菌者3种目的菌的快速筛查,为卫生检验检疫、食品微生物安全的监测和监督提供一有用的工具。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7多重PCR快速检测研究

[目的]建立能快速、特异检测肠出血性大肠杆菌O157︰H7的多重PCR技术。[方法]选用针对大肠杆菌O157志贺样毒素1、2(slt1/slt2)基因、溶血素(hlyA)基因、和O157特异性基因(rfbE)的4对引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了猪肉模拟样品检测。[结果]该方法扩增目的基因片段分别为348,584,250bp和497bp,特异性和灵敏度均高。细菌纯培养物的检测灵敏度为103cfu/ml,猪肉模拟样品37℃预增菌4h后检测灵敏度能达到100cfu/ml。[结论]初步建立了快速、灵敏、特异地测定肠出血性大肠杆菌EHECO157︰H7的多重PCR检测技术。     

多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌

目的建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法采用7.5%NaCl肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌剂对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果特异性实验表明本方法的特异性良好。对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为1cfu/ml。结论本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点。     

鉴定大肠杆菌O157:H7特异基因的PCR方法

目的建立一种特异、灵敏鉴定大肠杆菌O157:H7的PCR检测方法。方法针对大肠杆菌O157:H7表面抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbO157、fliCH7设计引物,分别扩增出目的产物。结果利用建立的方法对4株大肠杆菌O157:H7菌及12株非大肠杆菌O157进行检测,rfbO157、fliCH7基因的特异性均为100%;rfbO157基因的灵敏度约为6×104cfu/ml;fliCH7基因的灵敏度可达6cfu/ml。结论本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌O157:H7提供了一种简单、容易操作的手段。     

PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响.方法选择O157∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物,分别或共同进行PCR扩增,检测40株O157∶H7和非O157∶H7菌株,将细菌按10+1～10+6稀释后比较PCR的检测灵敏度.结果所有O157∶H7菌株均在497 bp和625 bp处出现O157抗原基因和H7抗原基因产物,其产毒株在484 bp和(或)210 bp处出现SLT2和(或)SLT1基因产物,非O157∶H7菌株PCR结果均为阴性;单一PCR检测灵敏度为150 CFU/PCR反应,多重PCR为＞1 500 CFU/PCR反应.结论在经过增菌后,多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便,为产毒和非产毒O157∶H7的诊断提供了新的手段.     

几种肠道菌中细胞致死性肿胀毒素的检测及其细胞毒性初步研究

目的了解肠出血性大肠杆菌、非典型致泻性大肠杆菌、志贺菌及部分肠杆菌中CDT毒素基因存在情况及其细胞毒性。方法用PCR方法检测cdt基因,并将阳性菌株培养上清与HeLa细胞共同孵育检测细胞形态的改变,初步评价CDT毒素的表达及其细胞毒性。结果在肠出血性大肠杆菌O157∶NM中,cdt基因检出率为16.28%（7/43）,其中3株为cdt-Ⅲ型,其他4株为cdt-Ⅰ型;携带HPI毒力岛的非典型致泻性大肠杆菌中cdt基因检出率为6.25%（5/80）;在志贺菌中,cdt基因检出率为2.67%（4/150）,非典型致泻性大肠杆菌和志贺菌检出的cdt基因全部为cdt-Ⅰ型。而在O157∶H7大肠杆菌、枸橼酸杆菌和沙门菌未检出cdt基因。所有cdt基因阳性菌株均使HeLa细胞出现典型的细胞肿胀变化,效应滴度介于1∶2到1∶16之间。结论CDT毒素只在肠出血性大肠杆菌O157∶NM、携带HPI毒力岛的非典型致泻性大肠杆菌和志贺菌中检出,且检出率均比国外同类菌株低,其存在是否与疾病严重程度相关及其细胞毒性机制尚须进一步研究予以证明。     

志贺菌毒力基因的多重PCR鉴定

目的：建立志贺菌肠毒素1基因（ShET-1B）、志贺菌肠毒素2基因（ShET-2）、侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）和侵袭相关基因（捌）的多重PCR鉴定方法，实现志贺菌多基因同时检测。方法：选择志贺菌的4种毒力基因作为靶基因，应用Touchdown PCR方法，在一个反应管中同时进行扩增，根据产物分子量定性判断结果。结果：多重PCR同时检测与单基因PCR分别检测4种毒力基因两种方法具有相同的灵敏度与特异性。624株志贺菌具有6种毒力基因型，571株福氏志贺菌（包括11个血清型）中556株ShET-1B阳性。结论：多重PCR鉴定志贺菌毒力基因具有简便、快速的特点，适用于毒力基因鉴定和流行病学调查研究。ShET-1B基因可能广泛存在于福氏志贺菌之中。     

大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的建立与应用

摘要:目的　建立快速检测食品中大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR 方法。方法　针对大肠杆菌O157︰H7菌体抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbE（O157）和fliC（H7）筛选设计引物和探针,优化反应条件,建立可特异性检测大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR方法,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价,对模拟样品和实际样品进行初步验证。结果　利用建立的方法对2株大肠杆菌O157︰H7及12株非大肠杆菌O157︰H7进行检测,O157︰H7菌株检测结果均为rfbE和fliC阳性,非O157︰H7菌株检测结果均为阴性,rfbE和fliC基因的特异性均为100%;2基因的检测灵敏度可达1.16×102 CFU/ml;批内、批间变异系数均小于3.5％;模拟样品立即检测,2个基因的最低检出限（2.7×102 CFU/ml）和细菌纯培养时接近;实际样品检测结果与我国检验检疫行业标准（SN/T 0973-2010）的检测结果一致。结论　建立的荧光定量PCR 方法特异性及重复性好,灵敏度高,可快速准确鉴定大肠杆菌O157︰H7菌株。     

EMA-PCR方法检测饮用水中3种食源性致病菌活菌研究

摘要:目的　将EMA（Ethidium Monoazide Bromide）选择渗透性与PCR技术相结合,建立有效快速检测饮用水中3种食源性致病菌活菌EMA-PCR方法。方法　以鼠伤寒沙门菌invA、肠出血性大肠杆菌O157:H7 rfbE、铜绿假单胞菌oprI基因为PCR检测靶基因,纯培养物提取模板进行PCR,进行EMA使用浓度及灵敏度试验。结果　EMA浓度不大于10 μg/ml对活菌DNA扩增没有明显抑制,终浓度为1 μg/ml EMA能有效抑制死菌扩增;对鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、铜绿假单胞菌的EMA-PCR灵敏度分别为1.2×104 CFU/ml、2×105 CFU/ml、3×104 CFU/ml;用10 μg/ml EMA处理饮用水水样,可同时检测出饮用水中含有的3种食源性致病菌活菌。结论　EMA-PCR方法可一次检测饮用水中3种食源性致病菌活菌,能避免PCR检测可能造成假阳性结果。     

沙门菌tHDA等温扩增检测方法的建立

目的建立基于依赖耐热解旋酶核酸等温扩增(t HDA)的沙门菌快速检测方法。方法从Gen Bank数据库下载沙门菌侵袭蛋白A(inv A)基因,比对确定保守区并设计t HDA引物,并对引物浓度、硫酸镁以及氯化钠浓度等反应条件进行优化。同时评价方法的特异性和灵敏度,并检测模拟样本和真实样本以验证方法的可靠性。结果建立的沙门菌t HDA检测体系经过优化,结果显示仅沙门菌菌株呈现特异性电泳条带,而志贺菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7、霍乱弧菌等其他5种肠道细菌均为阴性,特异性好;t HDA法检测沙门菌纯培养物的灵敏度为19cfu/μl,检测模拟样本的灵敏度为260 cfu/μl。采用t HDA方法检测18份真实样本,共检出9份沙门菌阳性,与国标法检测结果一致。结论沙门菌t HDA检测方法快速、灵敏、特异,在食源性疾病检测及监测中具有重要的技术优势。     

食品标本处理方法对大肠埃希菌检出限影响

目的 研究快速、敏感、低成本的食品标本处理方法。方法 在牛肉馅中接种不同浓度的大肠埃希菌O157：H7，经离心、过滤，去除PCR抑制剂。浓缩菌株，用煮沸法和酶／冻融法裂解菌株，制备模板DNA。通过PCR检测大肠埃希菌O157：H7志贺毒素基因以评价该处理方法的可行性。结果 在未增菌条件下，PCR最低能检测到103CFU／g牛肉馅，增菌6h，最低能检测1CFU／g牛肉馅，整个检测过程只需要12h。结论 所采用的标本处理方法是一种灵敏、省时、低成本的方法，能显著地提高PCR检测食品标本中的大肠埃希菌O157：H7的灵敏度。     

一起由宋内志贺菌引起食物中毒的病原菌检测分析

目的通过实验室检测分析一起食物中毒的病原菌。方法按GB/T 4789.36—2008、GB 4789.4—2010、GB4789.10—2010、GB 4789.5—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验》中的方法,对24份患者吃剩的食物、12份患者大便进行肠出血性大肠埃希菌O157∶H7、沙门菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌的分离培养及生化鉴定;同时采用多重PCR检测技术对24份患者吃剩的食物进行以上项目的检测。并对检出的志贺菌菌株进行血清凝集试验、药敏试验和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型。结果 24份患者吃剩的食物中检出宋内志贺菌1株,12份患者大便中检出宋内志贺菌8株,9株宋内志贺菌PFGE基因图谱相似性系数≥0.98。结论由宋内志贺菌Ⅰ相导致了这起食物中毒的发生。建议各级卫生监督部门要加大监督检查力度,从而减少食物中毒的发生,切实保障儿童身体健康。     

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7的分子生物学特性研究

目的:了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157:H7(HZ1-11株)的分子生物学特性.方法:应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种.应用O157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因,进行菌株血清型的鉴定.应用多重Real-timePCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因.对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,并与国内代表菌株进行比较.ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性.结果:细菌生化鉴定为大肠埃希菌,山梨醇阴性.血清型为O157:H7.毒力基因stx2、hly和eae均阳性,stx1阴性.PFGE谱带同江苏分离O157:H7菌株几乎完全相同,带型的相似度为97%.结论:该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7,与国内近年在江苏等地流行的STECO157:H7菌株密切相关.STEC O157:H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁.     

多重PCR法鉴定伤寒沙门菌的研究

目的建立多重PCR方法鉴定伤寒沙门菌,为临床确诊及现场流行病学调查提供快速准确的实验室技术支持。方法根据沙门菌菌体抗原A/D1群基因、鞭毛抗原基因(fliC-Hd)及伤寒沙门菌Vi抗原基因片段(Vi)设计引物,建立多重PCR体系并进行反应条件优化。选择15株不同血清型沙门菌及18株非沙门菌菌株,对所建立体系的特异性进行检测,并将该体系应用于浙江省分离的50株实际样本的检测。结果建立并优化了伤寒沙门菌检测的多重PCR体系,优化后25μl PCR体系包括100μM dNTPs、2.5 U Taq DNA聚合酶、引物各0.2μM、模板5μl;PCR条件为94℃变性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,共循环35次。该体系具有高特异性,可准确快速鉴定伤寒血清型沙门菌,同时也可区分A群及D群血清群的沙门菌,并能检测鞭毛抗原为Hd及毒力基因Vi阳性的沙门菌,对实际样本检测符合率达100.00%。结论多重PCR可准确鉴定伤寒沙门菌,能作为传统血清学分型的辅助方法用于伤寒沙门菌的鉴定。     

首次从病人中分离到产毒O157:H7菌株的多重PCR鉴定

目的 鉴定从病人粪便中分离到的大肠杆菌O157：H7菌株的毒素基因和rfbO157特异性基因。方法 多重PCR技术同时检测大肠杆菌O157：H7的四种毒素基因和O157特异性基因。结果 可疑菌株含有志贺氏毒素2（stx2)基因，溶血素基因（hlyA)，肠上皮细胞纤毛清除素基因（eaeA)和O157：H7特异性基因（rfbO157)，但不含有志贺氏毒素1（stx1)基因。结论 菌株为产志贺氏毒素大肠杆菌O157：H7血清型。     

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌0157：H7的分子生物学特性研究

目的：了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157：H7（HZI-11株）的分子生物学特性。方法：应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种。应用0157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因，进行菌株血清型的鉴定。应用多重Real-time PCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因。对菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型，并与国内代表菌株进行比较。ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性。结果：细菌生化鉴定为大肠埃希菌，山梨醇阴性。血清型为O157：H7。毒力基因stx2、hly和eae均阳性，stx1阴性。PFGE谱带同江苏分离O157：H7菌株几乎完全相同，带型的相似度为97％。结论：该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）O157：H7。与国内近年在江苏等地流行的STEC O157：H7菌株密切相关。STEC O157：H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁。     

多酶恒温核酸快速扩增法检测大肠杆菌O157∶H7

【目的】采用多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)荧光法,结合金属有机骨架免疫磁珠富集功能,开发大肠杆菌O157∶H7快速富集和检测方法。【方法】以rfbE基因为靶标,筛选引物、探针及优化反应体系,同时考察该方法的特异性、灵敏度和实际应用情况。【结果】检测大肠杆菌O157∶H7菌体的检测限为1.18×10⁵CFU·m^-1,菌体DNA质量浓度检测限为9 pg·μL^-1,检测过程可在20 min内完成。47株菌(24株目标菌和23株非目标菌)特异性验证结果与实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)方法一致。【结论】该研究开发了一种基于金属有机骨架免疫磁珠富集结合MIRA的检测方法,该法操作简单、反应迅速,适用于食品中大肠杆菌O157∶H7的快速富集和检测。