武汉地区不同人群血清HCV感染状况研究

采用Ortho抗HCV ELISA C100-3试剂对武汉地区不同人群进行了抗HCV筛选。部分阳性标本作了RIBA证实实验及HCV RNA分析。并分析了5例HCV或HBV/HCV感染者的HCV基因型。结果表明:①在献血人群中,经RIBA证实抗HCV检出率为1.20％,HCV病毒血症者为0.80％;②多次受血治疗组抗HCV检出率为13.64％;③肝病组,重症肝炎为32.00％,HCC为22.86％,CPH和轻型CAH为4.05％,婴儿肝炎综合征中为5.00％;④亚基因探针杂交结果显示:武汉地区肝病患者感染的HCV主要为HCV-K2型(60.00％)。表明:经HBsAg和ALT筛选的合格献血员血清中HCV感染率仍较高,除接受血治疗外,重症肝炎和HCC患者对HCV易感性也较高,在婴儿肝炎综合征中约5％为HCV感染引起;初步结果提示武汉地区HCV的基因型主要为HCV-K2型。     

New hepatitis C therapies in clinical development

With the current standard of care for the treatment of chronic hepatitis C, a combination of pegylated interferon alfa and ribavirin, sustained virologic response rates can be achieved in approximately 50% of patients only. - Improved understanding of the viral life cycle has led to the identification of numerous potential targets for novel, direct-acting antiviral compounds. Inhibitors of the NS3/4A protease are currently the most advanced in clinical development. Recently completed phase 3 studies of the two protease inhibitors telaprevir and boceprevir, each given in combination with standard of care, yielded sustained virologic response rates in the range of 66-75% in treatment-naive patients and 59-66% in treatment-experienced patients with HCV genotype 1 infection. Studies of second-generation protease inhibitors, with the potential advantage of improved potency, drug metabolism and pharmacokinetics profile, are already underway. - Inhibitors of the HCV NS5A protein and NS5B polymerase are potentially active across different HCV genotypes and have shown promising antiviral efficacy in early clinical studies. Other emerging mechanisms include silymarin components and inhibitors of cell proteins required for HCV replication. - While improved formulations of current HCV therapies are also being developed, future hopes lie on the combination of direct-acting antivirals with the eventual possibility of interferon-free treatment regimens.     

持续表达的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2细胞内质网应激反应的研究

目的研究持续表达的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)对HepG2细胞内质网应激反应的影响。方法 NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染HepG2细胞,G418筛选、基因组PCR和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内人X盒结合蛋白1(XBP1)mRNA剪接,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78启动子、XBP1启动子和核因子κB(NF-κB)活性。结果基因组PCR和Western blot鉴定证实NS4B基因整合到转染HepG2细胞的染色体上,并有效表达;在NS4B稳定转染的HepG2细胞中,检测到XBP1mRNA剪接、XBP1和Grp78启动子激活、Ca2+稳态变化及NF-κB激活。结论 NS4B在HepG2的稳定表达诱导了内质网应激反应,揭示NS4B可能通过诱导肝细胞内质网应激反应在HCV感染及其致病性中发挥作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B基因酵母表达载体的构建及表达

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4B基因的酵母细胞表达载体，为探索HCVNS4B在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV-1为模板扩增HCVNS4B基因，克隆到pGEM-T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCVNS4B基因酵母表达载体，Western免疫印迹分析显示了HCVNS4B在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在，融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论：HCVNS4B蛋白在酵母中表达成功。     

前S1抗原在干扰素治疗乙型肝炎时的应用价值

目的:探讨HBV前S1抗原(Pre-S1)在干扰素治疗乙型肝炎中的应用价值。方法:56例慢性活动性肝炎(CAH)患者分为治疗组和对照组,治疗组患者接受干扰素抗病毒治疗,对照组仅做一般护肝治疗,然后测定Pre-S1相对滴度和HBVDN含量进行分析。结果:治疗组干扰素治疗后Pre-S1相对滴度显著下降,与治疗前相比差异有显著性(P<0.01);而对照组治疗后Pre-S1相对滴度下降不明显,与治疗前相比无显著性差异(P>0.05);治疗组血清Pre-S1相对滴度及HBVDNA含量变化在治疗后下降幅度有高度的一致性。结论:Pre-S1与HBVDNA检测对于评估干扰素抗病毒疗效有高度的一致性,对临床监控抗病毒治疗非常必要。     

丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起慢性肝炎并进而发展为肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一。目前,临床上采用α-干扰素(IFN-α)和利巴韦林(RBV)联合用药治疗丙型肝炎,但有效率仅为40%~50%。寻找HCV特定靶向抗病毒治疗药物是抗HCV研究的重要方向,相应靶点包括NS2 和 NS3 蛋白酶,NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B,其中以NS5B RNA依赖性RNA聚合酶(NS5B RdRp)为靶标的抗HCV药物研究近年来颇受关注。本文在介绍NS5B及NS5B RdRp结构和功能的基础上,总结归纳以NS5B RdRp为靶点的HCV特定靶向抗病毒治疗药物研究的主要策略,以及近年来相关NS5B RdRp抑制剂的研究进展。     

丙型肝炎病毒准种复杂性与干扰素疗效关系的初步探讨

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)1b型基因高变区1(HVR1)、非结构5A(NS5A)区准种复杂性及与干扰素(IFN)疗效关系。方法：应用SSCP法检测慢性丙型肝炎患者IFN治疗前后HCV准种的动态变化。结果：治疗前IFN治疗有效组HCV HVR1准种的复杂性(SSCP条带数)明显低于无效组，NS5A区两组无差异。无效组在治疗过程中，大部分患者HVR1 SSCP条带数较治疗前有所减少。结论：HVRl准种的低复杂性预示对IFN治疗产生应答，可以进行疗效预测。NS5A区准种的复杂性与IFN疗效无关，不能用于疗效预测。     

Comparison between homologies of E2/NS1 gene from genotype III Chinese isolates of hepatitis C virus and that from reported isolates

ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｃａｕｓａｔｉｖｅａｇｅｎｔｏｆｎｏｎＡ,ｎｏｎＢｈｅｐａｔｉｔｉｓｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔｔｈｅｗｏｒｌｄ．１Ｒｅｃｅｎｔｌｙ,ｉｔｗａｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｐｒｏｄｕｃｔｅｎｃｏｄ...     

氨基端不同二级结构的丙型肝炎病毒NS3/4A 复合体的丝氨酸酶活性差异研究

目的 探讨表达不同氨基端二级结构的丙型肝炎病毒非结构蛋白3/4A(HCV NS3/4A)各亚型丝氨酸酶活性及其对宿主细胞功能抑制作用的差异.方法 以pSG5/M-H05-5/4A为模板(A1-1),构建表达不同氨基端二级结构NS3/4A的点突变质粒,并分别命名为A1-2,A2-1,A2.2,B1-1,B1-2,B2-1,B2-2.Western印迹检测所有构建质粒的表达及各亚型顺式及反式NS3蛋白酶活性的差异.荧光素酶报告试验检测pSG5/M-H05-5/4A各个二级结构亚型对干扰素-β(IFN-β)产生及p53依赖的荧光素酶基因的转录活性的抑制作用以及各亚型之间抑制作用的差异.结果 Western印迹显示所有构建质粒均成功表达,而且A2-1和B2-1亚型NS3/4A存在不完全切割现象.表明与其他亚型相比,A2-1和B2-1顺式NS3丝氨酸蛋白酶活性较弱.与其底物NS5A/5BAC共表达后,A2-1和B2-1亚型未切割NS5A5B明显多于其他亚型,而切割 NS5A 则明显少于其他亚型.说明与其他亚型相比,A2-1和B2-1 亚型的反式NS3蛋白酶活性亦较弱.荧光素酶试验结果显示,所有亚型M-H05-5/4A均显著抑制IFN-β启动子活性(P＜0.01)和p53依赖的荧光素酶基因的转录活性(P＜0.01),A2-1和B2-1亚型的抑制作用显著弱于其他亚型(P＜0.05).结论 氨基端不同二级结构的HCV NS3/4A复合体具有不同的丝氨酸酶活性和宿主细胞功能抑制作用.     

丙型肝炎诊断试剂的研究

本文用分子生物学方法根据中国人HCV基因特点进行多肽合成,研究丙型肝炎C区、E区酶标试剂的临床应用以及与抗C 100-3试剂的比较,并以 RT双 PCR的方法建立了HCV RNA的检测试剂及临床应用。结果发现抗-CP试剂敏感性、特异性均优于抗C100-3,从临床检测结果看,在自然人群中感染率抗-CP为2.8％,抗C100-3为2.1％,特别在输血后肝炎中,抗 CP阳性率高达 71.7％～75.9％。因此提出对HCV的诊断确立与愈后判断各类试剂有各自的作用,不能只根据某一试剂的某一次结果而简单地否定 HCV感染。HCV RNA测定,建立了5’末端非编码区及非结构区(NS 1),采用双PCR观察结果抗-CP阳性者绝大多数为RNA阳性,并提示将有助于抗病毒药物疗效的观察指标。     

SEQUENCE ANALYSIS OF THE NS5 REGION OF GBV-C／HGV AND DETECTION OF THE VIRUS BY REVERSE TRANSCRIPTASE PCR

GBV-C/HGV is a newly identified virus associated with human hepatitis.In this study,the nucleotide sequences of the partial NS5 gene of GBV-C/HGV derived from sera of 8 Chinese patients were determined.The nucleotide homology among the 8 isolates were 92% on average.On the basis of sequence analysis,two sets of oligonucleotide primers derived from highly conserved region of GBV-C/HGV NS5 gene were designed to establish both sensitive and specific nested PCR for detection of GBV-C/HGV RNA.253 Chinese patients were examined for the virus RNA.GBV-C/HGV RNA positive rates in patients infected with HBV,HCV and patients with chronic non-B,non-C hepatitis were 18.4%,19.8% and 8.9% respectively.This result suggested that HBV,HCV and GBV-C/HGV shared the same transmission risk factors.8 patients with GBV-C/HGV and HCV coinfection were retrospectively observed for the response to interferon.Coinfection with GBV/HGV did not negatively influence the responsiveness of HCV,and GBV-C/HGV was sensitive to interferon to a certain degree.     

丙型肝炎病毒NS3不同末端在COS、NIH3T3细胞中的转录与表达

目的:建立丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的COS和NIH 3T3的细胞系表达系统,以探讨其慢性化及肝癌的发病机理.方法:用脂质体共转录法,将含有丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的重组质粒pSG 5 neo转录至COS和MH 3T3细胞系中表达,并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Southern blot法在DNA水平检测.用Western blot法在蛋白水平检测.结果:在转录的COS和MH 3T3的细胞系中,存在有丙型肝炎病毒NS 3在3和5基因片段,并可表达相应的抗原.结论:此表达细胞系的建立,有利于对丙型肝炎病毒的复制,丙型肝炎慢性化及肝癌发病的研究.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究

目的：筛选并克隆丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）反式激活新型靶基因。方法：以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆，其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，通过序列同源性比对和电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从转染peDNA3．1（-）-NS4A的HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术扩增获得该新基因的全长序列，并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果：该新基因的编码序列全长为963个核苷酸（nt），编码产物由321个氨基酸残基（aa）组成，并测序证实，命名为NS4ATP1，在GenBank中注册，注册号为AY740521。结论：分子生物学技术与生物信息学技术相结合，发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1，为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

HCV NS5b1b与1b混合感染指标在干扰素治疗中的应用

目的 :探讨丙型肝炎病毒 (HCV)感染的基因型及其与干扰素应答效果的关系。方法 :应用逆转录—聚合酶链反应 (RT PGR)技术对 2 69例肝炎病人血清进行HCVNS5b区基因片段扩增 ,并对 5 6例阳性PCR产物进行酶切分型 ,同时观察干扰素α 2b对其中 48例慢性丙型肝炎的疗效。结果 :HCV单纯 1b型感染、1b与 1b混合感染及 2a型感染对干扰素的应答率分别为 70 % (14 /2 0 )、9 5 % (2 /2 1)、71 4% (5 /7) ;其中完全应答分别为 45 % (9/2 0 )、4 8% (1/2 1)、5 7 1% (4 /7) ;部分应答分别为 2 5 % (5 /2 0 )、4 8% (1/2 1)、14 3 % (1/7)。 1b与 1b混合感染组同单纯 1b型及 2a型感染组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ,而单纯 1b型感染组与 2a型感染组比较无明显差异 (P >0 0 5 )。结论 :HCV单纯 1b型感染或 2a型感染者对干扰素敏感 ,而 1b与 1b混合感染者干扰素治疗效果极差 ,可作为预测干扰素疗效的一项新的重要指标     

Transfection and expression of HCV-NS5B gene in Huh-7 cells

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＮＳ5ＢｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨｕｈ 7ｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ ,ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｎｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ 5Ｂ(ＮＳ5Ｂ)ｉｎＨｕｈ 7ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｒｅｗｅｒｅＮＳ5Ｂｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎ…     

Direct-acting Antiviral Agents Resistance-associated Polymorphisms in Chinese Treatment-na?ve Patients Infected with Genotype 1b Hepatitis C Virus

Background:

It has been reported that several baseline polymorphisms of direct-acting antivirals (DAAs) agents resistance-associated variants (RAVs) would affect the treatment outcomes of patients chronically infected with hepatitis C virus (CHC). The aim of this study is to investigate the prevalence of DAAs RAVs in treatment-naïve GT1b CHC patients.

Methods:

Direct sequencing and ultra-deep sequencing of the HCV NS3, NS5A, and NS5B gene were performed in baseline serum samples of treatment-naïve patients infected with genotype 1b hepatitis C virus (HCVs).

Results:

One hundred and sixty CHC patients were studied. Complete sequence information was obtained for 145 patients (NS3), 148 patients (NS5A), and 137 patients (NS5B). Treatment-failure associated variants of DAAs were detected: 56.6% (82/145) of the patients presented S122G for simeprevir (NS3 protease inhibitor); 10.1% (14/148) of the patients presented Y93H for daclatasvir and ledipasvir (NS5A protein inhibitors); 94.2% (129/137) of the patients presented C316N for sofosbuvir (NS5B polymerase inhibitor). Nearly, all of the DAAs RAVs detected by ultra-deep sequencing could be detected by direct sequencing.

Conclusions:

The majority of genotype 1b CHC patients in China present a virus population carrying HCV DAAs RAVs. Pretreatment sequencing of HCV genome might need to be performed when patients infected with GT1b HCV receiving DAAs-containing regimens in China. Population sequencing would be quite quantified for the work.     

丙型肝炎病毒NS4B对YAP转录、表达、磷酸化及细胞内分布的影响

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)细胞内荧光表达质粒,检测NS4B对Yes相关蛋白(YAP)转录、表达、磷酸化及细胞内分布影响。 方法根据现有含有HCV 1b型病毒NS4B完整基因的质粒设计NS4B的特异性扩增引物,扩增NS4B完整序列并构建NS4B荧光质粒,质粒转染进入HEPG2和293T细胞,通过Real-time PCR检测YAP基因转录水平;通过Western blotting检测YAP蛋白表达及磷酸化水平;通过激光共聚焦和核质分离实验检测YAP细胞内分布。 结果成功扩增出NS4B完整序列并构建其荧光质粒;Real-time PCR和Western blotting结果显示,NS4B并不影响YAP的转录和表达水平,但是能够调节其磷酸化水平;激光共聚焦和核质分离试验结果提示NS4B能够调节YAP在细胞质和细胞核内的比例。 结论HCV NS4B可能通过对YAP的影响发挥生物学功能。     

淮北市HCV感染者基因亚型分布特征及1b型天然耐药突变分析

目的：分析淮北市HCV感染病人基因亚型分布特征及1b型天然耐药突变情况，为HCV临床抗病毒治疗和感染防控提供依据。方法：选取2019-2022年就诊于淮北矿工总医院住院的HCV感染者(未经任何DAAs治疗)HCV-RNA阳性血清样本，抽提RNA后逆转录，采用巢式PCR扩增NS5B、NS5A及NS3/4A区域基因序列，产物送交测序公司测序。采用Mega11.0软件对测序结果进行序列比对分析。结果：结果 HCV 1b型(68.63%)为主要亚型，2a型次之(29.41%),此外检出3a型2例(1.96%)。HCV亚型的分布与性别、年龄无明显相关(P>0.05),1b型多见于≥55岁年龄组中。RASs主要类型为：NS5B区C316N(100.00%);NS5A区Q54H(40.47%),Y93H(19.05%);NS3/4A区Q86P(30.88%),I71V+Q86P(19.12%),V170I+Q86P(14.71%)及T72I/A+Q86P(13.24%)。其中突变频率较高的RASs依次为：C316N(100.00%)、Q54H(60.00%)、Q86P(53.78%)、Y93H...     

丙型肝炎患者抗-NS5抗体与α-干扰素疗效关系的研究

目的探讨丙型肝炎患者IgG抗-NS5抗体与α-干扰素疗效的关系.方法以重组HCV抗原及NS3、NS5区段多肽作为抗原,以EHSA法检测丙型肝炎患者α-干扰素治疗前血清IgG抗-NS3、抗-NS5、抗-HCV抗体及其滴度.结果α-干扰素治疗有效组的抗-NS5抗体的阳性率为80%(8/10),无效组为20%(2/10),两组比较有显著差异(P＜0.05);有效组抗-NS5抗体滴度显著性高于无效组(P＜0.05);有效组和无效组抗-NS3、抗-HCV抗体阳性率及抗体的滴度无明显差异(P＞0.05).结论治疗前血清IgG抗-NS5抗体可以作为α-干扰素疗效的一个预测指标.