聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒基因载体的制备及相关性质的体外研究

目的优选制备可载带质粒DNA的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(PBCA-NPs)的工艺条件,并研究其体外生物学特性.方法选用乳化聚合法制备PBCA-NPs,采用正交实验法,以激光粒度分析仪及原子力显微镜(AFM)综合分析实验结果来确定最优化的制备条件.用阳离子表面活性剂十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)对纳米粒进行表面修饰后连接质粒DNA,并分析PBCA-NPs及CTAB修饰的PBCA-NPs的细胞毒性效应、DNA装载效率、PBCA-NPs-DNA抗超声破坏和抗DNaseI的降解作用及其在体外的基因转染能力.结果激光粒度分析仪及原子力显微镜结果表明,PBCA-NPs粒形圆整,大小均匀,平均粒径106nm.琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计测定DNA装载量达93%.该纳米粒能显著提高质粒DNA抵抗核酸酶降解和超声波剪切的能力.细胞转染实验表明,该纳米粒传递质粒DNA进入HepG2和3T3细胞的效率较高.结论利用该制备工艺生产出的具备良好生物学特性的PBCA-NPs是基因转运和基因治疗中极具应用潜力的非病毒载体.     

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒载NF—kB圈套基因的制备与分析

目的制备携载NF-kB圈套DNA的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（PBCA—NPs），研究其在大鼠脑内的生物学活性。方法选用乳化聚合法制备PBCA—NPs，以激光粒度分析仪及透射电子显微镜分析纳米粒的形态和粒径。用阳离子表面活性剂十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）对纳米粒进行表面修饰后连接DNA，并分析PBCA—NPs及CTAB修饰的PBCA—NPs的细胞毒性效应、DNA装载效率、PBCA—NPs—DNA抗超声破坏和抗DNaseⅠ的降解作用及其在体内的生物活性。结果激光粒度分析仪及透射电子显微镜结果表明，PBCA—NPs粒形圆整，大小均匀，平均粒径90nm。琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计测定DNA装载量达96％。该纳米粒能显著提高DNA抵抗核酸酶降解和超声波剪切的能力。在体试验证明PBCA—NPs—DNA通过侧脑室注射能以较高效能抑制大鼠皮质的NF—kB蛋白活性。结论PBCA—NPs能够与NF—kB圈套DNA结合组成基因转运体系，该体系可以作为研究NF-kB功能的有效工具。     

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒载P16a基因的制备及在喉癌细胞中的表达

目的制备携带P16a基因的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒并在喉癌细胞中进行表达。方法选用乳化聚合法制备PBCA-NPs,以激光粒度分析仪及透射电子显微镜分析纳米粒的形态和粒径。用阳离子表面活性剂十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)对纳米粒进行表面修饰。构建真核表达载体pIRES2-EGFP-P16a经过酶切鉴定及测序后与PBCA-NPs连接,转染喉癌细胞Hep-2,荧光显微镜检测转染效率,蛋白印迹法检验P16a基因的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果所制PBCA-NPs粒径均匀、Zeta电位较高,较为理想;重组质粒pIRES2-EGFP-P16a经过酶切鉴定及测序后,表明真核表达载体构建正确;PBCA-NPs可以介导pIRES2-EGFP-P16a高效转染喉癌细胞,蛋白印迹检测表明转染后喉癌细胞能够表达外源P16a基因,在其介导下P16a能有效抑制喉癌细胞的增殖并能诱导细胞凋亡。结论聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒可以作为一种良好的基因载体,为喉癌的基因治疗提供了新思路。     

NF-κB圈套核苷酸-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备及评价

目的制备NF-κB圈套核苷酸(decoy ODNs)-聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)纳米粒(NF-κB decoy ODNs-PB-CA-NP)。方法用DEAE-Dextran作为稳定剂,通过乳液聚合法制备带正电荷的PBCA-NP运载NF-κB decoy ODNs,检测其形态、粒径、负载率、物理稳定性及细胞毒性。结果制备的纳米粒大小均匀,空白纳米粒平均粒径为70nm,zeta电位为+21.6mV,负载率为97.49%,复合纳米粒平均粒径为150nm,在150ng/μl以下浓度几乎观察不到细胞毒性。结论该方法制备了负载率高、大小均匀的、细胞毒性小的NF-κB decoy ODNs-PBCA纳米粒。     

聚乙烯亚胺载基因纳米颗粒的制备及其相关特性的研究

目的 制备聚乙烯亚胺载基因纳米颗粒并研究其理化性质和体外转染活性.方法 通过自由基聚合法制备出聚乙烯亚胺空载纳米粒后,用绿色荧光蛋白(PEGFP-C1)质粒做报告基因,以静电吸附的方式将PEGFP-C1质粒DNA和聚乙烯亚胺结合形成聚乙烯亚胺裁基因纳米粒,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),MTT试验检测聚乙烯亚胺纳米载体HepG2和L-02的细胞毒作用,用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性,用流式细胞仪测定转粢效率.结果 聚乙烯亚胺与聚甲基丙烯酸甲酯形成表面带正电荷的纳米粒,呈单分散球形,平均粒径为102.62 nm,Zeta电位为+46.2 mV.当PEGFP-C1质粒DNA与纳米粒的N/P为3.2:1以上时,两者方可完全结合形成复合物.PEI纳米粒可携带质粒DNA进入COS7细胞,并突破吞噬小泡释放质粒于细胞质,最终质粒聚集于细胞核内进行表达.结论 聚乙烯亚胺纳米粒可以用作基因递送的非病毒栽体系统,值得进一步研究.     

O-羧甲基乳糖酰化壳聚糖-聚乳酸阿霉素纳米粒的制备及其物理化学性质的测定

目的制备具有肝靶向性的O-羧甲基乳糖酰化壳聚糖-聚乳酸阿霉素纳米粒,并对纳米粒药物含量、包封率和粒径大小进行检测。方法制备出O-羧甲基乳糖酰化壳聚糖-聚乳酸阿霉素纳米粒,并通过紫外分光光度计测定纳米粒的载药量以及包封率,激光粒度分析仪及电镜测量粒径大小。结果电镜及激光粒度分析仪检测证实纳米粒大小均匀,粒径(197±32)nm,载药量为(44.79±4.27)μg/mg,包封率(67.34±3.32)%。结论该实验制备的纳米粒其粒径小,载药量及包封率高。     

甘草酸表面修饰阿霉素壳聚糖纳米粒的制备及特性研究

目的:制备具有肝细胞靶向的甘草酸表面修饰阿霉素壳聚糖纳米粒,并考察其理化特性。方法:采用离子凝胶法制备阿霉素壳聚糖纳米粒,再以高碘酸盐氧化法制备甘草酸表面修饰阿霉素壳聚糖纳米粒。激光透射电子显微镜观察纳米粒的形态,马尔文激光粒度仪测定其粒径。RP-HPLC法间接测定纳米粒中甘草酸结合率和阿霉素包封率,并初步研究体外甘草酸的结合稳定性和阿霉素释药特性。结果:电镜显示纳米粒呈类球形,平均粒径为179.5 nm,甘草酸结合率达到80%以上,在释放介质中,12 h的甘草酸结合率仍保持(65.2±3.4)%;纳米粒中阿霉素包封率达90%以上,体外释药缓慢,无明显的"突释"现象,72 h的累计释放百分率为(28±4.6)%。结论:本方法制备的甘草酸表面修饰阿霉素纳米粒工艺简单,包封率高,且甘草酸表面结合稳定,有望提高阿霉素的肝细胞靶向性。     

载基因纳米脂质体的制备及有关性质的初步研究

目的用去污剂透析法制备载基因脂质体并考察其性质。方法以大豆磷脂和双十八烷基二甲基溴化铵为脂质材料,以Myrj53为表面修饰材料制备载基因纳米脂质体,用透射电子显微镜观察脂质体的形态,用纳米粒度及电位分析仪测定脂质体的粒径大小、多分散指数及zeta电位,并考察载基因纳米脂质体对DNA的包封率及体外保护DNA抵抗核酸酶降解的性质。结果制得的脂质体形态较为圆整,平均粒径为(72.73±7.14)nm(n=3),多分散指数为0.288±0.093(n=3),zeta电位为(-23.77±3.51)mV(n=3),包封率为88.13%±4.41%(n=3),DNase体外降解实验和凝胶电泳分析表明脂质体对质粒DNA有较强的保护作用。结论去污剂透析法是制备载基因纳米脂质体有效可行的方法。     

青藤碱对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF-κB的抑制作用

目的 观察青藤碱(sinomenine,SN)对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)大鼠滑膜细胞核因子-κB(NF-κB)的DNA结合活性及核转位的影响,以阐明该药抗炎的可能机制.方法 以CIA大鼠为模型,收集膝关节滑膜细胞体外培养,设正常对照组、CIA组、CIA 甲氨喋呤10 μmol/L(阳性对照组)、CIA SN 50 μmol/L组、CIA SN 500 μmol/L组.应用荧光标记与激光共聚焦扫描显微镜检测滑膜细胞NF-κB p65亚基核转位,电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测NF-κB与DNA序列的结合活性.结果 与正常对照组相比,CIA大鼠滑膜细胞可见明显的p65亚基核移位,NF-κB的DNA结合活性显著升高(P＜0.01),SN在50 μmol/L及500 μmol/L时可呈浓度依赖性地抑制CIA大鼠滑膜细胞p65亚基核转位及NF-κB的DNA结合活性,甲氨喋呤在10 μmol/L时可下调NF-κB的DNA结合活性但未抑制p65亚基的核转位.结论 SN抑制滑膜细胞内NF-κB p65 核转位和NF-κB的DNA结合活性为其抗炎机制之一.     

纳米羟基磷灰石表面修饰及其DNA结合性能的实验研究

目的 探讨纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)的表面修饰对DNA结合能力的影响.方法 采用化学共沉淀-水热合成法制备nHA;应用聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)对其进行表面修饰,对修饰及未修饰纳米粒进行透射电镜观察及Zeta电位检测;凝胶电泳检测纳米粒修饰前后在不同pH值、不同浓度下与DNA结合及保护DNA抗核酸酶消化的能力.结果 经PEI表面修饰的nHA透射电镜下呈短棒状,粒径较均匀,分散程度良好;而未修饰的纳米粒较易团聚及分散性差.纳米粒经表面修饰后其Zeta电位为正,在不同pH值、不同浓度下与DNA具有较强的结合及抗核酸酶消化的能力;而未修饰的nHA表面带负电荷,与DNA结合及抗核酸酶消化的能力较差.在pH为7.0环境条件下经表面修饰的nHA浓度为250μg/ml时能更有效结合和保护DNA.结论 nHA经PEI表面修饰后可成为一种有效的DNA结合及转运载体.     

超顺磁性氧化铁(SPIO)与多聚赖氨酸(PLL)纳米粒的制备、结构验证及其空间结构表征

 目的  探讨葡聚糖修饰的超顺磁性氧化铁(super-paramagnetic iron oxide,SPIO)与多聚赖氨酸(polylysine,PLL)纳米粒的制备及其结构验证和空间结构表征。方法  在共沉淀法制备葡聚糖修饰的SPIO基础上,加入PLL制备出一种新的SPIO-PLL纳米粒,利用粒度电位分析仪、透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)对SPIO-PLL的粒径、电位、形貌学进行检测;高效液相凝胶色谱法(gel permeation chromatography,GPC)、红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)及核磁共振氢谱法(1HNMR)对SPIO PLL连接成功与否进行验证;高精度的原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)对SPIO-PLL的结构、形态及连接状态进行空间结构表征。结果  粒度电位分析和TEM结果显示SPIO-PLL的平均粒径为7.37 nm,平均电位为13.6 mV;GPC、FTIR及1HNMR结果显示SPIO及PLL之间已经成功连接;高精度AFM清楚显示出SPIO与PLL之间以亚胺键形式稳定相连。 结论  成功制备出一种性质稳定、粒径较小的新型SPIO-PLL纳米粒,这将对随后的肿瘤特异性探针制备奠定一定的基础。     

雌二醇-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备

目的:制备雌二醇-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(ES-PBCA-NP).方法:以聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)为载体,采用乳化聚合法制备ES-PBCA-NP.采用U5(53)均匀实验设计优化制备条件.用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径分布及Zeta电位;用原子力显微镜观察其形态;HPLC测定载药量及包封率.结果与结论:综合考虑选用二乙胺乙基葡聚糖(DEAE-Dextran)作为实验用表面活性剂,制备优化条件:pH 2.0,稳定剂和表面修饰剂质量比为1:1,BCA用量终质量浓度为12 g/L.以上述条件制备的纳米粒,稳定性好、形态规整、大小均匀,粒径(115±7)nm,Zeta电位为(43.6±3.2)mV,载药量为61 mg/g,包封率为78.0%,适合作为雌二醇的给药载体.     

透明质酸修饰的白蛋白纳米粒的制备及抗肿瘤作用的初步评价

目的 制备透明质酸修饰的白蛋白纳米粒,对其修饰程度和载药性能进行考察,并初步评价其抗肿瘤作用.方法 用去溶剂化法制备白蛋白纳米粒,并用透明质酸修饰纳米粒表面,以表面活性氨基的减少作为评价透明质酸修饰的白蛋白纳米粒的修饰程度的指标,并筛选最佳处方;考察pH和载药量及包封率的关系.使用噻唑蓝比色法(MTT)测定纳米粒对人肝癌细胞株HepG2的抑制率.结果 制备所得的透明质酸修饰的白蛋白纳米粒的平均粒径为396 nm,Zeta电位-19.7 mV,表面氨基减少率为34.28%;透明质酸修饰的米托蒽醌白蛋白纳米粒载药量11.13%,包封率94.64%,平均粒径为398 nm,Zeta电位-17.9 mV,且具有明显的缓释作用.透明质酸修饰的米托蒽醌白蛋白纳米粒比米托蒽醌水溶液具有更强的细胞抑制率(P＜0.05).结论 所用制备工艺稳定,可用于制备透明质酸修饰的白蛋白纳米粒.透明质酸修饰的米托蒽醌白蛋白纳米粒具有不低于药物溶液的活性.     

载端粒酶反义核酸PLGA纳米粒的表征及生物学效应

目的 检测载端粒酶反义核酸聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）纳米粒的表征及生物学效应。分析其粒径范围、载药量及生物相容性。方法 以激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径分布及平均粒径，紫外分光光度法测定反义核酸装载量，双室扩散法研究纳米粒的体外释药特性，核酸酶解法检测纳米粒对反义核酸的保护作用，MTT法研究纳米粒的细胞毒性。结果 纳米粒的平均粒度为201nm；包封率为67．3％，栽药量为3．66％。纳米粒体外释放开始阶段存在突释期，5d后释放量开始稳定，15d后仍有核酸释放。纳米粒中的核酸在37℃，经核酸酶消化1h后。仍然保持结构的完整、未被降解，而裸核酸在同样条件下30min即被完全降解。纳米粒对细胞的生长抑制与空白对照差异无显著性。结论 制备的端粒酶反义核酸-PLGA纳米粒稳定性、生物相容性好，以PLGA纳米粒作为载体可保护反义核酸免受核酸酶的降解。但PLGA纳米粒的反义端粒酶核酸载药量偏低，需进一步改进制备方法，提高载药量。     

石杉碱甲聚乳酸-乙醇酸纳米粒的制备、表征及其小鼠活体成像脑靶向分布

目的 制备石杉碱甲（HupA）聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）纳米粒,并研究其分布特性.方法 以PLGA为载体材料,采用乳化溶剂挥发法,正交实验优化HupA-PLGA纳米粒的制备工艺;透射电子显微镜观察纳米粒形态;激光粒度仪测定平均粒径、粒径分布和Zeta电位;HPLC法测定纳米粒的包封率;并通过小动物活体荧光成像实验对纳米粒在小鼠体内的分布特性进行研究.结果 优化条件下制备的纳米粒呈圆形,大小较为均一,平均粒径为（46.49±1.37）nm,多分散指数值为0.31±0.01,Zeta电位为（-38.3±1.56）mV,包封率为（28.45±1.52）％,且工艺重现性好.小动物活体成像实验结果表明该纳米粒可以通过血脑屏障到达脑组织,且具有很好的缓释作用.结论 以PLGA为载体的HupA纳米粒具有较小的粒径、良好的缓释性能并能提高脑内药物浓度水平.     

NF-κB核苷酸圈套技术制备imDC联合超声介导对抗同种异基因大鼠胰十二指肠移植排斥反应研究

目的探讨NF-κB核苷酸圈套技术制备im DC联合超声介导抗同种异基因大鼠胰十二指肠移植排斥反应的作用。方法建立同种异基因大鼠胰十二指肠移植模型,分为对照组、NF-κB核苷酸圈套技术组、超声介导处理组及联合治疗组。检测细胞因子INF-γ、IL-4及IL-10水平及INF-γ、IL-4及IL-10 mRNA的表达;统计各组大鼠的生存率。结果联合治疗组生存周期最长,与其他组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。联合治疗组IL-4及IL-10水平最高,与其他组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 NF-κB核苷酸圈套技术制备im DC联合超声介导可协同增加抗同种异基因大鼠胰十二指肠移植排斥反应。     

雷公藤甲素聚乳酸纳米粒载药体系的研究

目的:研究聚乳酸包裹雷公藤甲素纳米粒的制备,并探讨其载药性质.方法:采用改良的自乳化溶剂蒸发法制备雷公藤甲素(TP)聚乳酸(PLA)纳米粒,考察各工艺因素对纳米粒粒径、包封率及载药量的影响,并通过透射电子显微镜(TEM)、动态激光粒度分析仪、傅立叶红外光谱(FT-IR)及X-射线粉末衍射(X-ray)初步研究了其载药性质.结果:优选出适合处方的包合工艺为:水相与有机相的比例为40:15(v/v),表面活性剂的浓度为1%,药物的浓度为0.3%,TP与PLA的比例为1:15(w/w),包封率为74.27%,载药量的百分率为1.36%,所得纳米粒形态光滑规整,其粒径分布均匀,FT-IR及X-ray表明TP被有效地包裹在纳米粒中.结论:此方法适合制备脂溶性药物聚合物纳米粒,适合大生产.     

巯基化壳聚糖-pcDNA 3.1 (+) -EGFP纳米粒的构建和对HeLa细胞体外转染活性的研究

目的 制备巯基化壳聚糖,构建巯基化壳聚糖-质粒DNA (pDNA) 纳米粒,并研究该纳米粒对HeLa细胞的体外转染活性.方法 1- (3-二甲胺基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDAC) 催化巯基乙酸与壳聚糖反应生成巯基化壳聚糖,傅里叶变换红外光谱仪测量产物的红外光谱,5-5'-二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB) 法检测产物的巯基含量;以pcDNA 3.1 (+) -EGFP为报告基因,巯基化壳聚糖为载体,用复凝聚法制得巯基化壳聚糖-pcDNA 3.1 (+) -EGFP纳米粒,Zeta电位和粒度分析仪检测该纳米粒的表面电位和粒径.纳米粒经DNase I处理、再在肝素作用下解聚,用琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性.评价巯基化壳聚糖-pcDNA 3.1(+) -EGFP纳米粒对HeLa细胞的体外转染活性,MTT法测定该纳米粒对HeLa细胞的毒性.结果 红外光谱图显示壳聚糖在EDAC的作用下被巯基化.DTNB法显示1 g巯基化壳聚糖的巯基含量为 (202.85±3.05) μ moL (n=6) .Zeta电位及粒度分析仪的结果表明巯基化壳聚糖-pcDNA3.1 (+) -EGFP纳米粒的平均粒径为288.7nm,Zeta电位为+ (25.2±2.1) mV.DNase I保护实验证明该纳米粒能有效抑制DNase I对内部pDNA的降解.体外转染实验表明巯基化壳聚糖-pcDNA 3.1 (+) -EGFP纳米粒能有效转染HeLa细胞系,且对HeLa细胞生长无抑制作用.结论 该制备工艺生产的巯基化壳聚糖-pcDNA 3.1 (+) -EGFP纳米粒能将质粒DNA导入HeLa细胞,使报告基因有效地表达.所以巯基化壳聚糖是基因转运和基因治疗中有应用潜力的非病毒类载体.     

NF-κB P65在大鼠异种心脏移植后心肌中的表达及意义

目的 复制小鼠→大鼠异种心脏移植模型,探讨核转录因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)P65蛋白在异种移植心肌中的表达及NF-κB的DNA结合活性.方法 动物随机数字法分成2组:A组(对照组),n=6;B组(移植组),n=6.采用免疫印迹杂交法(Western blot)检测对照组及移植组心肌组织NF-κB P65表达,凝胶电泳迁移率实验检测NF-κB DNA结合活性.结果 移植组的NF-κB P65蛋白表达和NF-κB DNA结合活性均显著高于对照组(P＜0.05).结论 NF-κB的激活可能在大鼠异种移植心脏排斥反应中起着重要作用.     

NF-κB靶向性哑铃形圈套寡核苷酸抑制肾小球系膜细胞TGF-β1的表达

目的:设计合成靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs,并检测其对NF-κB转录活性和肾小球系膜细胞TGF-β1表达的抑制效应.方法:采用电泳迁移率改变实验(EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF-κB转录活性的抑制效应.提取大鼠肾小球系膜细胞,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组.采用阳离子脂质体将2,4,8 mg/L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞,6 h后用LPS刺激,收集转染后8,12,18 h上清和细胞.用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清TGF-β1蛋白表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检测TGF-β1mRNA转录.结果:哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF-κB与其顺式元件的结合;4,8 mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1转录和表达.结论:靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF-κB的转录活性,从而对体外培养的肾小球系膜细胞炎性因子TGF-β1的表达具有抑制效应.