Edaravone-induced differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro

目的 采用密度梯度离心和差速贴壁法体外分离、培养、纯化及鉴定成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和依达拉奉联合诱导MSCs定向分化为神经元样细胞. 方法 选用1月龄健康雄性Wistar大鼠,采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓中的MSCs,通过差速贴壁法反复传代培养、纯化,取第3代细胞采用流式细胞术、免疫细胞化学等方法检测MSCs的纯度,利用bFGF联合依达拉奉诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过扫描电镜、免疫细胞化学等对诱导后的细胞进行鉴定. 结果 第3代MSCs经免疫细胞化学及流式细胞仪等检测,间充质干细胞特异性的标记物CD44表达阳性,不表达造血干细胞及白细胞的特异性标记物CD34、CD45,MSCs纯度高达95.5％.诱导分化后扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫细胞化学检测发现,细胞表达神经元特异性烯醇化酶( NSE),不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP),Nestin的表达随着细胞成熟而减弱. 结论 密度梯度离心和差速贴壁法可获得高纯度的MSCs;依达拉奉能高效地定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.     

灯盏花素注射液对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探索灯盏花素注射液体外诱导大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)分化为神经元和胶质细胞的可行性。方法贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓间充质细胞。第4代细胞行表型鉴定后,用灯盏花素注射液诱导,每6h倒置相差显微镜观察形态变化,免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞的神经元特异性稀醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测不同浓度灯盏花素注射液诱导后细胞的活力,流式细胞术及RT-PCR检测诱导前后细胞中NSE、GFAP mRNA的表达变化。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,诱导18h后BMSCs胞体开始收缩,有突起伸出,24h后突起增多形成网络结构。免疫细胞化学染色,NSE阳性表达率为(48.7±3.4)%,GFAP阳性表达为(56.8±4.2)%,流式细胞仪检测诱导24h后的细胞NSE及GFAP蛋白表达量均较未诱导组升高,RT-PCR检测诱导后细胞表达NSE、GFAP mRNA,未诱导的细胞则不表达。结论灯盏花素注射液可诱导大鼠骨髓间充质细胞在体外分化为神经元和神经胶质细胞。     

三七总皂甙和维甲酸联合诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞

目的： 体外探讨三七总皂甙、维甲酸对大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的影响。 方法： 以三七总皂甙和维甲酸为诱导条件诱导大鼠MSCs分化，免疫细胞化学检测分化细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、γ-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。 结果： 免疫细胞化学显示MSCs诱导后具有神经细胞的形态， NSE、AchE、GABA、TH有阳性表达，GFAP表达为阴性。 结论： 三七总皂甙和维甲酸联合应用对大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞及在提高其分化率中起着重要作用。     

BDNF诱导骨髓间质干细胞分化中神经元特异性蛋白表达与细胞凋亡的关系

目的：探讨脑源性神经营养因子（BDNF）体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）分化中神经元特异性蛋白表达与细胞凋亡的关系。 方法： 分别用BDNF和β-巯基乙醇（β-ME）诱导MSCs分化为神经元样细胞，在诱导1 h、6 h、12 h及24 h后用蛋白质印迹法检测神经元特异性蛋白（nestin、NSE、MAP-2及GFAP）的表达，同时用流式细胞仪检测各时点的细胞生长周期及细胞凋亡。 结果： 蛋白质印迹法结果显示β-ME和BDNF诱导的细胞均能表达神经元特异性蛋白：nestin和NSE，不表达MAP-2；神经胶质细胞特异性蛋白GFAP也有较弱表达。β-ME组诱导12 h后nestin的表达转为阴性，NSE表达也减弱，而BDNF组直至24 h nestin和NSE表达才渐转阴性；BDNF诱导的细胞S期百分率均较同时点的β-ME组高，β-ME在诱导后12 h出现了凋亡峰，BDNF诱导组在观察的时点内均未出现凋亡峰。 结论： β-ME诱导细胞的神经元特异性蛋白表达的减少与细胞凋亡在时间上一致，说明分化后细胞死亡的原因可能与凋亡有关；而BDNF诱导细胞的蛋白表达减少与细胞凋亡无关，提示BDNF诱导分化后的细胞死亡可能还与其它因素有关或者BDNF可能有抗凋亡作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞神经分化蛋白的表达

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外神经分化蛋白的表达。方法采用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓MSCs。取生长状态良好的第1、3、7代细胞绘制生长曲线,免疫细胞化学法鉴定其性质,检测巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果细胞传代后1-2d为滞留期,3d后达对数生长期,第6d进入平台期。免疫细胞化学法鉴定大鼠骨髓MSCsCD44呈阳性,CD34呈阴性,nestin、NSE、MAP2、GFAP、TH均呈不同程度的阳性表达,其阳性表达率分别为(25.5±5.6)%、(14.2±2.1)%、(1.4±0.5)%、(4.5±1.2)%、(3.6±1.2)%。结论大鼠骨髓MSCs在体外能自发地表达神经干细胞和神经细胞的某些标志蛋白,这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞。     

葛根素对骨髓间充质细胞的诱导分化

目的探索葛根素体外诱导大鼠骨髓间充质细胞(Bone Marrow Stromal Cells MSCs)分化为神经元和胶质细胞的可行性,为中药在细胞定向分化中的应用提供理论和实验依据.方法用贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓间充质细胞.培养传至第5代,诱导组以2.5mg/ml的葛根素预诱导24h后,用17.5mg/ml的葛根素无血清培养基诱导,未诱导组加入等量培养基,24 h后相差显微镜观察形态变化,免疫细胞化学染色鉴定诱导后的细胞神经元特异性稀醇化酶(neuronspecific enolase NSE),神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)蛋白的表达情况,MTT检测不同浓度葛根素诱导后细胞的活力,流式细胞仪及RT-PCR检测诱导前后细胞中NSE、GFAP的表达情况.结果诱导18h后BMSCs胞体收缩,有突起伸出,24 h后突起增多呈网状.免疫细胞化学染色,NSE阳性表达率为(53.3±4.3)%,GFAP阳性表达为(64.5±5.2)%,流式细胞仪检测诱导24 h后的细胞NSE及GFAP表达量均较未诱导组升高,RT-PCR检测诱导后细胞表达NSE、GFAP,未诱导的细胞则不表达.结论葛根素可诱导大鼠骨髓间充质细胞在体外分化为神经元和神经胶质细胞.     

依达拉奉体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的 采用密度梯度离心和差速贴壁法体外分离、培养、纯化及鉴定成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,利用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和依达拉奉联合诱导MSCs定向分化为神经元样细胞。 方法 选用1月龄健康雄性Wistar大鼠,采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓中的MSCs,通过差速贴壁法反复传代培养、纯化,取第3代细胞采用流式细胞术、免疫细胞化学等方法检测MSCs的纯度,利用bFGF联合依达拉奉诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过扫描电镜、免疫细胞化学等对诱导后的细胞进行鉴定。结果 第3代MSCs经免疫细胞化学及流式细胞仪等检测,间充质干细胞特异性的标记物CD44表达阳性,不表达造血干细胞及白细胞的特异性标记物CD34、CD45,MSCs纯度高达955%。诱导分化后扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫细胞化学检测发现,细胞表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）,不表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）,Nestin的表达随着细胞成熟而减弱。 结论 密度梯度离心和差速贴壁法可获得高纯度的MSCs;依达拉奉能高效地定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离和培养方法,并用黄芪体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞样细胞。方法利用梯度离心从大鼠骨髓中分离单核细胞进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化,对其生长特性进行分析。采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经细胞样细胞,观察细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果用含10%胎牛血清(FCS)的培养基培养,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆团形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,有较强的增殖能力。经黄芪诱导后,骨髓间充质干细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,在一定条件下向神经样细胞分化。     

初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞中的作用

目的:研究初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法:全骨髓贴壁法分离、培养、纯化MSCs.含15 μmol/L白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫印迹检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.免疫荧光法检测MSCs增殖情况.扫描电子显微镜检测MSCs表面初级纤毛,免疫荧光法检测初级纤毛蛋白(Ac-Tu)的表达.结果:白藜芦醇诱导后60％的细胞胞体收缩,立体感增强,类似神经元.免疫印迹显示MSCs及对照组细胞有NSE蛋白的轻度表达,诱导后NSE、MAP-2蛋白表达阳性,随着诱导时间延长,NSE、MAP-2的表达渐增强.经过24 h饥饿后,90％的MSCs处于生长静止状态.扫描电子显微镜及免疫荧光显示,处于生长静止期的MSCs具有初级纤毛,且白藜芦醇可诱导具有初级纤毛的MSCs分化为神经元样细胞.对照组则无明显变化.结论:白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞.在此过程中,初级纤毛可能发挥着重要作用.     

隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的： 体外培养猴骨髓间质干细胞（MSCs）并定向诱导分化为神经元样细胞。 方法： 体外分离培养猴MSCs，流式细胞仪检测其表面标志，用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果： 体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166，并且具有正常的二倍体核型，不随传代而发生改变。bFGF预诱导24 h 后，隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞，免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性，阳性率分别为68.3％±3.5％、70.3％±1.5％，而GFAP表达阴性。 结论： 隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

骨髓基质干细胞诱导成神经元样细胞分化相关基因的表达

目的:分析骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达。方法:用β-巯基乙醇诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化,诱导后8 h,提取诱导前后的骨髓基质干细胞mRNA,进行微管相关蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、中间丝nestin和神经丝(NF)基因的RT-PCR,观察其诱导前后的表达。结果:NSE在诱导前后均有表达, MAP-2、GAP-43、nestin和NF诱导前无表达, 诱导后有表达。结论: 骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化与MAP-2、GAP-43、nestin和NF可能有关。     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞分化中神经蛋白分子及相关基因的表达情况。方法:分离提取大鼠的MSCs,体外培养扩增。用含丹参的无血清的L-DMEM培养基进行诱导,并以不含丹参的无血清L-DMEM培养基作为对照。提取两组的MSCs总RNA,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达。结果:丹参诱导90 min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起。免疫细胞化学显示诱导后的MSCs表现为nestin、NSE、GFAP染色阳性,对照组为阴性。未经诱导的MSCs ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。结论:丹参可诱导大鼠MSCs向神经前体细胞和神经细胞分化。MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。     

骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

黄连素诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:黄连素体外定向诱导SD大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。方法:用全骨髓细胞悬液体外扩增和纯化骨髓间质干细胞。选用第5代以后骨髓间质干细胞进行诱导分化,用含10 μg/L碱性细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24 h,后更换含黄连素的无血清DMEM诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元烯醇酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞体外扩增第5代后细胞形态达到均一,成梭形。加黄连素诱导1h-8 h,间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,形似神经细胞。免疫组化显示诱导的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论:黄连素可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后免疫原性研究

目的:通过体外天麻诱导人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)向神经元样细胞分化,验证其多能分化特性,检测分化后细胞的免疫原性.方法:通过贴壁法分离hMSCs,体外扩增培养.天麻定向诱导分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.流式细胞术(FCM)检测分化后细胞HLA-DR表达,用单向混合淋巴细胞反应(MLR)的方法检测神经细胞分化的hMSCs是否引起人外周血淋巴细胞增殖反应(Human peripheral blood lymphocytes,hPBLs).结果:hMSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.天麻诱导3小时后大部分hMSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起.免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性.流式细胞术显示hMSCs向神经细胞分化后HLA-DR表达阴性,混合培养结果也显示分化hMSCs不引起hPBLs增殖反应.结论:天麻可在体外诱导hMSCs分化为神经元样细胞,分化hMSCs不引起人淋巴细胞增殖反应,具有低免疫原性.     

人脐带间充质干细胞的富集及向神经细胞的诱导分化

目的:寻找一种稳定、高效的分离人脐带间充质干细胞(MSCs)的方法,并探讨脐带MSCs向神经细胞方向分化的可能性。方法:分别采用组织块贴壁法和双酶消化法分离人脐带MSCs,对比其培养成功率;BrdU掺入实验检测脐带MSCs的增殖能力;流式细胞仪检测脐带MSCs表面分子标志;采用丹参联合生长因子的方法诱导其向神经细胞分化,免疫荧光方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:组织块贴壁法获得脐带MSCs成功率高;BrdU阳性标记率达90%以上;流式细胞仪检测显示细胞表达CD29、CD44和CD90,不表达CD34;脐带MSCs经诱导分化,伸出长突起,呈神经元样细胞改变,且表达神经元标志性蛋白NSE、MAP2。神经胶质细胞标志性蛋白GFAP表达较少。结论:成功建立了高效、稳定的脐带MSCs分离培养方法。脐带MSCs经诱导可向神经细胞方向分化,为临床移植治疗神经系统疾病提供了理想的细胞来源。     

氯化锂通过调节自噬通路促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的:研究氯化锂(Li Cl)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)神经分化的影响,并探讨自噬通路在其中的作用。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,细胞分为Li Cl组和对照组,采用β-巯基乙醇诱导MSCs向神经细胞分化,免疫荧光法和Western blot法检测诱导后神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)以及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达变化。进一步采用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预自噬,Western blot法观察NSE和MAP-2的表达变化。结果:诱导分化后,Li Cl组及对照组细胞均有NSE和MAP-2表达,Li Cl组细胞NSE和MAP-2蛋白阳性表达率及表达量均大于对照组(P0.05);此外,Li Cl组细胞LC3阳性荧光点以及LC3-Ⅱ表达量亦多于对照组(P0.05)。加用雷帕霉素可进一步促进Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05),而3-MA则抑制Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05)。结论:氯化锂可能通过调节自噬通路促进大鼠骨髓骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

成人骨髓间质干细胞定向诱导为神经元样细胞的研究

目的：体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：采用Ficoll-Paque液（1.077×10³ g/L）离心分离成人MSC,体外扩增,分别采用含巯基乙醇和硫代甘油等试剂的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：成人骨髓间质干细胞在体外扩增5代可获5×10⁷个细胞。加入巯基乙醇等或硫代甘油等诱导剂诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论：成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。