BIOMED-2多重聚合酶链反应检测抗原受体基因重排在淋巴增殖性疾病诊断中的应用

目的 建立敏感而有效的检测免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因重排的方法,并探讨在淋巴增殖性疾病诊断和鉴别中的作用.方法 采用BIOMED-2多重聚合酶链反应,检测来自54例淋巴增殖性疾病患者的58份淋巴组织标本,分析抗原受体基凶重排状况及其克隆来源.结果 在88.0%(25份标本中22份)B细胞淋巴瘤/白血病和53.3%(15份标本中8份)T细胞淋巴瘤中检出Ig/TCR呈单克隆重排;在17例淋巴组织非恶性增殖患者的病理活检标本中,14例(82.4%)呈多克隆重排;在合格的57份标本中有44份(77.2%)的结果与最终诊断相符.联合检测Igλ和TCRδ并未提高Ig/TCR单克隆重排的检出率,但可能有助于Igλ和TCRδ+淋巴瘤的诊断.结论 对于分析淋巴增殖性疾病,尤其是不典型病例的克隆来源状况,BIOMED-2多重聚合酶链反应检测抗原受体基凶重排是迅速、敏感而可靠的方法.     

逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。     

采用PCR检测淋巴结细胞IgH和TCRγ基因重排对淋巴增殖病的诊断意义

采用PCR体外基因扩增技术研究10例活检淋巴结细胞IgH和TCRγ基因重排,并与组织病理和免疫表型分析进行了对比研究。结果表明:6例病理诊断为非何杰金淋巴瘤(NHL)者中,4例发生相应的IgH或TCR_γ基因克隆性重排,与免疫表型分析一致,另2例同时发生了IgH和TCR_γ基因双重重排。2例病理诊断为坏死性淋巴结炎者,免疫表型分析起源于B细胞,均检测到IgH基因克隆性重排,证明系克隆性恶性B淋巴细胞增殖。表明用PCR检测IgH和TCR_γ基因重排,对恶性淋巴细胞增殖病诊断的敏感性和特异性高于组织病理学和免疫表型分析,具有重要临床应用价值。     

基因重排分析在恶性淋巴瘤早期诊断中的应用

基因重排分析在恶性淋巴瘤早期诊断中的应用宋强张明珙宋素芹王鲁群李杰我们在单克隆抗体免疫学分型的基础上，采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术，检测了２０例病理形态学诊断为良性淋巴结增殖性疾病患者的ＩｇＨ和ＴＣＲγ基因重排，以期早期诊断恶性淋巴瘤，现将结果报告...     

基因重排检测在恶性淋巴瘤诊断中的应用

恶性淋巴瘤是指淋巴细胞在发育不同阶段发生的恶性肿瘤。由于其形态和分类上的复杂性,仅凭形态学和免疫组织化学观察有时很难确定肿瘤的良恶性及类型。分子生物学技术检测淋巴组织基因重排克隆性,已经成为恶性淋巴瘤诊断中不可缺少的部分。现将淋巴组织基因重排检测在恶性淋巴瘤诊断中的应用现状综述如下。1基因重排检测恶性淋巴瘤的理论基础免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因有特殊的重排现象。这两个基因结构相似,都由可变区(Variable region,V区)、高变区(Diversity region,D区)、连接区(Joining region,J区)和恒定区(Con-stant r…     

乙、丙型肝炎病毒感染与淋巴细胞恶性增殖性疾病的相关性

淋巴细胞恶性增殖性疾病(malignant lymphocytic pro- liferation disease,MLPD)主要包括淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴细胞白血病(AIL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞性白血病等,它们的共性是淋巴细胞的恶性增殖。文献报道MLPD可能与乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染有关。本文就两者的相关性及其研究成果综述如下。     

聚合酶链反应检测克隆性免疫球蛋白重链基因重排

目的 建立较简便、敏感的Ｂ细胞恶性肿瘤微小残留病（ＭＲＤ）检测方法。 方法 根据免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因的保守序列设计引物，应用半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）基因扩增技术检测克隆性ＩｇＨ基因重排。结果 该方法敏感性达１０＾－３。６２例Ｂ细胞恶性肿瘤患者，５１例检测到克隆性ＩｇＨ基因重排，阳性率为８２％，假阴性率为１８％（１１／６２）。同时检测３５例非Ｂ细胞恶性肿瘤患者和２０例正常人均阴性，无假阳     

PCR技术检测骨髓增殖性疾病bcr／ablmRNA表达

慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症及原发性骨髓纤维化均为造血多能干细胞缺陷的骨髓增殖性疾病,有时可互相伴随及转化。90％以上的慢粒患者存存Ph′染色体,其分子生物学基础是22号染色体上的断裂点簇区域(bcr)基因片段与9号染色体上的abl基因异位融合所致。近年来应用RT/PCR技术检测bcr/abl mRNA,其     

聚合酶链反应检测克隆性免疫球蛋白重链基因重排

目的建立较简便、敏感的Ｂ细胞恶性肿瘤微小残留病（ＭＲＤ）检测方法。方法根据免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因的保守序列设计引物，应用半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）基因扩增技术检测克隆性ＩｇＨ基因重排。结果该方法敏感性达１０－３。６２例Ｂ细胞恶性肿瘤患者，５１例检测到克隆性ＩｇＨ基因重排，阳性率为８２％，假阴性率为１８％（１１／６２）。同时检测３５例非Ｂ细胞恶性肿瘤患者和２０例正常人均阴性，无假阳性。检测１４例Ｂ细胞非何杰金淋巴瘤患者形态学检查正常的骨髓标本，ＭＲＤ检出率为７１％（１０／１４）。随访５例处于完全缓解期的Ｂ细胞型急性淋巴细胞白血病患者，６个月内ＭＲＤ均阳性，１２个月后３例转阴性，２例持续阳性，１８个月后持续阳性的２例患者均复发，而转阴性的３例仍处于完全缓解状态。结论半巢式ＰＣＲ检测克隆性ＩｇＨ基因重排，方法简便，敏感性和特异性高，可用于Ｂ细胞恶性肿瘤ＭＲＤ检测     

抗原受体基因寡/亚克隆重排和克隆演化的研究进展

抗原受体基因如免疫球蛋白重链（IgH）及T细胞受体（Tea）的可变区（V）和连接区（J）片段在干细胞向淋巴系分化时会发生特异性重排，形成V-D-J片段，不同淋巴细胞其V—D—J重排方式是不同的。因此重排后形成V—D—J片段是每个淋巴细胞克隆特有的基因标志。淋巴系肿瘤为单克隆起源，因此其IgH／TCR基因重排方式是单一的，经聚合酶链反应（PCR）或Southern杂交等方法检测可出现特征性的重排带。可作为淋巴系肿瘤克隆的独特基因标志，已较广泛应用于淋巴系肿瘤微小残留病（MRD）及基因分型等研究。但多重研究显示应用DNA印迹法及以PCR等方法检测发现在相当一部分淋巴系统肿瘤患者中存在2种或2种以上的抗原受体基因（IgH和／或TCR）重排方式，而且在随后疾病的发展过程中，     

荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因重排标准品质粒及标准曲线的构建

目的：构建荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因标准品重组质粒和标准曲线，为建立实时荧光定量PCR准确检测淋巴系肿瘤微小残留病奠定基础。方法：对TCR VγI-Jγ基因进行序列分析，利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针。提取急性淋巴细胞白血病患者的DNA，经PCR扩增，产物纯化后与pMD 18-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到标准品的质粒。结果：重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长，表明TCR VγI-Jγ基因已成功克隆。以10^0～10^-5不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增，Ct值分别为21．08、24．34、27．53、30．58和33．25。统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系，回归系数为0．998。结论：所构建的TCR VγI-Jγ基因荧光定量PCR检测标准品特异性和线性关系好，准确可靠，利于统一标准。     

IgH基因重排PCR分析在淋巴组织细针穿刺中的辅助诊断价值

目的 探讨Ign基因重排检测在细针穿刺诊断淋巴组织病变中的价值.方法 收集淋巴组织细针穿刺病例159例,应用半巢式PCR检测IgH基因重排.将基因重排检测结果与细胞学诊断及组织学随访结果进行比较.结果 穿刺标本中,IgH基因重排检测B-NHL阳性率为72.22%,RH阳性率仅为3.92%.本法敏感性为72.22%,特异性达到96.08%.结论 IgH基因重排检测对辅助淋巴组织细针穿刺标本的良、恶性判断具有一定价值,并且单克隆性结果更有意义.但在淋巴瘤和转移性非淋巴细胞恶性肿瘤的鉴别上不建议应用.     

实时荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病患者TCR VγI-Jγ基因重排

目的　探索提高急性淋巴细胞白血病 (ALL)微量残留病 (MRD)检测技术。方法　构建实时荧光定量聚合酶链反应 (PCR)检测TCRVγI Jγ基因重排技术并定量分析 36例ALL患者的检测结果。结果　建立的实时荧光定量PCR方法的灵敏度为 10 -4水平。 36例患者荧光定量PCR方法检测结果初治组为 (7.38± 6 .6 5 )× 10 -2 ,完全缓解 (CR)组为 (1.0 2± 1.0 8)× 10 -2 ,造血干细胞移植(HSCT)组为 (3.89± 5 .6 5 )× 10 -3 。CR组和HSCT组TCRVγI Jγ基因重排水平显著低于初治组 (P值均为 0 .0 0 1) ,HSCT组MRD水平显著低于CR组 (P <0 .0 5 )。 6例HSCT后检测阳性病例中 2例MRD水平 <1× 10 -3 ,获长期无病生存 ,另 4例MRD水平较高患者一年内均出现复发。结论　所建立的实时荧光定量PCR方法简便、快速、灵敏及特异 ;实时荧光定量检测缓解期ALL患者MRD水平对预测预后有一定的意义     

成人急性T淋巴细胞白血病T淋巴细胞受体β链基因重排的特点及其在微小残留病定量检测中的意义

目的 建立以TCR β基因重排为分子标志,基于ASO引物的RQ-PCR方法,检测成人T-ALL患者的TCR β基因重排,以利于动态监测患者的MRD.方法 20例成人T-ALL患者的初诊DNA标本经多重PCR检测方法设计38条引物,分成3管,分别扩增TCR β基因完全重排和不完全重排,克隆产物经电泳和双色基因扫描鉴定.对其中4例患者进行基因测序和序列比对分析,根据克隆特异性序列信息,利用软件设计4条ASO引物,作为RQ-PCR检测的上游引物,合成通用的Jβ下游引物和TaqMan探针,对患者的随访标本定量监测MRD.结果 20例患者中有17例可检测到克隆性TCR β基因重排,克隆检出率为85.0%(17/20).其中16例可检测到至少1个Vβ-Jβ完全重排(94.1%,16/17),7例患者有Dβ-Jβ的不完全重排(41.2%,7/17),完全Vβ-Jβ和不完全Dβ-Jβ重排之间的比例约为2∶1.双色基因扫描分析显示Jβ2家族的使用频率为73%,Jβ1家族的使用频率为27%,Jβ2家族的使用频率明显高于Jβ1家族.4例患者使用ASO引物RQ-PCR扩增TCR β重排靶基因的标准曲线的斜率为-3.60～-3.27,相关系数＞0.99,敏感性达4×10-5μg/μl,荧光背景信号不显示或较低.监测4例T-ALL患者在疾病治疗各随访时间点的TCR β重排靶基因水平,包括诱导完全缓解、巩固治疗等时间点,RQ-PCR显示其MRD水平随病情的缓解呈逐渐下降的趋势.结论 以克隆性TCR β基因重排为靶分子的特异性寡核苷酸引物RQ-PCR方法可对T淋巴细胞系统的恶性克隆进行准确定量,适用于成人T-ALL患者MRD的随访监测.     

利用PCR衍生技术检测血液系统疾病

PCR技术给血液病的诊断带来了革命性的进展,已经成为临床急性和慢性白血病基因分型,骨髓增殖性疾病确诊,海洋性贫血、血友病等多种血液遗传病的诊断不可或缺的基本技术.在PCR基础上,已经发展了包括多重巢式PCR、荧光实时定量PCR(Q-PCR)、变性高压液相色谱分析(DHPLC)、毛细管电泳、分子杂交和直接测序等方法.多重巢式PCR可检测多种白血病基因,确定白血病的类型.Q-PCR有效地解决了PCR污染的问题,可以监测白血病微小残留病.毛细管电泳法更适于基因片段长度有变化的基因突变.DHPLC适用于大批量标本的突变筛查.PCR产物的直接测序可靠性强,已经用于常规诊断.     

单灶透明血管型Castleman''s病病理细胞起源研究

目的　从基因水平了解 6例Castleman’s病 (CD)病理细胞组成特点。方法　肿物切除以后 ,苏木精 伊红染色作常规组织病理检查以明确肿物的组织学类型 ;应用免疫组化法研究细胞表型 ,明确肿物的细胞组成 ;根据细胞组成 ,应用RT PCR和克隆测序方法了解肿物主要细胞克隆组成。结果　 6例患者皆为限局性透明血管型CD ;肿瘤组织滤泡样结构中主要为B淋巴细胞 ,滤泡间隙为T淋巴细胞。RT PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到单一条带 ,RT PCR产物克隆测序得到12 8bp、12 2bp两种碱基长度的克隆 ,相同长度序列间具有高度一致性 ,克隆内分别存在 12个和 7个碱基的差异。结论　 6例患者肿瘤组织中含有单 /寡克隆瘤性B细胞 ,这些B细胞起源于生发中心细胞。     

半巢式聚合酶链反应方法检测弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl-2/IgH基因重排

目的寻找一种敏感、特异的方法检测弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）bcl-2／IgH基因重排，并通过测定产物的序列，以了解所建方法的可靠性、方法运用专业引物设计软件设计bcl-2／IgH基因重排半巢式PCR引物，对52例经临床病理确诊的DLBCL石蜡包埋组织及10例慢性扁桃体炎患者的新鲜扁桃体组织通过半巢式递降温度梯度PCR（touch down PCR）扩增，检测bcl-2／IgH基因重排，并对其产物进行克隆和序列分析。结果 通过一步法检测到bcl-2／IgH基因重排8例，其中DLBCL6例，新鲜扁桃体组织2例；进行第2次半巢式PCR时仅在DLBCL中发现5例阳性，新鲜扁桃体组织均阴性。将阳性产物在网上序列分析显示：一步法检测到的8例中有3例为假阳性，而半巢式PCR扩增出的5例均为bcl-2／IgH基因重排片段。3例假阳性的片段分别与人类第19号染色体BAC331191，LLNLR-245D11基因片段及1号染色体RP11-498P10基因片段同源。结论常用的检测bcl-2／IgH基因重排引物扩增结果存在一定假阳性，其机制可能是因为人类基因组中存在与常用引物同源性较高的序列。为研究设计的引物与传统的引物结合，进行半巢式PCR可以排除这种假阳性扩增，提高诊断的准确性。     

缺失型α—地中海贫血中的基因诊断新技术研究

目的 建立诊断我国最常见的三种缺失型α-地中海贫血（α-地贫）,即东南亚型缺失（--^SEA)、右侧缺失（-α^3.7)和左侧缺失（－α^4.2)的PCR技术。方法 设计三组PCR引物,优化PCR反应条件,运用PCR、琼脂糖凝胶电泳、UVP凝胶成像技术,根据电泳图谱检测并诊断三种缺失型α-地贫。结果 成功地检测这三种缺失型的纯合子、杂合子或双重杂合子,结果与Southern blotting分析一致。完成42例α-地贫样本的基因诊断。结论 本研究所建立的检测α-地贫缺失型的技术,准确、简便、重复性好,便于推广应用。     

首次发现国人先天性双侧输精管缺如CFTR基因突变

目的：探讨囊性纤维化跨膜转运调节物（ＣＦＴＲ）基因在国人先天性双侧输精管缺如患者中的突变频率及热点。方法：应用ＰＣＲ－单链构象多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）及ＤＮＡ邓技术,对３２例先天性双侧输精管缺如患者ＣＦＴＲ匪帮经２,３,４,５,６ａ,８,１０,１１,１２,１３,１５Ａ,１７ｂ,１９Ａ,２０,２１,２３外显子区域上的突变进行筛查,结果：１例患者在１０号外显子第１６５３至１６５５位三个碱基ＴＴＴ缺失,