抗人CD4单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现的一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｖＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性。     

抗TNF-α人单链抗体的分离纯化及鉴定

目的对通过大容量抗体库中筛选到的4株抗TNF-人单链抗体进行分离纯化及鉴定。方法采用硫氰酸盐洗脱ELISA法评估阳性克隆的亲和力;亲和层析柱纯化抗体;通过ELISA检测抗体的特异性结合活性;用L929细胞检测其体外中和TNF-α的活性。结果用硫氰酸盐洗脱法测定4个噬菌体抗体的相对亲和力与其相应的可溶性抗体相对亲和力相一致;SDS-PAGE电泳结果表明,单链抗体得到成功纯化;ELISA结果表明,纯化的抗体能够特异性结合人TNF-α;体外中和试验证明筛选到的单链抗体能中和TNF-α对L929细胞的毒性。结论从人源大容量噬菌体抗体库中能够筛选到具有中和活性的抗TNF-α人单链抗体。     

抗人CD3单链抗体的构建、表达及纯化

采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从鼠抗人CD3杂交瘤细胞WuT3中扩增克隆出抗体重、轻链可变区基因,测序结果证实:V_H属鼠抗体重链可变区亚组Ⅱ(β)、V_L属鼠抗体Kappa轻链可变区亚组Ⅵ.将V_H、V_L基因片段克隆到单链抗体表达载体POPE51中,使V_H、V_L基因片段分别直接与一多肽连接子的两端相连,构建成单链抗体(ScFv)基因.克隆筛选证明,阳性克隆近100%.细菌用20μmol/L IPTG诱导培养,经固定金属离子亲和层析和分子筛凝胶过滤,从细胞间质中提取纯化ScFv,每升培养液可获得5mg纯度大于90%的ScFv.FACS活性检测结果表明,纯化的WuT3 ScFv与亲代结果一致.     

抗人整合素αυβ3单链抗体的构建和表达

目的：利用基因工程抗体技术构建抗人整合素αυβ3单链抗体(scFv)。方法：从分泌抗人整合素αυβ3单抗(mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中，用RT-PCR扩增VH和VL基因，对其核苷酸序列分析后，通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3 组装成scFv基因，并克隆至原核表达载体pTIG—TRX中。以重组子转化大肠杆菌B121(DE3)诱导目的基因表达。结果：转化菌可表达相对分子质量(Mr)为31000的scFv。Western blot证实，具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养，scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni—NTA琼脂糖层析纯化后纯度达91％以上。ELISA鉴定证实，scFv具有良好的抗原结合活性。结论：成功地构建并表达抗人整合素αυβ3的scFv，为进一步临床研究奠定了基础。     

抗人CD86单链抗体的基因克隆、表达及结合活性分析

目的 构建并在CHO细胞中表达抗人CD86单链抗体(CD86-scFv),研究该抗体与抗原的结合特性及介导的生物学功能.方法 从分泌鼠源CD86抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL基因,构建含有前导肽L-VH-Linker-VL抗体编码基因的表达载体并转染CHO细胞.经筛选高分泌株并扩大培养后收集上清进行纯化.流式细胞术分析CD86-scFv对不同细胞膜型CD86分子的识别及与鼠源亲本抗体1D1的竞争抑制效应.MTT法分析CD86-scFv与Raji细胞表达的CD86结合后对细胞生长的影响.结果 获得了稳定表达抗人CD86-scFv的CHO细胞株及相应抗体.CD86-scFv与CD86基因转染细胞株L929-CD86、天然表达CD86分子的人B系淋巴瘤细胞Raji和Daudi细胞的阳性结合率分别为67.0％、72.3％和80.5％.CD86-scFv对鼠源亲本抗体1D1具有竞争结合能力,将CD86-scFv(终浓度20μg/mL)加入Raji细胞共同培养72 h时的细胞生长抑制率为28.3％.结论 成功构建了稳定分泌抗人CD86-scFv的CHO细胞株(命名为SA-IV).该抗体能够识别CD86分子并具有良好的生物学活性.     

抗人整合素ανβ3单链抗体的构建和表达

目的 :利用基因工程抗体技术构建抗人整合素ανβ3 单链抗体(scFv)。方法 :从分泌抗人整合素ανβ3 单抗 (mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中 ,用RT PCR扩增VH 和VL 基因 ,对其核苷酸序列分析后 ,通过PCR在VH 和VL 基因间插入柔性连接子(Gly4Ser) 3,组装成scFv基因 ,并克隆至原核表达载体pTIG TRX中。以重组子转化大肠杆菌BL2 1(DE3 )诱导目的基因表达。结果 :转化菌可表达相对分子质量 (Mr)为 3 10 0 0的scFv。Westernblot证实 ,具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养 ,scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖层析纯化后纯度达 91%以上。ELISA鉴定证实 ,scFv具有良好的抗原结合活性。结论 :成功地构建并表达抗人整合素ανβ3 的scFv ,为进一步临床研究奠定了基础。     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的表达

在以前的工作中 ,我们利用本研究室制备的抗胶质瘤单克隆抗体ＳＺ39通过化学偶联的方法制备了抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体 ,并在体外细胞毒及荷瘤动物体内试验中取得较好疗效[1,2 ] ,但存在着分子量大 ,穿透力弱 ,免疫原性强 ,制备困难等缺点。因此 ,研制小分子 ,低免疫原性的人源化抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体是我们正在开展的研究项目之一。目前我们已构建并原核表达了抗胶质瘤单链抗体ＳＺ39 ＳｃＦｖ。本研究构建并表达的人源化抗ＣＤ3单链抗体 ,旨在为下一步制备高效低毒的抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个理想的构件。1　材…     

抗GD2/抗CD16单链双特异性抗体的构建及在大肠杆菌中的表达

利用重叠PCR(overlap-PCR)将抗GD2表面抗原GD2的单链抗体基因m-ScFv和抗CD16的单链抗体基因NM3E2融合在一起,得到新型的单链双特异性抗体基因n-m,双抗的联接肽序列为SerGly4Ser,在肽连的C端引入了6×his以利于纯化。该双特异性抗体基因的序列经测序验证后,连接表达载体pET-22b( ),转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),诱导表达,凝胶成像系统扫描显示表达的外源融合蛋白约占菌体总蛋白的27%。表达蛋白分泌于胞质空间,经超声波破胞后收集上清,经Ni 亲和层析柱分离,纯度可达90%以上。经SDS-PAGE及Westernblotting鉴定表达蛋白的分子量为53KD,与预期的相符。     

抗人肝癌单链抗体HAb25-scFv的构建及其表达

目的构建和原核表达抗人肝癌单链抗体HAb25-scFv,为其进一步的临床应用研究奠定基础。方法采用（Gly4Ser）3为连接肽,在pUC19质粒上构建HAb25-scFv单链抗体基因;序列分析证实后将HAb25-scFv基因亚克隆入pGFX4T-1GST融合表达载体上,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物并建立目的蛋白的纯化方法;免疫荧光竞争实验鉴定HAb25-scFv单链抗体的活性。结果序列分析证实在pUC19质粒上以（Gly4Ser）,连接肽成功构建了HAb25-scFv单链抗体基因;HAb25-scFv单链抗体基因在pGEX-4T-1 GST融合表达载体中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的60．8％;经GST亲和层析柱,可获得纯度达95.2％的GST-HAb25-scFv融合蛋白;免疫荧光竞争实验证实HAb25-scFv单链抗体具有与其亲本抗体相同的抗原结合特性,并至少保留了亲本抗体39．12％的亲合力。结论获得了HAb25-scFv单链抗体基因,并在原核GST融合表达系统中实现了HAb25-scFv的高效表达,免疫荧光竞争实验证实HAb25-scFv较好地保留了其亲本抗体的特异性和亲和力。     

抗人VEGF165单链抗体的构建与表达

为降低鼠源抗体对人体的免疫原性,构建表达了ＶｍＤ１１的单链抗体。方法用ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ构建出单链抗体的基因,克隆入表达载体ｐＫｐＬ－３ａ,在大直菌ｏｐｏ２１３６中表达,采用抗原结合ＥＬＩＳＡ和竞争抑制ＥＬＩＳＡ测定活性。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测,诱导后的细菌表达了２６ｋＤ的蛋白;ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实该蛋白为表达的单链抗体。经变性,复性后,该单链抗体可特异结合人ＶＥＧＦ１６５抗原,并与Ｖ     

HIV—1整合酶单链抗体在大肠杆菌中的表达,纯化与鉴定

将具有ＨＩＶ－１整合酶结合活性的单链抗体重组噬菌感染ＨＢ２１５１大肠杆菌，经ＩＰＴＧ诱导，在周质腔萃取物及培养基上清中，均检测到有较特慢与整合酶结合的可溶性单链抗体的表达，利用ＨｉＴｒａｐＡｎｔｉ－Ｅｔａｇ柱对单链抗体进行了亲和层析纯化，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ结果初步表明，单链抗体不仅可与整合酶的单体反应，而且也可与茯二聚体结合，提示：研制的单链抗体可用于对ＨＩＶ－１整合酶活性影响的研究。     

抗人CD80单链抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人CD80单链抗体(ScFv),并初步研究其生物学功能。方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80mAb的杂交瘤细胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压筛选。纯化抗CD80-ScFv,并分析其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗CD80-ScFv对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。结果:构建的抗CD80-ScFv基因全长为828 bp,经测序含有信号肽和连接肽。实验获得稳定表达细胞株SA-Ⅱ,其培养上清与L929-CD80细胞的阳性结合率达98%以上。抗体纯化后产率约为15.12 mg/L,其能够识别Raji和Daudi细胞天然表达的CD80分子,结合率分别为96.6%和95.0%。抗CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。结论:成功建立了抗CD80-ScFv CHO细胞的表达株(命名为SA-Ⅱ),该抗体能够特异识别细胞表面膜型CD80分子并介导相应的生物学功能。     

抗人红细胞H抗原单链抗体基因克隆和表达

目的 克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达.方法 从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2FA中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗原单克隆抗体的VH、VL基因;利用重叠引物延伸法(splicing by overlap extension,SOE)将轻重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker)编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因,将其克隆到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,IPTG诱导表达;获得的目的蛋白经纯化后,用SDS-PAGE与Westem blotting对目的蛋白进行鉴定,间接EHISA、竞争ELISA和免疫荧光法检测目的蛋白的活性.结果 克隆的VH基因长度为351 bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I(B)亚群;VL基因长度为339 bp,属于鼠抗体可变区轻链基因家族I亚群;SOE法克隆的单链抗体基因为750 bp;构建的含原核表达载体的菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting法检测到Mr 32 000的目的蛋白(表达的ScFv);ScFv纯化后,经免疫荧光法、间接与竞争HLISA法检测到该ScFv蛋白具有生物结合活性.结论 成功地克隆了抗人红细胞H抗原单克隆抗体VH与VL基因和ScFv基因,构建ScFv基因的表达载体,实现了ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞中的活性表达,为基于红细胞H抗原的免疫检测技术建立奠定了基础.     

β-淀粉样蛋白单链抗体表达和纯化条件的优化

目的:优化β-淀粉样蛋白单链抗体(scFv)的诱导表达和纯化条件。方法:在固定诱导表达时间和诱导表达温度的条件下,采用不同终浓度的IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析全菌液总蛋白中目的蛋白E3 scFv的表达水平,确定所需诱导剂IPTG的最佳浓度。在目的蛋白结合到亲和层析柱之后,采用不同终浓度的咪唑溶液进行洗脱,通过收集各管洗脱液、Western blot等方法确定预洗脱液咪唑的最佳浓度。结果:E3 scFv在20℃诱导表达18 h时,所需诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1 mmol/L;纯化时,预洗脱液咪唑的最佳浓度为10 mmol/L。结论:通过优化上述条件,我们建立了一个高效表达及纯化E3 scFv的方法,为后续的研究奠定了基础。     

人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的原核表达及鉴定

目的:在原核细胞中构建并表达抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3,并鉴定其活性。方法:用PCR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因,将scFv3 DNA与pGEM-T Easy质粒连接,构建克隆载体pGEM-scFv3。用酶切后电泳鉴定构建载体的正确性;测序检测质粒重组后序列有无改变。再将scFv3亚克隆入表达载体pQE-80L,构建pQE80L-scFv3重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,酶切鉴定。IPTG诱导表达蛋白后,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的抗体活性。结果:PCR扩增scFv3 DNA片段约为750 bp,与预期结果相同;克隆载体pGEM-scFv3酶切后显示scFv3成功的克隆入pGEM-T Easy质粒;测序验证插入片段全序列无改变;表达载体pQE80L-scFv3酶切图谱与预期相同;SDS-PAGE显示,在分子量约为27 kD处可见目的蛋白带,Western blot证实scFv3能与抗GBM抗体结合。结论:成功构建并表达了抗GBM抗体的单链抗体scFv3蛋白,为进一步研究scFv3的生物学特性和基因工程抗体的制备奠定了基础。     

抗人精浆蛋白/抗CD3双特异性单链抗体的活性研究

目的:构建并表达抗人精浆蛋白/抗CD3的双特异性单链抗体(BsscFv),并检测其生物学活性。方法:利用重叠延伸拼接PCR,拼接抗人精浆蛋白scFv基因和抗CD3scFv基因,并在中间引入柔性短肽(GlySerGly)2,构建抗人精浆蛋白/抗CD3的BsscFv基因。测序正确后,将融合基因亚克隆入真核表达载体中,并在HeLa细胞中进行表达,采用流式细胞术(FCM)和51Cr释放试验,评价BsscFv的抗原结合活性和体外介导的特异性杀伤靶细胞的效应,以及利用裸鼠前列腺癌模型观察其在体内的抑瘤作用。结果:测序分析证实,Bss-cFv基因片段的大小为1.5kb,编码500个氨基酸,该序列与设计的完全一致。SDS-PAGE和Westernblot分析证明:表达产物存在于HeLa细胞的培养上清中,其相对分子质量(Mr)为61000。FCM结果显示:BsscFv可特异性的结合前列腺癌细胞LNCaP和CD3 淋巴瘤细胞Jurkat,结合率分别为54.1%和53.7%。体外实验表明,BsscFv可介导CTL对LNCaP细胞的杀伤。与对照组相比较,接种LNCaP的裸鼠在体内注射激活的CTL和BsscFv治疗后,肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05)。结论:抗人精浆蛋白/抗CD3的BsscFv具有一定的生物学活性,在体内、体外均可介导CTL杀伤靶细胞LNCaP。     

抗人CD3单链抗体基因的构建及序列分析

本文在已克隆抗人ＣＤ３抗体ＶＨ和ＶＫ基因的基础上，设计并合成了ＰＣＲ引物。两个外侧引物分别含有ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ酶切位点及起始码和终止码序列，４个内侧引物各含部分连肽基因序列，回收后混合退火。     

抗人肝癌单链抗体的基因克隆和分泌型表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从分泌抗人肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＡｂ１８中，扩增出抗体ＶＨ和ＶＬ连接肽基因，将ＶＨ和ＶＬ连接成ＳｃＦｖ基因，并进行序列测定，结果表明，ＶＨ，ＶＬ，ｌｉｎｋｅｒ拼接正确，基因全长为７２６ｂｐ。用噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ在大肠杆菌中表达了可溶性的ＳcＦｖ融合蛋白，经流式细胞仪分析表达产物可特异地与肝癌细胞结合，而不与正常肝细胞及胃癌细胞结合。     

人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达

目的：用巴氏毕赤酵母表达人源性抗角蛋白单链抗体。方法：从已构建好的质粒p3MH／ScFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体p^PIC9K，构建成重组质粒p^PIC9K／ScFv，并测序鉴定。通过电转将重组质粒p^PIC9K／ScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GS115的染色体上。经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后，用含0．5％甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果：通过6天的诱导，该系统成功表达了抗角蛋白单链抗体，Western blot实验证实表达产物具有特异性。结论：获得了真核表达的抗角蛋白单链抗体，为其应用研究打下了基础。     

抗GBM抗体特异性单链抗体scFv3原核表达载体的构建及表达

目的:构建单链抗体scFv3的原核表达载体pET28a-scFv3并诱导表达,纯化并检测表达产物的免疫抗原性。方法:用PCR扩增抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3基因,构建pGEM-scFv3重组质粒并测序。将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化,用间接ELISA检测纯化的单链抗体scFv3的免疫抗原性。结果:酶切和测序证实得到的scFv3基因序列正确。间接ELISA检测表明,纯化获得的scFv3能与抗GBM抗体结合。结论:成功构建了pET28a-scFv3原核表达系统并获得纯化的scFv3蛋白。表达产物具有良好的抗原性,为进一步研究该单链抗体在抗GBM抗体病中的治疗作用奠定了基础。