弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的　构建原核重组表达质粒pET23aSAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性。　方法　PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18T载体,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET2 3aSAG2,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基 βD硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。　结果　PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23aSAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET23aSAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS PAGE显示表达产物约Mr19000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。　结论　成功构建了pET23aSAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性。     

结核分枝杆菌phoS2基因在大肠埃希菌中的高效表达及其产物抗原性分析

目的在大肠埃希菌中高效表达结核杆菌phoS2,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法采用DNA重组技术构建结核分枝杆菌phoS2抗原表达载体,用双酶切和PCR等方法鉴定转化子,重组质粒转化大肠埃希菌,诱导表达phoS2;用SDS-PAGE初步鉴定其表达量;将表达产物进行纯化;重组蛋白用Western blot分析其抗原性和特异性。结果phoS2基因在大肠埃希菌中得到高效表达,表达量占全菌蛋白的40％以上;重组蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论重组phoS2蛋白在大肠埃希菌中主要以包涵体形式表达,有很好的抗原特异性和免疫原性,对结核病诊断有潜在的应用价值。     

亚洲牛带绦虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因(Ta PITPα),探索其应用前景。方法将亚洲牛带绦虫成虫PITPα克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-Ta PITPα重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清和感染了亚洲牛带绦虫的猪血清识别,表明其具有免疫活性。结论亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因可在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得具有免疫活性的高效表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白的基因密码子优化及异源表达纯化

目的优化鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白基因密码子并在大肠埃希菌中进行异源表达纯化。方法依据大肠埃希菌密码子偏好性对鼠疫耶尔森菌YopJ基因进行全基因序列优化,并设计引物。分别以密码子优化前后的鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白的基因为模板,将包含YopJ(22aa-288aa)和YopJ(22aa-250aa)的基因片段连接到载体pGI01中。重组质粒转化到大肠埃希菌BL21菌株中,扩大培养后,IPTG诱导目的蛋白表达。提取大肠埃希菌表达蛋白并使用镍离子柱进行纯化。结果鼠疫耶尔森菌YopJ密码子优化前YopJ(22aa-288aa)及YopJ(22aa-250aa)在大肠埃希菌内表达水平较低,密码子优化后YopJ(22aa-288aa)及YopJ(22aa-250aa)在大肠埃希菌内大量表达可溶性YopJ蛋白。结论对鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白进行基因密码子优化能够提高其在大肠埃希菌内的表达量。获得的鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白具有可溶性,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

结核分枝杆菌38 ku蛋白的制备及其抗原性研究

目的基因克隆、表达、纯化结核分枝杆菌38ku蛋白,研究其抗原性,评价其在血清学诊断中的价值。方法2003年2月至2004年3月在中国药品生物制品检定所菌苗室以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过聚合酶链反应(PCR)方法对38ku蛋白基因进行扩增,以PET-30a( )为载体构建重组质粒,在大肠埃希菌中表达38ku蛋白,通过金属离子螯合亲和层析方法纯化重组蛋白,免疫印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分析该重组蛋白的抗原性。结果构建了具有正确基因序列的38ku蛋白重组质粒,在大肠埃希菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,经过一步金属离子螯合亲和层析后得到纯度为92.7%的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明该蛋白能与羊抗结核血清发生特异免疫结合反应。应用ELISA方法对结核血清参考品进行检测,敏感度和特异度分别为80.5%(33/41)和96.0%(25/26)。结论大肠埃希菌工程菌以包涵体的形式表达38ku蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可望成为结核血清学的诊断抗原之一。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I构建、鉴定及其在大肠埃希菌中的表达效率

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,观察其在大肠埃希菌中的表达效率。方法以铜绿假单胞菌PA01株的DNA为模板,PCR扩增OprF和OprI抗原编码基因,采用基因拼接法(gene SOEing)剪切OprF和OprI得到OprF-I融合基因,酶切后与表达载体pGEX-1λT连接,构建重组质粒pGEX-OprF-I并转化入大肠埃希菌中,抽提质粒进行双酶切和PCR鉴定。重组菌用异丙硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot分析和鉴定表达产物。结果基因拼接法获得1289 bp的OprF-I融合基因;其连接产物经双酶切和PCR鉴定证实该基因成功插入pGEX-1λT中。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测显示重组菌表达预期约68×10~3的融合蛋白,该蛋白约占菌体总量的18%。Western blot检测Pa感染的鼠血清可特异性识别该融合蛋白。结论成功构建并鉴定了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,转化大肠埃希菌后高效表达OprF-I融合蛋白,该蛋白具有反应原性。     

新型冠状病毒Nsp16蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达新型冠状病毒Nsp16重组蛋白并制备兔抗Nsp16多克隆抗体。方法通过琼脂糖凝胶电泳对含有Nsp16基因的重组质粒进行双酶切鉴定,并将鉴定后的重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞;通过IPTG诱导重组蛋白的表达,利用镍柱亲和层析法纯化该重组蛋白并进行Western blot鉴定;将鉴定后的目的蛋白与弗氏佐剂以1:1的体积比混匀,乳化后免疫新西兰大白兔,利用ELISA和Western blot分别进行多克隆抗体效价的测定及其特异性鉴定。结果Nsp16基因重组质粒经双酶切后得到912bp的目的片段,重组质粒转化大肠埃希菌表达出分子质量单位为33.3ku的重组蛋白,且主要存在于上清中。用纯化的重组蛋白免疫大白兔,获得兔抗Nsp16特异性多克隆抗体,且其效价达1:409600以上。结论重组Nsp16蛋白可以在大肠埃希菌中正确表达,免疫大白兔后获得高效价抗Nsp16多克隆抗体,即具有免疫反应性。为SARS-CoV-2Nsp16蛋白在新型冠状病毒肺炎中的进一步研究奠定了基础。     

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因（TaRPI。8）,探索其应用前景。方法用RT—PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPI．8基因,克隆到原核表达质粒pET一28a（＋）中,在大肠埃希茵BL21／DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a（＋）一TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21／DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPI．8基因可在大肠埃希菌BL21／DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。     

鼠疫耶尔森杆菌蛋白YPO1996的融合表达与鉴定

目的在比较蛋白质组结果的基础上选择并构建pET32a-ypo1996,表达鼠疫耶尔森杆菌（Yersinia pestis）特异的假想蛋白YPO1996重组蛋白（rYPO1996）,为新鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供备选抗原。方法根据鼠疫菌CO92株全基因组序列设计引物,用PCR方法扩增目的基因YPO1996,将其定向插入表达载体pET32a（＋）上,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,使重组质粒在工程菌中稳定高效地表达带组氨酸标签的融合蛋白,并亲和纯化该目的蛋白。通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析,并用Western blot分析其抗原性。结果单、双酶切鉴定及DNA测序显示,目的基因YPO1996成功连接到表达载体pET32a（＋）上,SDS-PAGE显示表达产物分子质量单位约为53.11 ku,与预期值相符。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗免疫鼠疫菌EV株血清识别。结论成功构建了pET32a-ypo1996重组基因原核表达系统,表达的重组蛋白rYPO1996具有较好的可溶性及抗原性,可作为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

不同方式重组表达鼠疫caf1M蛋白的研究

目的对比不同方式克隆表达鼠疫耶尔森氏菌caf1M蛋白的存在状态及免疫学活性。方法分别选择3种不同载体pET32a(+)、pGEX4t-1、pGBTNH,克隆表达鼠疫caf1M蛋白;并以鼠疫菌免疫血清分别检测其免疫学活性。结果成功构建了4个重组质粒,分别是含去除信号肽编码序列caf1M基因的3个质粒载体,及1个含有完整caf1M基因的pGEX4t-1表达质粒;4个质粒经诱导均在大肠杆菌中得到高效表达;存在状态分析表明,含有去除信号肽编码序列caf1M基因的pGEX4t-1表达的重组蛋白以可溶方式存在,其余3种以包涵体形式存在;重组蛋白与鼠疫菌免疫血清的Western blot分析表明,除pGBTNH表达的蛋白存在非特异反应外,其余3种重组蛋白都发生特异性反应。结论成功克隆表达了4种鼠疫菌caf1M蛋白,其中3种具有良好的特异性免疫反应性;信号肽序列及载体都对重组caf1M蛋白的表达有影响。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。     

立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原的免疫印迹分析

目的表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)主要抗原基因,免疫印迹初步分析重组蛋白抗原的抗原性。方法根据立氏立克次体全基因组序列选出主要抗原相关基因,采用PCR从全基因组中扩增抗原相关基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒构建抗原基因重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌并诱导转化菌表达重组蛋白抗原。采用立氏立克次体感染的豚鼠血清和斑点热患者血清分别与纯化的重组蛋白抗原做免疫印迹分析。结果经PCR扩增后获得43个目的基因片段,其中36个基因片段在大肠杆菌中高效表达重组蛋白抗原,其中5个蛋白抗原在免疫印迹中与感染豚鼠血清和斑点热患者血清反应均为阳性。结论免疫印迹筛选出5种立氏立克次体重组蛋白抗原,结果提示它们是能够诱导机体产生特异性免疫应答的主要抗原,可作研制斑点热诊断试剂或亚单位疫苗的新候选蛋白抗原。     

旋毛虫ES抗原特异性蛋白两个结构基因的序列分析及重组质粒的构建

目的：获取旋毛虫ＥＳ抗原的结构基因，对其鉴定和克隆，并研制旋毛虫基因重组抗原。方法：先用反转录ＰＣＲ技术获取目的基因，经序列测定和酶切分析后，再用重组ＤＮＡ技术分别将目的基因与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及表达载体ｐＢＶ２２０连接，评价在大肠杆菌中的表达效果和鉴定表达产物的特异性。结果：获得了编码ＥＳ抗原特异性蛋白成分的两个结构基因（０．７ｋｂ和０．９５ｋｂ），其序列与文献报道的稍有差异。共构建３个重组质粒并在大肠杆菌中表达出相应分子量大小的重组蛋白，均能被猪旋毛虫病阳性血清所识别，但非融合蛋白的特异性强于融合蛋白。在相同条件下，融合蛋白的表达量高于非融合蛋白，而表达蛋白的分子量大小与表达水平呈负相关性。结论：在大肠杆菌中表达的３种重组蛋白是研制旋毛虫基因重组抗原的良好候选抗原蛋白。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的 构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒，分析其表达状况。 方法 采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列，经克隆后，亚克隆至原核表达载体中，构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒，分析GRA8的表达；将各重组菌进行诱导，将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白，免疫印迹法(Western blotting)分析纯化蛋白的活性。 结果 GRA8基因被正确插入原核表达质粒中，原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低，几乎无完整GRA8的表达，截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。 结论 GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低，纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。     

3种结核分枝杆菌复活促进因子基因的克隆、原核表达与纯化鉴定

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子B(rpfB)、D(rpfD)、E(rpfE)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化。方法采用聚合酶链反应(PCR)以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板扩增出rpfB(1089bp),rpfD(465bp)和rpfE片段(519bp),并连接在pET32a( )载体上,重组质粒用酶切和DNA测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达了rpfB,rpfD和rpfE3种蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现分别在61kDa、39kDa、41kDa处有特异性蛋白条带。结论成功构建了3种重组表达质粒pET32a( )-rpfBv、pET32a( )-rpfDv、pET32a( )-rpfEv,并获得了3种高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH和fimC基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建以尿路致病性大肠杆菌(UPEC)Ⅰ型菌毛编码基因fimH和fimC为目的基因的原核重组表达质粒,诱导其在E.coliBL-21中表达,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自UPEC标准菌株J96获取fimH和fimC基因,分别插入原核表达载体pGEX-4T-2;将重组表达质粒转染感受态E.coliBL-21,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE和Westernblot鉴定并纯化目的蛋白fimH和fimC蛋白,定量后免疫BALB/c小鼠,动态检测抗体产生水平。结果PCR法克隆出全长为903bp的fimH和720bp的fimC基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-fimH及pGEX-4T-2-fimC经诱导可分别表达出60KD和48KD左右的GST融合蛋白;蛋白经纯化后免疫动物能诱导产生高效价的IgG抗体。结论成功获取了UP-ECⅠ型菌毛基因fimH和fimC,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;fimH有免疫原性。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。