血小板源生长因子在低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

运用流式细胞仪及细胞原位杂交方法测定低氧对培养的新生牛肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）生长的影响，并探讨血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）在其中的作用，结果表明：培养的ＰＡＳＭＣ的低氧１２ｈ时，由Ｇ０／Ｇ１期进入Ｓ斯的细胞数明显增多，为对照组的１５７．７％（Ｐ〈０．０５）；ＰＤＧＦ可进一步促进低氧状态下ＰＡＳＭＣ的增殖，Ｓ期细胞为对照组的２４２．３％（Ｐ〈０．０１），原位杂交结果显示：低氧（１２ｈ）条件下     

蛋白激酶C在低氧肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

低氧肺动脉平滑肌细胞的增殖在肺血管重构、低氧性肺动脉高压的形成发展中有重要作用。蛋白激酶C(PKC)是细胞后信号通路之一 ,在低氧肺动脉平滑肌细胞增殖的多个环节中发挥作用。     

低氧对小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及经典型蛋白激酶C表达的影响

目的:原代培养小鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,探讨低氧对PASMC增殖及经典型蛋白激酶C（cPKC）各亚型表达的影响。方法:原代培养小鼠远端PASMC,实验用4~8代传代细胞。采用免疫印迹、免疫荧光技术检测PASMC中cPKC各亚型的表达情况。将PASMC分为常氧组和低氧组,分别置于普通培养箱（5% CO ...     

低氧诱导因子1在低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的: 探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡的影响,以及HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS蛋白表达变化在其中的作用与意义。方法: 体外培养大鼠PASMC，设计常氧组、低氧组及ADM、L-NAME、PD98059干预组，用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定细胞增殖反应，用流式细胞仪检测细胞凋亡，用Western blotting法检测HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS的蛋白表达。结果: （1）低氧24 h组的A值明显高于常氧组(P<0.01)，而PD98059及ADM干预组明显低于低氧组(P<0.01)， L-NAME干预组明显高于低氧组和常氧组(P<0.01)。（2）免疫组化表明，低氧24 h组呈阳性表达(P<0.01)。PD98059、ADM抑制了PCNA的表达(P<0.01)， L-NAME促进了PCNA的表达(P<0.01)。（3）各组在低氧培养24 h后，凋亡指数差异无显著(均P＞0.05)。（4）Western blotting表明常氧组少量HIF-1α、iNOS、 P-ERK1/2表达，低氧4 h后均表达增高(P<0.01),8 h仍维持在高峰(P<0.01)，而HIF-1α、P-ERK1/2在低氧24 h后表达下调。L-NAME促进了HIF-1α表达(P<0.01),PD98059部分抑制了HIF-1α、iNOS及P-ERK1/2表达(P<0.01)；ADM部分抑制了HIF-1α表达，促进iNOS表达(P<0.01)。结论: 低氧能促进肺动脉平滑肌细胞增殖，对细胞的凋亡无影响；HIF-1在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖中起重要作用。     

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞血红素加氧酶-1 mRNA 表达及细胞增殖的影响

探讨血红素加氧酶－1（HO－1）mRNA在低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC0的表达及HO－1／一氧化碳（HO－1／CO）体系对PASMC增殖的影响。应用荧光定量RT－PCR法测定HO－1mRNA表达。用双波长法检测碳氧血红蛋白（HbCO)吸光值。应用免疫细胞化学方法检测细胞增殖核抗原（PCNA）及核转录因子－κB（NF-κB）的表达。发现HO－1 mRNA在常氧大鼠PASMC有低水平的表达，低氧12h HO-1mRNA水平是常氧时的1．5倍，且HbCO产量随之显著增高（P＜0．01）；低氧24h HO-1 mRNA表达呈回落趋势，HbCO产量亦有所减少，但两者仍高于常氧水平。低氧12h及24h PASMC PCNA核阳性反应颗粒表达较常氧时增强（P＜0．01，P＜0．001），使用HO抑制剂ZnPP-9，其PCNA该阳性反应颗粒表达较单纯低氧时增加更多（P＜0．001，P＜0．01）。低氧组核NF－κB阳性染色较常氧组增强（P＜0．001），使用ZnPP-9，其表达则比低氧时更多（P＜0．01）。低氧通过诱导大鼠PASMC的HO－1 mRNA基因表达，上调HO／CO体系活性，使内源性CO含量增高，抑制PASMC增殖；NF－κB参与了PASMC增殖的调控机制。     

牛痘相关激酶1在小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及机制

目的：探讨牛痘相关激酶1(vaccinia-related kinase 1, VRK1)在小鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs）增殖及迁移中的作用及机制。方法：培养小鼠肺动脉平滑肌细胞系,细胞传至第3代至第5代细胞进行后续实验。在低氧条件下检测不同低氧时间干预后PASMC中VRK1蛋白水平的变化。为探究VRK1在低氧所致PASMCs增殖和迁移中的作用,通过携带Vrk1特异短发夹RNA(Vrk1 short hairpin RNA,sh Vrk1)或相关阴性对照RNA(shCon)的慢病毒转染PASMCs,将转染后的PASMCs分别进行常氧、低氧处理,Western blot检测VRK1和β-catenin蛋白水平变化,采用Ki-67细胞免疫荧光染色法检测PASMCs的增殖活性,划痕实验检测PASMCs的迁移能力。加入40μmol/L SKL2001恢复β-catenin活性后再次检测上述指标。结果：与常氧组相比,低氧处理24 h和36 h后PASMCs中VRK1蛋白表达水平升高（P<0.01）。常氧培...     

L-精氨酸对高肺血流量大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

探讨L－精氨酸（L－Arginine,L-Arg）对高肺血流量所致肺动脉高压平滑肌细胞增殖与凋亡的干预作用。18只雄性SD大鼠随机分为对照组、分流组和分流＋L精氨酸（L－Arg）组。对分流组和分流＋L－Arg组大鼠行腹主动脉－下腔静脉分流术。观察术后11周大鼠肺动脉平均压（mPAP)和右心室肥厚的改变，采用免疫组织化学方法研究肺动脉平滑肌细胞PCNA和Fas的表达，并通过原位缺口末端标记方法（TUNEL）检测大鼠肺动脉平滑肌细胞的凋亡。结果表明分流组大鼠mPAP、右心室（RV）与左心室加室间隔（LV＋S）的比值，肺中、小型动脉平滑肌细胞增殖指数（PI），凋亡指数（AI），PI／AI比值明显高于对照组大鼠（P＜0．05），同时，分流后肺动脉平滑肌细胞Fas表达增高。然后，分流＋L－精氨酸组大鼠mPAP、RV／LV＋S明显低于分流组（P＜0．05及0．01）。并且L－Arg减少了肺中、小型动脉平滑肌细胞的增殖，促进了凋亡（P＜0．01），wviycL-Arg组大鼠PI／AI比值较分流组明显降低（P＜0．01），同时，L－Arg使分流大鼠肺平滑肌细胞Fas表达明显增强。以上结果提示，L－精氨酸通过抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖，促进其凋亡，从而对同肺血流量所致肺动脉高压的形成有重要的调节作用。     

DDPH在低氧内皮细胞条件培养液促肺动脉平滑肌细胞增殖中对c-fos和c-myc表达的影响

目的在细胞水平研究1-(2,6-二甲基苯氧基)-2-(3,4-二甲氧基苯乙胺基)丙烷盐酸盐(DDPH)在低氧内皮细胞条件培养基(HECCM)促肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖过程中对c-fos和c-myc表达的影响。方法采用MTT比色法作为HECCM促PASMC的增殖指标,采用核酸斑点杂交法检测c-fos与c-myc mRNA的相对表达量,同时观察DDPH对它们的影响。结果低氧可刺激内皮细胞产生某些因子,经旁分泌作用促进PASMC的c-fos和c-myc基因转录以及促使PASMC增殖。DDPH能显著抑制HECCM促PASMC的增殖作用以及下调c-fos和c-myc mRNA的表达量。结论 DDPH能显著抑制HECCM促PASMC的增殖作用,其作用机制可能是通过下调C-fos和C-myc mRNA的表达量来实现的。     

酪氨酸蛋白激酶抑制剂对PDGF诱导的肺血管平滑肌细胞增殖的影响

近年来的研究表明酪氨酸蛋白激酶（ｔｙｒｏｓｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ，ＴＰＫ）参与了许多增殖性疾病的发病过程（如肿瘤、冠状动脉粥样硬化、肺纤维化等），但在肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞（ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅ...     

钙敏感受体在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的:观察钙敏感受体(CaSR)在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用。方法:Ⅱ型胶原酶消化法提取、培养大鼠肺动脉平滑肌细胞。应用Western blotting技术及免疫荧光染色分析CaSR蛋白在肺动脉平滑肌的表达;采用激光共聚焦扫描技术检测不同处理因素对细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,应用MTT法分析不同处理因素对细胞存活率的影响。结果:大鼠肺动脉平滑肌细胞有CaSR蛋白表达。缺氧能够增加CaSR和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、细胞存活率及[Ca2+]i(与对照组比较,P0.05)。GdCl3(CaSR激动剂)能够增强缺氧的上述作用,NPS2390(CaSR抑制剂)则能够减弱缺氧的作用。结论:缺氧诱导的CaSR表达增加参与了缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖。     

红景天甙对低氧培养的兔肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:研究红景天甙(Salidroside,Sal)对低氧(3%)条件下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞内钙离子浓度的影响。方法:应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、[³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入试验、Fluo-3和激光扫描共聚焦显微术测定细胞内Ca²⁺浓度等方法。结果:低氧24h可直接刺激PASMC,使MTT的A值增加62%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量增加138%(P＜0.01)。在低氧的PASMC培养液中加入Sal(32×10^-5mol/L)可抑制低氧的这种促增殖作用,与低氧组相比MTT的A值下降29%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降37%。在低氧的PASMC培养液中加入钙通道阻滞剂verapamil也可抑制低氧的促增殖作用,与低氧组相比较,MTT的A值下降23%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降51%(P＜0.01)。PASMC的低氧培养可使细胞内Ca²⁺浓度明显增加(P＜0.05),Sal可抑制低氧所致的细胞内Ca²⁺浓度的上升。结论:红景天甙可抑制低氧促进PASMC增殖、DNA合成的作用,其机制可能与抑制低氧时细胞内Ca²⁺浓度增加有关。     

慢性低氧对肺动脉内皮及平滑肌细胞急性低氧时胞浆游离钙变化的影响

目的和方法:以Fura-2/AM荧光指示剂负载,检测常氧(PO2213kPa)及慢性低氧[PO2(53±07)kPa]培养的大鼠肺内动脉平滑肌细胞及猪肺动脉内皮细胞胞浆游离钙的水平及其对急性低氧刺激反应的变化。结果:慢性低氧条件培养的第6代肺内动脉平滑肌细胞在急性低氧时[Ca²⁺]_i升高的程度明显降低(P<0.05);而慢性低氧条件培养的第5代肺动脉内皮细胞对急性低氧引起的[Ca²⁺]_i升高程度明显增加(P<0.05)。结论:慢性低氧可以减弱肺内动脉平滑肌细胞对急性低氧所致[Ca²⁺]_i升高的反应而增强肺动脉内皮细胞低氧性[Ca²⁺]_i升高的反应。这可能在慢性低氧时肺血管对低氧的反应性降低中起重要作用。     

肾上腺髓质素抑制肺动脉平滑肌细胞低氧性增殖

目的观察肾上腺髓质素（AM）对肺动脉平滑肌细胞低氧性增殖的影响。方法体外培养猪的肺动脉平滑肌细胞,采用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定其增殖反应。结果低氧+AM组MTT比色法平均吸光度（A值）为0.394±0.025,显著低于缺氧组的0.514±0.035(P＜0.01),PCNA表达减少,图像分析平均吸光度（A值）为0.168±0.049,显著低于低氧组的0.307±0.078（P＜0.01）。结论肾上腺髓质素能抑制低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖,提示AM在肺动脉高压的发生发展中起一定的保护作用。     

碱性成纤维细胞生长因子在低氧大鼠肺动脉的表达及其对肺动脉张力的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在低氧性肺动脉高压发病中的可能作用。方法:应用逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)技术观察低氧大鼠肺动脉bFGF的表达水平,并观察bFGF对离体大鼠肺动脉环收缩功能的影响。结果:①低氧时,肺动脉bFGFmRNA表达明显增加,bFGF与β-actin的RT-PCR反应产物的放射强度(counts·min^-1)之比由对照的0.5074上升到0.9182(低氧1周)和0.7812(低氧2周)(P均＜0.05)。②bFGF能收缩离体大鼠肺血管环,收缩强度与剂量相关(r=0.695,P＜0.05),其EC₅₀为2.62×10^-7mol/L。结论:提示bFGF可能参与低氧性肺动脉高压的发病过程。     

肺微动脉内皮细胞对肺动脉张力的调节作用

本文研究体外培养的兔肺微动脉内皮细胞对肺动脉张力的调节作用。常氧和缺氧培养24小时后的肺微动脉内皮细胞条件培养液均不能收缩肺动脉条,用乙醚提取后的水相则能引起肺动脉肌条发生明显收缩反应,常氧和缺氧培养组间无明显差异,水相加热后,常氧和缺氧培养组的内皮细胞条件培养液对肺动脉肌条的收缩作用明显下降,但缺氧培养组的收缩幅度明显高于常氧培养组,用胰蛋白酶处理后,各组的收缩活性均消失。用消炎痛、巯甲丙脯酸处理缺氧组的内皮细胞或向收缩反应池内加入FPL55712、BN52021、扑尔敏、哌唑嗪对条件培养液的收缩活性无明显影响。结果提示:在培养的兔肺微动脉内皮细胞产生的长半衰期血管活性物质中,脂溶性物质可能舒张肺动脉,缺氧不影响此物质的产生,水溶性物质包括不耐热的和耐热的,均能收缩肺动脉,前者在缺氧时产生减少,后者可能是一种肽类,缺氧使之产生增加。     

低氧对肺动脉平滑肌和内皮细胞蛋白激酶C α mRNA表达的影响

目的：探讨低氧对肺动脉平滑肌和内皮细胞蛋白激酶C(PKC)αmRNA表达的影响。方法：应用原位杂交技术了大鼠不同节段肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞PKCαmRNA的分布及低氧对在体和离体肺动脉平滑肌细胞及内皮细胞PKCαmRNA表达的影响。结果：正常大鼠各级肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞均有PKCαmRNA的表达,腺泡内肺动脉平滑肌细胞中的表达明显高于肌型肺动脉（P＜0．01）,低氧14d和28d肌型动脉和腺泡内肺动脉内皮细胞的表达均明显增高（P＜0．01）,腺泡内腺动脉平滑肌细胞的表达较对照组明显升高（P＜0．01）,低氧14d肌型肺动脉平滑肌细胞表达升高不明显,但低氧28d明显升高（P＜01）,正常条件下离体培养猪肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞均有PKCαmRNA的表达,低氧1h对其表达无明显影响,48,72h表达明显升高,以72h升高最显著（P＜0．001）,结论：低氧可促进肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞PKC amRNA 的表达,而以腺泡内肺动脉平滑肌细胞的变化最明显,PCKα在低氧性肺动脉高压的形成中可能起一定作用。     

连代低氧培养肺动脉平滑肌及内皮细胞的急性低氧反应中环核苷酸的作用

目的:探讨环核苷酸在慢性低氧动物的低氧性肺血管收缩反应(HPV)弱化机制中的作用。方法:用RIA法测定连代常氧与连代低氧培养猪肺动脉平滑肌细胞(PASMC)和内皮细胞(PAEC)的cAMP和cGMP及其在急性低氧时的变化;用图像分析系统检测常氧与低氧培养PASMC在急性低氧时的收缩程度。结果:低氧组PASMC的cAMP、cGMP和PAEC的cGMP基础值较常氧组低(P＜0.01)。急性低氧状态下,低氧组PASMC的cAMP、cGMP含量升高(P＜0.01);低氧组弱收缩反应PASMC的百分率明显高于常氧组。结论:慢性低氧PASMC和PAEC的cAMP、cGMP基础值下降可能与慢性低氧动物肺动脉基础张力增高有关;慢性低氧PASMC在急性低氧反应时cAMP、cGMP含量升高可能是慢性低氧机体HPV弱化的机制之一。     

缺氧对兔胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的: 观察缺氧对培养的兔胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法: 采用析因实验设计, 测定在正常或缺氧环境下, 不同浓度的胎牛血清对培养的血管平滑肌细胞数量、[³H]-TdR掺入量、MTT比色以及细胞cGMP水平的影响; 透射电镜观察细胞超微结构。结果: 缺氧组平滑肌细胞的数量、[³H]-TdR掺入量以及MTT比色显著多于常氧组(P<0.01); 电镜下可见缺氧组较正常组细胞器发达, 可见大量分泌胞, 少量髓样变线粒体; 缺氧组平滑肌细胞内的cGMP浓度明显高于常氧组。结论: 缺氧可促进血管平滑肌细胞DNA合成, 促进细胞增殖, 可能与提高细胞内的cGMP水平有关。     

慢性缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞胞内钙的影响及其机制研究

目的:研究慢性缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)胞内钙浓度(［Ca²⁺］_i)的影响及L-型钙通道和胞内钙库的作用,为缺氧性肺动脉高压(HPH)发病机制的进一步研究提供理论依据。 方法:复制大鼠缺氧性肺动脉高压动物模型，利用Fura－2/AM钙离子成像方法测定PASMCs在不同钙离子浓度细胞外液及L-型钙通道阻滞剂nifedipine和IP3R钙通道抑制剂肝素干预前后 ［Ca²⁺］_i变化。 结果:(1)缺氧＋含钙外液组PASMCs ［Ca²⁺］_i 显著高于对照＋含钙外液组（P<0.05）。缺氧＋含钙外液组PASMCs ［Ca²⁺］_i显著高于缺氧＋无钙外液组（P<0.05）。(2)缺氧nifedipine组PASMCs［Ca²⁺］_i在加药前后无显著差异（P>0.05）。（3）缺氧未干预组与缺氧肝素组PASMCs ［Ca²⁺］_i无明显差异（P>0.05）。 结论:慢性缺氧可使PASMCs的［Ca²⁺］_i增加。慢性缺氧引起［Ca²⁺］_i增加可能与细胞外钙内流有关，L-型钙通道和IP3R钙通道在调节［Ca²⁺］_i的过程中可能不独立发挥作用。     

SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞原癌基因c-myc mRNA表达及细胞增殖的影响

目的：探讨SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）原癌基因c-myc mRNA表达及细胞增殖的影响。 方法： 以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至体外培养的PASMCs，G418筛选阳性克隆，应用免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3蛋白表达；缺氧处理转染组和对照组PASMCs，采用半定量RT-PCR检测转染前后常氧组、缺氧培养2 h、6 h、12 h、16 h、24 h细胞c-myc mRNA表达水平变化；［3H］-TdR掺入法检测转染前后上述各时点细胞增殖情况。 结果： 免疫细胞化学法证实转染后细胞中有SOCS3稳定表达；半定量RT-PCR结果显示，SOCS3基因转染组细胞c-myc mRNA表达水平在缺氧各时点均显著低于同时点对照组细胞（P<0.01）；SOCS3基因转染组细胞在常氧和缺氧各时点［3H］-TdR掺入量显著低于对照组细胞（P<0.01）。 结论： SOCS3蛋白可能通过下调c-myc基因表达从而抑制缺氧诱导的PASMCs增殖。