人 BMP2和 OPG共表达真核载体的构建与骨质疏松基因治疗相关性的研究

Boneisadynamictissue，thelevelofbonemassreflectsthebalanceofboneformationandresorption，whichinvolvesthecoor－dinateregulationofbone－formingcells（osteoblasts）andbone－resorbingcell（osteoclasts）．Avarietyoflocalgrowthfactorsandcytokinesaswellassystemicpeptideandsteroidhormonesregulatethedifferentiationofimmatureprecursorcellsandtheactivityofmaturecellsinboththeosteoblasticandtheosteoclasticlineage，suchasbonemorphogeneticprotein－２（BMP－２）andosteoprotegenin（OPG）犤１犦．Inaddition，…     

丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究

目的构建含丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体,为C蛋白与宿主蛋白相互作用机制研究奠定基础。方法聚合酶链反应(PCR)法扩增HCV 1b基因型C蛋白基因,经EcoR I和Pst I双酶切后插入到诱饵载体pGBKT7中,构建含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Core,经酶切分析及核酸测序分析加以鉴定。醋酸锂法将pGBKT7-Core转化入酵母菌株Y2HGold,蛋白印迹法检测C蛋白的表达,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性作用及对报告基因的激活作用。结果重组质粒pGBKT7-Core中的C蛋白基因为576 bp,经核酸测序分析与NCBI中注册的HCV 1b基因型C蛋白基因序列一致;转化酵母菌后检测到C蛋白的表达;HCV C蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性,且对报告基因无激活作用。结论含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体构建成功,表达稳定。     

分泌人内皮抑素基因工程细胞系的建立

目的建立稳定的基因工程细胞系。方法将含有白细胞介素-2（IL-2）分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pSNA2.0,产生重组质粒pSNA2.0/hEndostatin,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK293细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hED/293,采用Western-blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达。结果hED/293细胞株培养上清中有endosta-tin蛋白的表达,分子量为20000。结论重组pSNA2.0/hEndostatin真核表达载体构建正确,转染HEK293细胞后可有效的表达人endostatin蛋白,并能分泌到细胞外。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

重组人凝血因子Ⅶ在CHO细胞中的稳定表达、纯化及功能鉴定

目的：真核表达及纯化重组人凝血因子Ⅶ（rFⅦ）。方法通过PCR方法扩增FⅦ全长cDNA,克隆入真核表达载体pcDNA3.0,利用脂质体将FⅦ基因与二氢叶酸还原酶基因共转染CHO-dhfr-/-细胞,采用氨甲喋呤药物加压,Western blot方法筛选获得稳定高表达细胞克隆。将高表达细胞克隆在摇瓶中无血清悬浮驯化培养,收集细胞培养上清,通过离子交换和亲和层析两步法进行纯化并对纯化产物进行活性鉴定。结果在CHO细胞中成功表达了rFⅦ,无血清悬浮培养条件下表达量可达3 mg·L-1·d-1,成功纯化了rFⅦ,SDS-PAGE凝胶电泳显示分子质量约50 kDa的单一多肽,生物学活性试验证实该纯化产物具有促凝活性。结论成功表达并纯化了rFⅦ,为进一步研制活化凝血因子Ⅶ药物奠定了基础。     

基因治疗骨质疏松、骨转移癌的可行性研究

目的研究人骨保护素(OPG)转染小鼠胚胎成肌细胞C2C12后细胞形态及细胞周期的变化。方法采用Westernblot方法证实OPG在真核细胞中表达。对稳定转染OPG基因的C2C12细胞的形态、细胞周期等进行检测。结果成功克隆了人OPG编码区基因并构建了真核表达载体pcDNA3－OPG。结论人OPG编码区基因稳定转染的小鼠胚胎成肌细胞生长状态良好,DNA合成旺盛,无诱导细胞凋亡现象,为采用OPG基因治疗骨质疏松、骨转移癌等的可行性提供了依据。     

重组人单链白细胞介素12融合基因的构建、真核表达及生物学活性测定

目的 探讨用生物学技术获取具有生物学活性的重组人白细胞介素１２（ｒｈＩＬ－１２）的方法。方法 从经佛波醇酯（ＰＤＢｕ）刺激的ＥＢ病毒转化的人Ｂ淋巴母细胞株ＮＣ－３７中提取ｍＲＮＡ,经逆转录－聚合酶链反应分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ,运用重组聚合酶链反应技术。将两段基因通过多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列连接后进行基因重组,构建了重组人单链ＩＬ－１２融合基因（ｒｈ－ｓｃＩＬ－１２）。进一步将ｒｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１（＋）真核表达载体中,构建ｒｈｓｃＩＬ－１２真核表达载体「ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｒｈｓｃＩＬ－１２」,转染ＣＯＳ－７细胞,结果 经Ｇ４１８筛选获ＣＯＳ－ｒｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白稳定表达株,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白相对分子质量为７     

基因ifi56在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的表达及其真核表达质粒的构建

本研究探讨ifi56基因在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的表达,构建人ifi56真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位情况。用RT-PCR技术检测APL细胞NB4经维甲酸处理不同时间后ifi56的表达,并从白血病细胞NB4中扩增ifi56全长编码序列,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,转染到293T细胞中,提取细胞蛋白,用Western blot方法检测蛋白表达情况,荧光显微镜检测IFI56的定位。结果表明,ifi56在未经处理的NB4细胞中几乎检测不到,当用维甲酸处理72小时后明显升高,并成功将ifi56插入到质粒pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为83 kD。IFI56重组蛋白在293T细胞内主要定位于细胞胞浆中。结论:ifi56表达随着APL细胞分化明显升高,成功构建ifi56基因真核表达载体,IFI56蛋白主要定位于细胞浆。     

大鼠少突胶质细胞转录因子2基因真核表达载体的构建

背景：碱性螺旋-环-螺旋转录因子少突胶质细胞转录因子2在脊髓的少突胶质细胞的分化过程中起着关键性的作用。目的：构建大鼠少突胶质细胞转录因子2基因重组真核表达载体,观察其在真核细胞内的表达。方法：从新生大鼠脊髓组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后将少突胶质细胞转录因子2cDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接。将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-Olig2以脂质体法转染至COS-7细胞中,反转录PCR鉴定少突胶质细胞转录因子2mRNA的表达,免疫印迹法检测少突胶质细胞转录因子2蛋白质表达水平。结果与结论：克隆了少突胶质细胞转录因子2的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-Olig2,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;转染72h时免疫印迹分析显示,COS-7/pEGFP-N1-Olig2实验组COS-7细胞表达Olig2-GFP融合蛋白。提示实验成功构建pEGFP-N1-Olig2真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达。     

人CD13基因克隆及其基因转染细胞株的构建

目的 克隆人CD13全长cDNA,构建稳定表达人CD13 分子的基因转染细胞株.方法 提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR 克隆人CD13基因,将人CD13基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term.将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD13 和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞.结果 成功克隆人CD13基因和构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/ CD13,并成功获得稳定表达人CD13的基因转染细胞株L929/CD13.结论 成功克隆了人CD13基因及其逆转录表达载体,成功制备了稳定表达人CD13的基因转染细胞株,为研究CD13生物学功能奠定了基础.     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒的构建与鉴定

背景:骨形态发生蛋白2是诱导成骨关键物质,参与调节从细胞增殖、决定种系分化方向到细胞死亡等一系列的生物过程。目的:利用AdMax系统构建人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法:以人cDNA为模板PCR扩增人骨形态发生蛋白2基因,转化E.coli感受态细胞,经菌落PCR鉴定阳性转化子、阳性克隆测序无误后,扩增、抽提。将带有目的基因的腺病毒表达载体和携带有腺病毒大部分基因的辅助包装质粒共转染293细胞进行病毒包装扩增,PCR检测目的基因、Western Blot检测目的蛋白及终点稀释法检测病毒滴度。结果与结论:PCR获得长度为1223bp的人骨形态发生蛋白2目的基因片段,同源重组表达载体经阳性克隆PCR及测序鉴定,结果正确。293细胞内包装、扩增,经Westernblot及PCR鉴定无误后,获得病毒滴度为5×1013pfu/L的重组腺病毒。实验成功构建携带有人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体。     

人FOXC2真核表达载体的构建及稳定转染C-33A细胞系的建立

目的构建人FOXC2真核表达载体,并转染人宫颈癌C-33A细胞,建立稳定转染的细胞系。方法应用PCR方法从人FOXC2克隆中扩增其cDNA编码区序列,并将其构建于pcDNA3.1（-）真核表达载体。经PCR和测序鉴定后,利用脂质体进行宫颈癌C-33A细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达FOXC2的细胞系,通过RT-PCR及Westernblot法检测FOXC2的表达情况。结果成功构建pcDNA3.1（-）/FOXC2真核表达载体,建立稳定转染FOXC2的C-33A细胞系,并鉴定了FOXC2目的基因在C-33A细胞中的过表达。结论FOXC2真核表达载体的成功构建为进一步研究FOXC2基因在宫颈癌中的功能奠定了良好的实验基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

sox4不同结构域的真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建并鉴定sox4四段不同结构域的重组真核表达质粒。方法：以HL-60细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出sox4基因cDNA,将产物克隆进真核载体pCMV—Flag质粒内,构建含sox4不同结构域的重组真核表达质粒。将pCMV—Flag—sox4重组质粒转染293T细胞,Westernblot检测sox4蛋白表达。结果：核酸序列分析sox4已成功插入pCMV—Flag载体中,转染pCMV—Flag-sox4的293T细胞中检测到表达的sox4蛋白。结论：成功构建了含sox4基因的重组真核表达质粒。     

构建人 COX-2反义核酸真核表达载体对膀胱癌 T24细胞株COX-2表达的作用

【目的】构建人环氧化酶-2（COX-2）反义核酸真核表达载体,探讨其抑制膀胱癌 T24细胞COX-2表达的作用。【方法】经PCR法从含人COX-2基因的质粒中扩增其cDNA ,通过限制性内切酶克隆于 T载体EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ位点之间,并将其反向插入pcDNA3．1中获得重组质粒。应用脂质体介导将其导入T24膀胱癌细胞中,经过G418筛后进行流式细胞术、间接免疫荧光染色和RT-PCR鉴定。【结果】核酸测序和限制性内切酶消化证实重组COX-2反义核酸真核表达质粒 pcDNA3．1/COX-2 as是正确的,经鉴定转导 pcD-NA3/COX-2 as的T24细胞中环氧化酶-2的表达明显抑制。【结论】成功构建人COX-2反义核酸真核表达载体并获得环氧化酶-2基因表达持续下调的膀胱癌细胞株T24-AS。     

MK—EGFP融合蛋白的构建和表达

目的克隆中期因子（midkine，MK）的编码序列，构建MK—EGFP融合表达质粒，诱导表达并亲合纯化。方法用RT—PCR技术从人胚胎组织中获得MK编码基因，构建原核表达质粒pET—MK-EGFP；转化大肠杆菌，诱导表达重组蛋白；纯化回收后鉴定生物活性。结果重组质粒经酶切测序与预期相符，融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微镜下清晰可见，MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性。结论MK—EGFP重组质粒构建正确，融合蛋白大量表达，并具有完整的生物学活性。     

SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化

目的克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化,为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因,定向插入pPICZ表达载体,转入毕赤酵母表达系统,将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果扩增出约1.5kb的SSA/Ro60全长序列,获得相对分子质量60×10~3的重组蛋白,经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60,为诊断自身免疫疾病奠定基础。     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号蛋白的真核表达

目的从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出信号蛋白Sj14-3-3编码基因，并亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法提取日本血吸虫成虫总RNA，分离mRNA，RT-PCR法制备cDNA．并扩增出Sj-4-3-3编码基因，通过线性TA克隆载体pGEM-T连接，亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，经转染至COS-7细胞中表达，Western blotting鉴定。结果RT-PCR产物、pGEM-T-Sj14-3-3及pcDNA3．1( )-Sj14-3-3分别经双酶切后均获得一特异性基因片段，经SDS-PAGE及Western blotting鉴定后的分子量为29kD。结论真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-Sj14-3-3在COS-7细胞中的表达产物是一分子量为29kD的蛋白，并能被抗Sj14-3-3单克隆抗体识别。     

人自身抗原Sm B′的基因克隆和原核表达

目的克隆并表达人自身抗原Sm B′。方法应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原Sm B′全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-ST载体中,转入大肠杆菌BL-21。阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果PCR产物约为0.7kb,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank报道的完全一致。pGEX-5T—Sm B′重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为53KD,具有天然人自身抗原Sm B′的免疫原性。结论成功克隆表达人自身抗原Sm B′,为下一步工作奠定了基础