神经干细胞在缺氧后的分化情况及相关信号通路初探

目的 观察缺氧缺糖后神经干细胞在不同时间点的分化趋势,以及与信号通路促红细胞生成素受体(EPOR和βCR)和PDZ连接激酶(PBK)的相关性.方法 分离小鼠原代神经干细胞,制备氧糖剥夺(OGD)模型,缺氧3 h,复氧1 h、2 h、4 h、6 h、8 h,观察神经干细胞OGD的分化趋势,采用RT-PCR技术检测少突胶质...     

重组人促红细胞生成素对3T3-L1脂肪细胞促红细胞生成素受体表达及下游信号通路的影响

目的 探讨重组人促红细胞生成素( rHuEPO)对正常和胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞促红细胞生成素受体(EPOR)表达及其下游信号通路的调控作用.方法 以1μmoL/L地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛索抵抗模型(模型组),以分化成熟的正常3T3-L1脂肪细胞作为对照组.采用细胞免疫荧光法和Western blotting法检测细胞EPOR的蛋白表达,采用Real-TimePCR技术检测细胞EPOR mRNA的表达.分别以rHuEPO、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂(LY294002)及信号转导和转录激活因子5( STAT5)抑制剂对模型组和对照组细胞进行干预,采用Western blotting法检测不同药物干预对EPOR蛋白的表达及其下游分子丝(苏)氨酸蛋白激酶( Akt)和STAT5磷酸化水平(p-Akt和p-STAT5蛋白的表达)的影响.结果 与对照组比较,模型组EPOR蛋白和mRNA的表达均显著下调(P＜0.05).干预实验结果显示:与相应对照组或模型组比较,rHuEPO+对照组或模型组EPOR、p-Akt和p-STAT5蛋白的相对表达量均显著上调(P＜0.05);与相应rHuEPO+对照组或模型组比较,rHuEPO+LY29400或STAT5阻断剂+对照组或模型组的p-Akt和p-STAT5蛋白的相对表达量显著下调(P＜0.05).结论 正常3T3 -L1脂肪细胞上存在EPOR,胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞EPOR蛋白和mRNA的表达下调,rHuEPO可通过EPOR介导激活PDK-Akt和JAK2 -STAT5信号通路.     

Eph/Ephrin家族蛋白在脑血管病中作用的研究进展

促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph)与其配体-肝配蛋白(Ephrin)结合后会产生多种生物学效应。Eph/Ephrin与脑血管病的关系密切,其参与了脑血管病的发生、发展以及转归过程等的病理生理过程。Eph/Ephrin在出血性和缺血性脑血管病中的表达与脑血管病的损伤程度及预后有关,有可能成为脑血管病的诊断指标、预后指标及重要治疗靶点,为新药的研发提供新的思路。但Eph/Ephrin也存在生殖和发育毒性,未来仍需要大量的临床试验证明Eph/Ephrin的有效性和安全性,减弱其毒性作用。     

Eph在颞叶癫痫大鼠齿状回苔藓纤维出芽机制中的作用

目的:探讨匹罗卡品致痫大鼠Eph A5和ephrin A3在海马齿状回的表达变化与苔藓纤维出芽和突触重建的关系.方法:急性诱导癫痫持续状态及慢性颞叶癫痫形成后,采用Neo-Timm银染观察苔藓纤维出芽及突触重建,并用原位杂交方法检测ephrin A3基因的动态变化,用免疫组织化学方法检测Eph A5蛋白的动态变化.结果:在内嗅皮质区(EC)仅有Eph A5的表达,致痫后第7天,Eph A5的表达下调,降至最低点(P＜0.01),此后逐渐回升,但第15天时仍低于对照组(P＜0.05),第30天时回归至对照组水平(P＞0.05).在齿状回(DG),Eph A5及ephrin A3在致痫后第7天明显较对照组降低(P＜0.01),此后逐渐回升,但第15天时仍低于对照组,在第30天和第60天与对照组相比无统计学差异(P＞0.05).结论:内嗅皮质区EphA5和齿状回Eph A5及ephrin A3的表达下调可能是癫痫持续状态(SE)后苔藓纤维出芽至齿状回内分子层的分子学机制之一.     

酪氨酸激酶受体家族EphA5在前置胎盘患者血清和胎盘组织中的表达及其临床诊断意义

目的 探讨酪氨酸激酶受体家族中促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph) A5在前置胎盘患者血清和胎盘组织中的表达及其临床诊断意义.方法 前置胎盘患者32例(前置胎盘组),其中完全型前置胎盘12例,不完全型11例,边缘型6例,低置胎盘3例;健康初产妇32例(对照组).分别利用酶联免疫吸附试验和免疫印迹法测定两组产妇血清和胎盘组织中EphA5表达水平.结果 前置胎盘组患者的血清EphA5含量及胎盘组织EphA5蛋白表达水平均明显低于正常对照组(P＜0.05);而不同类型前置胎盘组患者血清EphA5含量、胎盘组织EphA5蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05).前置胎盘组产妇胎盘组织EphA5蛋白表达水平与外周血EphA5含量呈正相关(P＜0.05).结论 前置胎盘患者外周血EphA5含量水平降低,有可能成为前置胎盘早期诊断的重要指标.     

促红细胞生成素及其受体在肺癌组织中的表达

目的探讨促红细胞生成素(EPO)和促红细胞生成素受体(EPO-R)在肺癌组织中的表达规律。方法从接受根治性手术的患者获得肺癌组织,其中包括肺鳞状细胞癌12例,肺腺癌15例。采用免疫组化方法检测肺癌组织中EPO-R的表达情况;肺癌组织匀浆后,利用ELISA法检测肺癌组织中的EPO含量。结果肺癌组织中EPO含量与肺癌患者的病理类型、组织分化程度及有无淋巴结转移无关(P>0.05)。肺癌组织中EPO-R的表达高于癌周组织(P<0.05)。结论 EPO进入肺癌组织中EPO可以与EPO-R结合参与肺癌的发生过程。     

神经干细胞分化过程中GAP-43基因的表达及其意义

目的:探讨神经干细胞(NSC)在分化过程中生长相关蛋白43(GAP-43)基因的表达及其意义。方法:NSC提取于新生鼠的海马区,经培养及Nestin免疫细胞化学鉴定,用RT-PCR和免疫组化方法观察GAP-43基因在NSC分化过程中不同时间点的表达。结果:GAP-43mRNA在NSC处于克隆球阶段未检测到其表达,开始分化12h可检测到其低表达,并逐渐升高,3d表达量达到高峰,5d表达量下降。GAP-43最初在NSC分化1d的胞质内表达并逐渐升高,5d表达增强,于细胞的突起中明显,7d时GAP-43反应减弱并逐渐消失。结论:在神经干细胞分化为神经元过程中GAP-43基因参与引导突起的生长并发挥重要作用。     

非小细胞肺癌中促红细胞生成素及其受体的表达及其临床意义

目的 探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织及肺良性病变组织中促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)和促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor,EPO-R)的表达情况及其临床意义.方法 采用免疫组织化学法检测具有完整临床病理资料的31例未经治疗的NSCLC组织EPO/EPO-R的表达情况,以21例肺良性病变组织作为对照,分析EPO/EPO-R的表达水平与各临床病理因素的关系.结果 NSCLC组织中EPO和EPO-R的表达高于肺良性病变组织(P＜0.05),但EPO/EPO-R的表达与非小细胞肺癌患者的pTNM分期、病理类型、组织分化程度及有无淋巴结转移无关(P＞0.05).结论 NSCLC患者高表达EPO/EPO-R,提示EPO/EPO-R可能参与了肿瘤的发生过程.     

过表达ephrinB2调控犬牙周膜干细胞的成骨能力

目的 观察促红细胞生成素肝细胞激酶受体B4/促红细胞生成素肝细胞激酶受体配体B2(EphB4/ephrinB2)信号通路中过表达ephrinB2在比格犬来源的牙周膜干细胞(cPDLSCs)中成骨分化的能力。方法 采用Beagle犬前磨牙及磨牙中分离PDLSCs,用EfnB2-GFP-Bsd载体和空载体(GFP-Bsd)转染细胞后进行成骨诱导分化，Western blot检测转染后ephrinB2蛋白表达水平，行CCK-8实验、茜素红S染色实验、碱性磷酸酶染色实验(ALP)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测EfnB2-cPDLSCs组、空载体对照组(Vector-cPDLSCs)的成骨分化效果。结果 CCK-8显示：EfnB2-cPDLSCs组和Vector-cPDLSCs组在细胞增殖上没有差异。茜素红染色实验和ALP染色实验证实：EfnB2-cPDLSCs组较Vector-cPDLSCs显示更高的ALP活性和矿化能力。RT-PCR显示：EfnB2-cPDLSCs组成牙本质/成骨标志物的表达高于Vector-cPDLSCs组。结论 通过过表达犬牙周膜细胞中的ephrinB2可提...     

EPO对鼠胚脑皮质神经干细胞抗凋亡作用的研究

目的探讨促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）对体外培养神经干细胞（neural stem cells,NSCs）凋亡的影响,为NSCs移植治疗脑损伤和脑部疾病提供实验依据。方法孕14 d（El4）大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察,用免疫细胞化学染色以Nestin蛋白作为鉴定NSCs的标记物,以MAP2、GFAP蛋白检测NSCs的分化。取第3代（P3）NSCs向悬浮培养基中分别添加不同剂量的EPO,EPO浓度分别为0.5U/ml,5U/ml,50U/ml,500U/ml,并设不添加EPO的对照组,通过Caspase-3蛋白检测NSCs的凋亡。结果 1）提取和分离E14d SD大鼠的胚脑皮质,在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养,可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈Nestin阳性、BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。2）加入≥5U/ml EPO,神经球内Caspase-3的表达显著下降（P〈0.01）。结论 1）大鼠胚胎脑皮质体外培养可得到大量增殖的NSCs并能分化为神经元和神经胶质细胞,为NSCs的研究提供了适宜的细胞培养模型。2）加入≥5U/ml EPO可降低体外培养的鼠胚脑皮质NSCs的凋亡率。     

大鼠神经干细胞中PI3-K/AKT信号转导通路的研究

目的 应用PI3-K特异性阻滞剂LY294002孵育大鼠神经干细胞（NSCs）,探讨PI3-K/AKT信号转导通路在NSCs中的作用。方法 体外分离、培养E15～16 胎鼠NSCs,应用不同浓度（0~40 μmol/L）的LY294002孵育NSCs后进行细胞存活(WST-8检测)、增殖(BrdU免疫组织化学鉴定)、分化(β Tubulin-Ⅲ免疫组织化学鉴定)和AKT磷酸化蛋白水平(Western Blotting)的检测。结果 LY294002对NSCs的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性。在LY294002较高浓度（25、30、35、40 μmol/L）时,NSCs的存活率明显下降（P<0.05）;LY294002为30、35、40 μmol/L时,BrdU阳性细胞数明显少于正常对照组（LY294002 0 μmol/L）（P<0.05）;LY294002为35、40 μmol/L时,β Tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组（P<0.05）。LY294002 阻断AKT表达的作用呈剂量依赖性。结论 PI3-K/AKT信号转导通路对大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用。     

脊髓损伤后m6A甲基化修饰在神经干细胞自发分化中的调控作用

目的探讨脊髓损伤后mRNA m6A甲基化修饰对神经干细胞自发分化的调控作用。方法8周龄C57小鼠构建脊髓钳夹损伤模型,采用后肢运动功能评分（basso mouse scale, BMS）评价小鼠脊髓钳夹损伤模型构建情况;脊髓组织冰冻切片免疫荧光染色检测脊髓损伤1、3d后,损伤位点周围神经干细胞的数量及m6A甲基化水平;microRNA干扰技术敲低神经干细胞内的METTL14蛋白表达,并利用细胞免疫荧光检测神经干细胞自发分化后,神经元细胞、少突胶质细胞及星形胶质细胞数量;Western印迹法及Northern印迹法检测髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）与神经干细胞共培养后神经干细胞内METTL3、METTL14、FTO及ALKBH5蛋白表达情况及细胞内m6A甲基化水平。结果BMS评分结果表明小鼠脊髓钳夹损伤模型构建成功。免疫蛋白印迹结果显示,脊髓损伤后组织内脊髓损伤后星形胶质细胞的细胞标志蛋白GFAP显著增加,神经元标志蛋白NeuN和少突胶质细胞标志蛋白MBP表达显著降低。组织免疫荧光结果表明,损伤早期受损位点周围神经干细胞标志蛋白NESTIN达量增加,但m6A水平减少。细胞免疫荧光结果表明,m6A甲基化水平降低可促进神经干细胞神经向星形胶质细胞的自发分化。免疫蛋白印迹结果显示,MBP处理神经干细胞可使细胞内METTL3/METTL14表达量及细胞整体m6A甲基化水平降低。结论脊髓损伤后mRNA m6A甲基化降低可促进神经干细胞向星形胶质细胞分化。     

神经干细胞分化前后基因表达变化的DNA微阵列分析

目的：了解神经干细胞分化前后的差异表达基因，为神经干细胞的分化调控提供基础研究资料。方法：利用细胞培养、DNA微阵列技术等，检测了神经干细胞分化前后的差异表达基因。结果：检测到了1000多个差异表达基因，其中明显上调的基因138个，明显下调的基因179个，基因种类很多如细胞周期相关基因、发育与分化相关基因、受体与通道相关基因、细胞骨架相关基因、生长因子相关基因、原癌基因和抑癌基因、转录和翻译调节基因、ESTs、代谢调节、蛋白运输相关基因等。结论：大量基因参与了神经干细胞的分化调控，其确切调控机制，还有待于进一步深入研究。     

磷脂酰肌醇-3激酶/Akt在体外神经干细胞存活和分化中作用的实验研究

目的:探讨磷脂酰肌醇-3激酶/Akt信号途径在体外培养神经干细胞存活、分化中的作用.方法:分为对照组、wortmannin组和LY294002组;免疫组化检测Nestin、NSE和S100的表达;TUNEL评价细胞凋亡率;Western Blotting检测磷酸化Akt、Caspase-9的表达.结果:随着wortmannin和LY294002浓度增大,细胞凋亡率逐渐增加.随着wortmannin和LY294002浓度增大,磷酸化Akt的表达逐渐减弱.高浓度时磷酸化的Caspase-9表达减弱.结论:神经干细胞存活依赖于PI3K/Akt途径的活化,其机制可能是PI3K/Akt活化后,促进了Caspase-9等蛋白的磷酸化,抑制了细胞凋亡事件的发生.     

Wnt3a在大鼠骨髓源性胆碱能神经元中的表达

目的 通过研究大鼠骨髓基质细胞诱导的胆碱能神经元中Wnt3a的表达变化,了解Wnt3a在胆碱能神经元诱导分化过程中的作用,揭示神经元分化过程中可能的信号通路.方法 取Wistar雄性大鼠的股骨骨髓,培养骨髓基质细胞,经三代纯化CD71免疫细胞化学鉴定后进行分组实验.实验共分四组:骨髓基质细胞组,未加任何诱导因子;胆碱能神经元诱导分化组,加入Shh,RA和bFGF诱导基质细胞向胆碱能神经元分化,并用ChAT鉴定胆碱能神经元;神经干细胞诱导组,加入bFGF、EGF和RA诱导基质细胞为神经干细胞;自然分化组,加入血清诱导分化.提取细胞总RNA,利用RT-PCR进行Wnt3a的半定量分析.结果 与对照的骨髓基质细胞组,神经干细胞诱导组及自然分化组相比,Wnt3a在胆碱能神经元组中表达最高并且有统计学差异.结论 Wnt3a在骨髓基质细胞来源的胆碱能神经元中高表达,提示Wnt3a可能是胆碱能神经元分化的Wnt信号通路中的一个环节.     

BMP2在SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化中的调控作用

目的 研究BMP2在SVZa神经干细胞向γ-氨基丁酸(GABA)能神经元分化中的调控作用.方法 体外分离培养P0昆明小鼠室管膜下区(SVZa)神经干细胞,纯化传代培养3代后,使用不同浓度BMP2诱导SVZa神经干细胞,采用流式细胞仪检测不同浓度BMP2作用下SVZa神经干细胞分化为GABA能神经元的比例;另外利用活体荧光GFP标记GAD67特异性启动子,动态地研究BMP2在SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化中的作用.在此基础之上,采用RT-PCR检测不同浓度BMP2作用下Mash1的表达.结果 不同浓度BMP2作用组分化为GABA能神经元的比例均高于空白对照组,10 ng/ml浓度的BMP2组比例最高;10 ng/ml浓度BMP2组,GAD67-GFP标记阳性细胞数目明显高于对照组;10 ng/ml浓度BMP2组Mash1表达高于其他组.结论 BMP2促进SVZa神经干细胞向GABA能神经元的分化;10 ng/ml浓度的BMP2显著促进Mash1的表达.     

Id2在SVZa神经干细胞向神经元分化中的作用

目的研究DNA结合抑制物2(inhibitor of DNA binding2,Id2)在室管膜前下区(anteriorsubventricularzone,SVZa)神经干细胞向神经元分化中的作用。方法体外分离培养P0昆明小鼠SVZa神经干细胞,正义Id2、反义Id2真核表达质粒转染SVZa神经干细胞,采用流式细胞仪检测在Id2作用下SVZa神经干细胞分化为神经元的比例。采用Western blot检测不同浓度的骨形成蛋白2(bonemorphogenenticprotein2,BMP2)诱导下Id2蛋白的表达变化。结果正义Id2真核表达质粒转染组,SVZa神经干细胞分化为神经元的比例小于空白对照组,反义Id2真核表达质粒转染组,SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显高于空白对照组;随着BMP2浓度的增加,Id2的表达增加。结论Id2抑制体外培养的P0SVZa神经干细胞向神经元方向分化,BMP2可以促进SVZa神经干细胞Id2的表达,它们共同参与调控SVZa神经干细胞向神经元分化的过程。     

外源性重组HMGB1对神经干细胞增殖分化的影响及其机制研究

目的研究外源性重组高迁移率组蛋白B1（HMGB1）对神经干细胞增殖及分化的影响及其作用机制。方法在无血清的神经干细胞培养基中培养SD鼠大脑皮层细胞,传代扩增及纯化神经干细胞,免疫荧光检测神经干细胞标记物巢蛋白（nestin）,分析神经干细胞纯度。CCK-8测定加入不同浓度的重组HMGB1对神经干细胞增殖活性的影响,选择重组HMGB1的最适浓度进行后续实验;细胞免疫荧光检测重组HMGB1对神经干细胞分化的影响,Real-time PCR检测晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA、Toll样受体（TLRs）mRNA、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA、神经生长因子（NGF）mRNA的表达,Western blot检测RAGE、TLRs、MMP-9、NGF蛋白的表达。结果大鼠大脑皮层细胞在培养至第3代时,nestin鉴定神经干细胞纯度可达99%及以上。在重组HMGB1 10 ng/mL刺激下,神经干细胞增殖活性最高。实验组神经Ⅲ类β-微管蛋白（TUJ1）表达高于对照组(P<0.05),实验组RAGE、TLRs、MMP-9、NGF mRNA及蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论外源性重组HMGB1或可通过RAGE、TLRs、MMP-9等信号通路促进神经干细胞增殖及其向神经元方向分化。     

全反式维甲酸诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用

目的：观察全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）体外对大鼠中脑神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的诱导分化作用及其可能的分子机制。方法：分离培养孕14～15 d大鼠中脑NSCs,使用1.0μmol/L ATRA诱导1、3、5和7 d,以免疫组织化学染色观察ATRA对NSCs分化为多巴胺能神经元的影响;RT-PCR分析维甲酸（retiadic acid,RA）各受体表达情况。结果：ATRA诱导后多巴胺能神经元特异性酪氨酸羟化酶（TH）染色呈阳性,细胞有多个细长突起,与对照组比较,诱导7 d后多巴胺神经元特异性TH染色阳性细胞率均明显升高（P〈0.01）;各诱导组RA受体βmRNA的表达量均明显升高（P〈0.01）,而且存在时间依赖性。结论：ATRA能显著提高NSCs分化为多巴胺能神经元的比例,同时发现细胞维甲酸A受体（RAR）βmRNA表达增加,RARβ激活可能促进NSCs向多巴胺神经元方向的分化。