骨髓基质细胞移植后在损伤脊髓中的迁移和分布

目的观察骨髓基质细胞（BMSCs）移植后在损伤脊髓中的迁移和分布。方法40只Wistar大鼠随机分成4组，以改良Allen法制备脊髓损伤模型，B、C、D组分别在损伤后立即、24h、7d移植经CM—Dil荧光染料标记的第三代BMSCs，A组注射等量PBS，分别于BMSCs移植后24h、1、2．3、4周取损伤脊髓段作冰冻切片，倒置荧光显微镜下观测移植的BMSCs在损伤脊髓中的迁移和分布。结果移植后1周，各组移植的BMSCs基本位于硬脊膜下，移植后2—4周，BMSCs迁移、聚集在损伤脊髓的中心，D组损伤脊髓内BMSCs数量明显多于B、C组。结论（1）移植的BMSCs迁移聚集在损伤脊髓的中心；（2）在脊髓损伤后7d移植BMSCs较损伤后立即或1d后移植更利于BMSCs在损伤区的聚集。     

骨髓基质细胞经不同移植途径在损伤脊髓中的迁移

目的 观察骨髓基质细胞(BMSCs)经不同移植途径在损伤脊髓中的迁移和分布规律.方法 40只Wistar大鼠随机分成4组,以改良Allen法制备脊髓损伤模型.第3代BMSCs经CM-Dil荧光染料标记后按不同途径移植.A组:脊髓损伤后行第四脑室注射移植;B组:脊髓损伤后行损伤区蛛网膜下注射移植;C组:脊髓损伤后行损伤区远端蛛网膜下注射移植;D组:脊髓损伤后行股静脉注射移植.分别于移植后24 h、1、2、3、4周取损伤脊髓段作冰冻切片,倒置荧光显微镜下观测移植的BMSCs在损伤脊髓中心的聚集情况.结果 移植后24 h:除B组外脊髓损伤区未发现红色荧光;移植后1周,A、C组移植的BMSCs开始向脊髓损伤区迁移;移植后2周,除D组外,各组BMSCs迁移、聚集在损伤脊髓的中心;移植后3-4周,脊髓损伤区BMSCs数量减少,B组减少速度更快.结论 经第4脑室、硬脊膜下移植的BMSCs能迁移聚集在损伤脊髓的中心,经静脉移植的BMSCs极少迁移到损伤脊髓的中心.     

经嗅鞘细胞条件培养液诱导的骨髓基质干细胞移植对脊髓损伤修复的影响

[目的]研究经嗅鞘细胞条件培养液诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对脊髓损伤的治疗作用。[方法]采用脊髓挤压损伤方法,制造SD大鼠脊髓损伤动物模型(共24只),随机分成A、B、C三组(每组8只),立即分别将DMEM、BMSCs和经诱导的BMSCs移植入脊髓损伤部位,分别于移植4、8周后处死动物,均采用HE染色观察脊髓损伤处空洞面积改变情况;并采用抗神经丝(NF)抗体、生长相关蛋白-43(GAP-43)抗体和神经元特异性核蛋白(Neu N)抗体免疫组织化学荧光染色,观察移植的BMSCs存活和分化情况及损伤部位神经纤维再生情况。[结果]移植4、8周后,脊髓损伤区空洞为移植细胞充填,空洞面积明显减少,差异有统计学意义(P0.01),BBB评分结果 C组和A、B组之间存在统计学差异(P0.05)。B、C组均可见再生神经纤维形成,同时部分移植细胞呈Neu N染色阳性,在C组上述改变更加显著。[结论]经嗅鞘细胞条件培养液诱导的BMSCs可以在脊髓损伤区存活,能够显著减小脊髓损伤处空洞面积,并可以促进脊髓损伤区神经纤维的修复再生,促进大鼠双下肢运动功能的恢复。     

骨髓基质细胞移植治疗神经系统损伤现实价值及机制

具有多向分化潜能的骨髓基质细胞(BMSC)在脑神经领域的研究较为深入,其可分化为神经细胞修复脑神经组织损伤及其基础研究成果,为修复脊髓损伤研究提供了部分依据.近年BMSC移植修复脊髓横断伤的动物实验研究也表明其时脊髓损伤有积极意义.根据目前研究成果,推测其可能的修复作用机制有BMSC直接分化为神经元样细胞、分泌神经营养因子、介导免疫清除作用、激活神经细胞自我修复和抑制疲痕过度生成等.该文就相关基础研究作一综述.     

嗅鞘细胞和骨髓基质干细胞联合培养修复大鼠脊髓损伤

目的 探讨嗅鞘细胞(OECs)和骨髓基质干细胞(BMSCs)联合移植修复脊髓损伤的疗效.方法 采用改良Allen法,制备大鼠脊髓损伤模型,随机分成5组:手术对照组、正常对照组、单细胞移植组(OECs或BMSCs)和联合移植组.将联合培养的OECs和BMSCs移植到脊髓完全损伤的大鼠体内.评定功能恢复状况,采用荧光技术对标记后的脊髓进行示踪.结果 OECs和BMSCs移植后均可在体内存活.移植4周后与手术对照组(0.88±0.23)比较,OECs组(2.67±0.24)和BMSCs组(2.66±0.14)的大鼠脊髓功能均有改善,联合移植组(3.12±0.52)功能改善最佳(P＜0.01).结论 OECs与BMSCs在体外可联合培养,OECs的培养液对BMSCs具有向神经元分化的趋化作用,并且两者在移植后均可存活,联合移植较单细胞移植的修复作用更佳.     

骨髓基质干细胞和神经生长因子悬液移植对脊髓损伤修复的影响

目的研究骨髓基质干细胞(BMSCs)移植联用神经生长因子(NGF)对脊髓损伤修复的治疗作用。方法用改良Allen法制成SD大鼠脊髓损伤动物模型(共32只),1周后分别将DMEM、BMSCs、NGF和BMSCs NGF移植入脊髓损伤部位即制成四组(每组8只),移植1、2个月后分别采用神经核蛋白(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和神经丝蛋白(NF)抗体进行免疫荧光染色观察移植的BMSCs的存活及分化情况、损伤部位神经纤维的再生情况。HE染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况。同时采用BBB运动评分观察大鼠运动功能恢复情况。结果移植1、2个月后,部分移植细胞呈NeuN和GFAP阳性,同时实验组可见明显的神经纤维再生。脊髓损伤处的空洞面积明显减小,差异有显著性意义(P＜0．05),BBB评分结果比对照组均有明显增高,差异有显著性意义(P＜0．05)。在BMSCs NGF组上述改变更加显著。结论BMSCs可在脊髓损伤处分化为神经元和神经胶质细胞,BMSCs和NGF能够减小脊髓损伤处的空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复,两者联合应用在脊髓损伤修复治疗中具有协同作用。     

骨髓基质干细胞移植与脊髓损伤

目前，脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的治疗仍然是骨科领域中一个极具挑战性的课题。传统观点认为脊髓损伤是不可修复和再生的。现在认为神经元和神经胶质的丧失是脊髓损伤后神经功能永久性障碍的主要原因。由于中枢神经系统的自我修复能力有限，神经元和神经胶质无法再生修复。近年来，随着神经生物学研究和组织工程学的迅速发展，人们对神经干细胞和骨髓基质干细胞（marrow stromal cells，MSCs）研究逐渐深入，通过干细胞移植替代缺失的神经细胞有望成为治疗脊髓损伤的有效办法。     

细胞移植治疗脊髓损伤

细胞移植治疗脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是近来SCI治疗的研究热点，主要是通过细胞移植来促进变性神经元的再生和抑制胶质瘢痕形成，达到修复受损的神经通路和突触连接。细胞移植根据移植物的不同可以大体分为神经细胞和非神经细胞移植，移植物包括周围神经源性神经元、嗅鞘细胞、活化巨噬细胞、骨髓基质细胞、少突胶质细胞前体细胞、胚胎干细胞以及转基因细胞等。这些实验方法已经陆续开始应用于临床，给曾经被认为完全不可治愈的脊髓损伤带来了希望。     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF表达及细胞凋亡的影响

[目的]研究骨髓基质细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达及神经细胞凋亡的影响,探讨骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的机制.[方法]取大鼠股骨和胫骨骨髓培养BM-SCs并传代.参照Taoka's方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.脊髓损伤后30 min,进行BMSCs或DMEM培养液损伤周围注射.术后3、7和14 d,应用Westem Blot法检测损伤脊髓组织内VEGF蛋白的表达,应用TUNEL方法检测脊髓损伤周围神经细胞凋亡情况.[结果]移植术后3、7、14 d,BMSCs组VEGF蛋白的表达水平呈时间依赖性增加,与DMEM组相比,术后3 d两组VEGF蛋白表达水平没有显著性差异(P>0.05),而术后7和14 d,BMSCs组VEGF蛋白表达水平显著高于DMEM组(P<0.01).此外,与DMEM组大鼠相比,移植术后3、7和14 d,BMSCs移植显著减少脊髓损伤周围区凋亡的神经细胞数目(P<0.05).[结论]脊髓损伤后,BMSCs移植能够增加VEGF蛋白的表达并且抑制神经细胞凋亡.     

自体骨髓基质细胞移植治疗兔膝关节半月板无血运区损伤

目的 观察自体骨髓基质细胞在体内分化为软骨细胞的能力及对半月板无血运区损伤修复的影响。方法 将体外培养的自体骨髓基质细胞收集后与纤维蛋白凝胶混合,植入４０只成年兔一侧膝半月板无血运区损伤的裂口内,另侧设空白对照或单纯纤维蛋白凝胶植放。分别于术后１（１２只）、２（１２只）、３（１５只）个月取村,行肉眼、光镜组织学观察。结果 术后２个月１２个膝半月板损伤处在量的软骨细胞并有胶原纤维形成,３个月１３个膝     

Migration and distribution of bone marrow stromal cells in injured spinal cord with different transplantation techniques

Objective： To study the regularity of migration and distribution of bone marrow stromal cells （BMSCs） in injured spinal cord with intradural space transplantation. Methods： Forty Wistar rats were randomly assigned into 4 groups. The spinal cord injury model was prepared according to the modified Allen method. BMSCs were labeled by CM-Dil. And 5.0x 10^6 cells were transplanted by different channels including intraventricular injection （Group A）,injured spinal cord intrathecally injection （Group B）, remote intrathecally injection at the L3-L4 level （Group C）, and intravenous injection （Group D）. Spinal cord was dissected at 24 hours, 1, 2, 3 and 4 weeks after transplantation. Sections of 4 μm were cut on a cryostat and observed under fluorescence microscopy. Results： No fluorescence was observed 24 hours aftertransplantation in spinal cord injury parenchyma except Group B. One week later, BMSCs in Groups A and C began to migrate to the injured parenchyma; 2-4 weeks later, BMSCs penetrated into the injured parenchyma except Group D. The number of BMSCs decreased at 3-4 weeks after transplantation. The number of cells in Group B decreased faster than that of Groups A and C. Conclusions： BMSCs transplanted through intraventricular injection, injured spinal cord intrathecally injection and remote intrathecal injection could migrate to the injured parenchyma of spinal cord effectively. The number of BMSCs migrated into injured spinal cord parenchyma is rare by intravenous injection.     

移植定向诱导的人骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤

目的研究脊髓损伤后植入定向诱导的人骨髓间充质干细胞是否有助于动物功能的恢复及不同植入时间对其是否存在影响。方法SD大鼠36只，制成脊髓损伤模型并随机分为A、B、C三组，A组于脊髓损伤后立即进行细胞移植，B组于损伤后1周进行细胞移植，C组作为对照组观察。在脊髓损伤后的1～6周，对各组动物进行BBB评分，应用SPSS12．0进行数据分析，并通过免疫荧光技术检测Brdu标记细胞的存活及与宿主脊髓的整合情况。结果B组动物的BBB评分提高显著，较其他两组差异有统计学意义。B组免疫荧光显示，移植细胞大量存活并与再生的宿主神经纤维形成网状结构，桥接于脊髓损伤区的两端。结论延期移植定向诱导的hMSCs可促进脊髓损伤动物功能的恢复。     

骨髓基质干细胞在损伤脊髓内向少突胶质细胞定向分化的研究

目的 探讨移植骨髓基质干细胞(BMSCs)在损伤脊髓内向少突胶质细胞分化的可能性.方法 应用低温包埋免疫电镜技术观察迁移在损伤脊髓内1、3、5周的移植BMSCs超微结构,应用免疫荧光标记和激光共聚焦技术观察迁移在损伤脊髓内1、3、5周的移植BMSCs表达髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓鞘蛋白前脂蛋白(PLP)的情况.结果 移植1周,迁移在损伤脊髓白质内的BMSCs体积较小,突起少,细胞核较小,核仁清楚,染色质分布尚均匀,线粒体、粗面内质网和核糖体等细胞器发达,具有少突胶质细胞的超微结构特点;移植3周和5周,迁移在损伤脊髓白质内的BMSCs具有成熟少突胶质细胞的超微结构特点,并形成髓鞘样结构.移植1周后,迁移在损伤脊髓白质内的BMSCs开始表达MBP和PLP;移植3周和5周后,迁移在损伤脊髓白质内的BMSCs继续表达MBP和PLP.结论 移植BMSCs在损伤脊髓内可能会部分分化为功能性少突胶质细胞.     

静脉移植骨髓间充质干细胞在大鼠损伤脊髓中的存活与分化

目的:探讨脊髓损伤后静脉移植骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)治疗脊髓损伤的可行性。方法:体外分离、培养、扩增、纯化、BrdU(5-溴尿嘧啶)标记10只同种异体SD大鼠的BMSCs;WD法制成同种SD大鼠完全性截瘫的脊髓损伤动物模型,制模后7d随机分为A、B、C三组,A组22只,为应用BM-SCs移植组,B组22只,作为对照组,C组16只,作为空白对照组。A组经鼠尾静脉注射BMSCs悬液(2×106个/ml)1ml,B组经鼠尾静脉注射1mlL-DMEM液,C组作为空白对照组。注射后2、3、6周用免疫组织化学检测BMSCs在损伤段脊髓的存活、分布、分化情况并作计数观察。结果:A组移植后2、3、6周BrdU阳性的BMSCs主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内;移植后2周BrdU阳性的BMSCs约占移植细胞数的4.9%,移植后3周占4.4%,移植后6周占2.9%。移植后2周,BMSCs形态大多变为圆形或椭圆形,部分阳性标记的细胞长出神经元样突起,约12.6%表达星形胶质细胞特异性蛋白GFAP,约5.4%表达神经元特异性核蛋白(NeuN)。B、C组损伤段脊髓内未见有BrdU阳性细胞。结论:脊髓损伤后静脉移植的BMSCs能在脊髓损伤灶内停留、存活,表现出对损伤灶的趋化性,部分存活的BMSCs可向神经元和星形胶质细胞分化,可用于脊髓损伤的细胞移植治疗。     

静脉移植骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤后轴突再生的作用

目的:研究静脉移植骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSC)对脊髓损伤后轴突再生的影响。方法:体外分离、培养、扩增、纯化、BrdU标记10只同种异体SD大鼠的BMSC,WD法制成完全性截瘫的同种大鼠脊髓损伤动物模型。制模后7d随机分为A、B、C三组,A组22只,作为BMSC移植组,经鼠尾静脉移植2×106/ml的BMSC悬液1ml;B组22只,作为对照组,移植1mlL-DMEM液;C组22只,作为空白手术对照组。移植后1、2、3、4、5、6周用BBB评分评估各组后肢运动功能;移植后2、3、6周组织学及免疫组织化学观察并检测损伤段脊髓内生长相关蛋白-43(growth-associatedprotein-43,GAP-43)、神经丝蛋白200(neurofilament-200,NF200)的表达。结果:移植后3周开始,A组的BBB评分在各观察时间点明显高于B组、C组,移植后6周维持在较稳定水平,而B、C组在伤后3周开始维持在较稳定水平;在移植后2、3、6周,A组GAP-43、NF200的表达明显高于高于B组、C组,6周时开始下降,而B组与C组在移植后2、3、6周的表达均维持在相对恒定的水平。结论:大鼠脊髓损伤后静脉移植BMSC能使损伤段脊髓GAP-43、NF200表达上调,促进脊髓损伤后轴突再生和神经功能改善。     

骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用

目的 :初步探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的修复作用。方法:全骨髓培养法培养大鼠BMSCs,收集P2代细胞上清,Exo Quick Precipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Western blot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63。通过脊髓法建立大鼠SCI模型,造模1h后尾静脉给予外泌体移植500μl(外泌体蛋白浓度为200μg/ml),采用随机数字表法分将30只大鼠为三个组:假手术组、对照组(SCI+磷酸盐溶液)、外泌体组(SCI+外泌体),均采用BBB评分、斜板实验于造模后1、3、7、14、21、28d评价大鼠运动功能恢复情况,并于术后28d处死取材,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(luxol fast blue,LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目。结果:透射电镜下可见大量直径40~100nm的立体圆形或茶托形的小囊泡结构,外周可见完整的类脂质膜性结构,内含低电子密度物质。Western Blot显示CD9、CD63蛋白表达阳性。造模后假手术组各时间点的BBB评分和斜板评分均正常,对照组和外泌体组BBB评分和斜板评分均低于假手术组(P0.05),造模后7、14、21、28d外泌体组BBB评分分别为6.30±0.95、12.70±1.57、16.60±1.08、17.00±0.67分,均高于同时间点对照组的2.50±1.08、6.90±0.99、10.50±0.85、12.50±1.08分(P0.05)。造模后7、14、21、28d外泌体组斜板评分分别为43.00±3.50、55.50±4.38、62.50±2.64、65.00±3.33分,均高于同时间点对照组的34.00±3.16、43.00±4.22、49.00±4.59、52.50±4.25分(P0.05)。造模后28d,假手术组脊髓组织HE染色、LFB染色、Nissl染色正常,对照组脊髓空洞形成、髓鞘排列紊乱、神经元数目减少,外泌体组与对照组比较脊髓组织损伤程度减轻,存活神经元数目增多(P0.05)。结论:MSCs来源的外泌体可减轻脊髓损伤后的病理变化,改善运动功能,促进脊髓损伤后神经功能修复。     

静脉注射骨髓间质干细胞对脊髓损伤修复作用的实验研究

目的探讨静脉注射大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)对脊髓损伤后神经修复和功能恢复的影响。方法32只SD大鼠,体重约300g,雌雄不限。体外分离、培养、纯化MSCs,应用流式细胞技术检测MSCs表面细胞标志CD34、CD45、CD29、CD90。根据改良Allen法制备大鼠脊髓损伤模型。暴露T10段脊髓,将一直径为3mm的圆形薄铜垫片置于T10段脊髓表面,以重量为10g的砝码,从5cm高度自由坠落打击该垫片,造成T10段脊髓冲击伤,损伤组24只,假手术组8只。模型建立后24h,损伤组随机分为实验组14只,对照组10只。实验组及假手术组经尾静脉注射Brdu标记的MSCs,对照组经静脉注射PBS。损伤后24h、注射MSCs后1、3、5周评价各组大鼠的神经功能状况,并检测MSCs在体内迁移、存活以及分化情况。结果细胞CD34、CD45阴性表达,CD29、CD90阳性表达。实验组运动功能改善,BBB评分高于对照组(P<0.05)。注射的MSCs在宿主损伤脊髓中聚集并存活,注射MSCs3～5周后部分细胞表达微管相关蛋白2(MAP2)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色的Brdu阳性细胞。结论MSCs经静脉注射后可向脊髓损伤处聚集并存活,促进神经修复及神经功能的恢复。