绿色荧光蛋白－逆转录病毒的包装、筛选及克隆技术

绿色荧光蛋白—逆转录病毒(GFP-RV)基因载体,可用于组织工程研究中的细胞标记,具有良好的效果。由于GFP-RV是个假病毒,需要经过一系列     

增强型绿色荧光蛋白基因对树突状细胞功能的研究

目的研究瘤内注射的树突状细胞（DC）的迁移及在肿瘤局部的作用。方法建立大鼠C6脑胶质瘤颅内肿瘤模型，脂质体介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染DC细胞，瘤内注射DC后取大鼠同侧的淋巴结在荧光显微镜下检测，并用流式细胞仪检测肿瘤周围组织CD4^＋T和CD8^＋T细胞的浸润。结果同侧的颈深部淋巴结可见EGFP表达的DC，对侧淋巴结未见到。DC治疗组证实有CD4^＋T和CD8^＋T明显浸润（CD4^＋T8．19％，CD8^＋T11．05％），RPMI1640治疗组CD4^＋T0．95％和CD8^＋T1．17％，生理盐水对照组CD4^＋T0．62％和CD8^＋T0．77％。结论瘤内注射的DC不仅能够迁移，而且有效地引起肿瘤局部的T细胞显著浸润，为瘤内注射DC细胞提供了依据。     

增强型绿色荧光蛋白基因转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的：以重组腺病毒（Ad）为载体,将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染至小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）中,为MSCs体内示踪提供实验基础。方法：用全骨髓细胞贴壁法分离纯化小鼠MSCs并体外扩增、鉴定,以重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒（Ad-EGFP）转染,并用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染率,CCK-8法检测转染细胞的增殖活性。结果：转染后10h MSCs开始表达荧光,6～8天达高峰,转染率可达92.3%,28天仍有表达;转染细胞的增殖活性和未转染细胞无统计学差异。结论：Ad-EGFP能高效、安全的转染mMSCs。     

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染对人骨髓基质细胞体外成骨诱导的影响

目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人骨髓基质细胞(MSC)，对其体外诱导后表达成骨表型的影响，探讨EGFP作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，并转染骨髓基质细胞，G418进行筛选。将转染后稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞(MSC-EGFP)进行成骨诱导扩增，以未转染的MSC为对照组，分别检测成骨诱导后碱性磷酸酶(AKP)活性，骨钙蛋白(OCN)含量和成骨细胞转录因子(Cbfal)的表达。结果 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，转染后获得稳定表达绿色荧光蛋白的MSC-GFP，其体外经成骨诱导后，同样能表达成骨特征性表型，AKP，OCN，Cbfal表达和未转染组无明显差别。结论 MSC转染EGFP后，不影响其体外成骨诱导后成骨表型的表达，EGFP可作为骨组织工程种子细胞(MSC)良好的示踪剂。     

绿色荧光蛋白标记神经干细胞的体外研究

目的　构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)基因的逆转录病毒载体pLNCX2 GFP ,用GFP对神经干细胞进行标记示踪。方法　应用基因克隆的方法 ,制备 pLNCX2 GFP ,借助阳离子脂质体转染包装细胞PA3 17,G418筛选阳性克隆 ,获取病毒上清 ;从胚胎大鼠脑中解剖分离和培养神经干细胞 ,用病毒上清感染大鼠胚胎神经干细胞。结果　经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了重组GFP逆转录病毒 ,pLNCX2 GFP转染包装细胞后可以产生GFP逆转录病毒 ,病毒感染大鼠胚胎神经干细胞可以长期表达绿色荧光。结论　逆转录病毒能够快速、稳定、长期地将GFP基因转入神经干细胞 ,这种标记方法非常有利于神经干细胞移植后结构和功能的研究     

2型重组腺相关病毒/增强型绿色荧光蛋白转染胰腺癌细胞PANC-1的体外研究

基因治疗的关键是目的基因的高效转染和表达。我们采用2型重组腺相关病毒（rAAV2／EGFP）对人胰腺癌细胞PANC-1进行体外基因转移，观察EGFP基因能否在PANC-1中有效表达及其细胞毒性，探讨rAAV2介导目的基因转导胰腺癌细胞的效率。[第一段]     

绿色荧光蛋白在人大肠癌HT-29c细胞的表达

目的 观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）在人大肠癌细胞的表达情况。方法 构建逆转录病毒载体质粒prkat EGFP/neo,用磷酸钙沉淀法转导293T细胞,48h获得高滴度病毒颗粒上清液并转染人大肠癌HT－29c细胞。荧光显微镜及流式细胞仪观察转染的EGFP基因在人大肠癌HT-29c细胞体内外的表达。结果 携带EGFP的逆转录病毒载体能有效地转染人大肠癌细胞,HT－29c细胞能稳定、高铲和持久地表达EGFP,与未来转染细胞比较,它们的生物学特性未改变（F＝0.62,P＞0.05）。在裸大鼠皮下肿瘤中,EGFP也能稳定、高效的表达。结论 外源性EGFP能在人大肠癌HT－29c细胞内进行有效的复制、转录和翻译,在体内外可持续、稳定、高效的表达。它能作为一种新的实验方法应用于肿瘤细胞生长、扩散和转移的研究。     

表达增强型绿色荧光蛋白的骨肉瘤细胞亚株建立及生物学特性

目的 建立经绿色荧光蛋白基因转染的骨肉瘤细胞亚株并研究其生物特性。方法 利用脂质体转染增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒（pEGFP-N1）人人骨肉瘤MG63细胞系，通过有限稀释法和细胞电泳，获得两株细胞克隆M6和M8，经体外细胞增殖、软琼脂形成、生长曲线、裸鼠成瘤试验综合分析其生物学行为改变。应用组织形态学观察、染色体分析、软琼脂克隆形成法研究癌细胞的生物学特性。结果 M6和M8两株在细胞电泳率和侵袭性上差异有统计学意义（P〈0．05），其中M6的群体倍增时间为38．4h，软琼脂形成率为18．7％，M8群体倍增时间为23．0h，软琼脂形成率为29．3％。裸小鼠背部皮下接种M6和M8，发现M8成瘤时间短，细胞增殖快，但在4周内两者均不发生转移。结论 骨肉瘤细胞亚系有不同的转移特性，GFP的整合及表达未对MG63细胞的生长状态造成明显影响，可作为报告基因进一步了解骨肉瘤细胞转移的差异性分析。     

兔骨髓基质干细胞成骨诱导及增强型绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外转染的研究

目的探讨重组增强型绿色荧光蛋白基因腺相关病毒(AAV-EGFP)对细胞生物学行为的影响,为组织工程寻找一种理想的病毒载体及细胞示踪标记方法。方法采用全骨髓法分离培养BMSCs,诱导培养液诱导细胞成骨转化,行细胞形态学检查、细胞表面抗原鉴定、碱性磷酸酶(ALP)染色及Von Kossa染色,评价细胞成骨情况。在此基础上转染AAV-EGFP,观察细胞形态学改变及荧光表达的时间与强度,计算转染效率,确定转染的较佳感染复数(MOI)值,MTT法描记细胞生长曲线,观察AAV载体对细胞活性的影响。结果细胞扩增迅速、形态良好、纯度较高,经诱导后呈现明显的成骨改变。实验确定AAV转染细胞的较佳MOI值为1×10~5,以此值转染AAV-EGFP后细胞荧光持续高效稳定表达(＞8周),并可随细胞有丝分裂传至子代,可以满足示踪标记的需要,AAV转染效率高,对细胞活性影响小。结论AAV长期稳定表达目的基因,是一种理想的组织工程病毒载体；基于基因转染方法高效稳定表达EGFP,可作为种子细胞良好的示踪标记方法。     

绿色荧光蛋白基因逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞及表达的研究

目的　绿色荧光蛋白 (EGFP)基因的逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞(MSCs)及其表达情况。方法　pEGFP与逆转录病毒载体经过酶切、连接等构建重组的EGFP 逆转录病毒载体 ,转染PA3 17细胞 ,用G418筛选出抗性克隆 ,获病毒上清 (滴度达到 8.5× 10 5cfu/ml)并感染人MSCs。流式细胞仪测定转染效率后加入成骨细胞分化培养夜 (地塞米松 (10 -7mol/L)、β 甘油磷酸钠 (10mmol/L)、维生素C(5 0mg/L ) ) ,2周后观察转染细胞的分化情况。 结果　 48h后细胞转染效率为 7% ,G418筛选 2周后约 97%细胞出现抗性克隆 ,表达维持 4周。基因转染细胞能够分化为成骨细胞。结论　重组EGFP逆转录病毒载体能转染MSCs ,且不影响细胞的功能。     

酵母单细胞蛋白絮凝分离的研究

本文提出了分离酵母单细胞蛋白的一种新方法——用絮凝沉降法分离酵母单细胞蛋白;研究了鞣酸+A对酵母细胞的絮凝作用。探讨鞣酸+A絮凝酵母细胞的机理;较为系统地研究了环境因素对鞣酸+A絮凝酵母细胞的影响;首次将质心映射优化法(CMO法)和响应面法(RSM法)结合起来,运用计算机优化了絮凝条件,并就鞣酸+A对酵母细胞的絮凝作用进行表征;通过对酵母细胞表面的X-射线能谱分析,证实金属离子Ca~(2+)、Cd~(2+)、Mn~(2+)和K~+参与了鞣酸+A对酵母细胞的絮凝作用。通过鞣酸+A絮凝酵母细胞的小试研究,可以认为采用絮凝沉降法分离酵母单细胞蛋白是可行的,且节能效果显著,具有较大的现实意义。     

组织工程技术修复同种异体兔关节软骨缺损实验研究

目的：探讨关节软骨缺损治疗的新途径。方法：把几丁糖作为软骨细胞培养的支架。将几丁糖与软骨细胞一起体外培养,然后移植修复同种异体兔的膝关节软骨缺损,并对关节软骨的修复过程进行术后16周大体、组织学、电镜观察及修复组织厚度测定。结果：几丁糖无纺网在术后2周开始降解吸收,术后10-12周完全吸收;术后第16周在实验侧关节软骨缺损处可见成熟的透明软骨,软骨缺损得到完全修复。结论：几丁糖泊生物学特性符合组织工程中对细胞培养支架的要求;几个糖负载软骨细胞移植修复同种异体兔膝关节软骨缺损,兔膝关节全层软骨缺损得到成功修复。为临床上关节软骨缺损的治疗提供了可能的途径。     

不同体外诱导时间对BMSCS成软骨分化的组织学特性影响的研究

目的探索体外不同时间的成软骨诱导,对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的组织学特性的影响。方法以猪第2代BMSCs为种子细胞,以聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)为支架,体外构建直径12 mm,厚3 mm的圆盘状复合物,联合应用TGF-β1(10 ng/mL)、IGF-I(50 ng/mL)及地塞米松(40 ng/mL),体外分别诱导1周和4周,并以未经诱导的BMSCs和软骨细胞为对照,分析和比较不同诱导时间对BMSCs体外成软骨分化的影响。结果体外诱导4周的BMSCs-PGA/PLA复合物的组织学结构明显较只诱导1周的致密,软骨特异性基质(如蛋白多糖、Ⅱ型胶原等)表达水平明显高于诱导1周的。结论体外诱导时间对BMSCs软骨定向分化具有重要影响,延长诱导时间可明显促进复合物成熟并增加其软骨基质分泌。     

猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的体外构建

目的探讨猕猴骨髓间充质干细胞作为种子细胞与去细胞同种异体神经作为支架，体外构建人工神经的研究。方法采用密度梯度离心的方法分离并培养猕猴骨髓间充质干细胞，利用相差显微镜观察细胞生长情况并描绘其生长曲线；取猕猴3段4cm的周围神经，其中2段用4％triton—X-100及4％脱氧胆酸钠液分别萃取1次和2次，在新鲜神经和萃取神经中段取材，组织学检测及电镜学观察萃取前后的形态学变化；采用显微注射的方法把猕猴骨髓间充质干细胞种植到萃取两次的异体神经内，HE染色观察细胞在支架内的生长情况。结果猕猴骨髓间充质干细胞自我增殖能力强；萃取1次的异体神经细胞及髓鞘结构仍部分存留，而萃取2次的其细胞及髓鞘结构消失；HE染色可见细胞在萃取2次的异体神经内可爬行生长。结论猕猴骨髓间充质干细胞与化学萃取的去细胞同种异体神经适合体外构建人工神经。