血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良**★

背景：如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题。 目的：改良血管组织工程种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：以细胞为培养对象，观察性实验，于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成。 材料：新西兰家兔，体质量2 kg左右，用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养。 方法：以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴壁法培养血管平滑肌细胞。 主要观察指标：免疫细胞化学法对两者进行鉴定；流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数。 结果：培养的种子细胞符合各自特征，免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%。 结论：胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞；第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管。     

小肠黏膜下层无细胞基质作为阴道平滑肌细胞载体的可行性

摘要 背景：目前国内外用于阴道组织工程研究的主要支架材料聚乙醇酸存在降解过快等缺陷。天然脱细胞支架材料尤其是小肠黏膜下层逐渐成为组织工程研究的重点。 目的：探索用猪小肠黏膜下层基质作为组织工程学阴道细胞载体的可行性。 方法：取新西兰雌兔,分离出阴道平滑肌组织块,组织块+酶消化法原代培养阴道平滑肌细胞。体外培养传代后作为种子细胞接种于自制猪小肠黏膜下层基质体外联合培养,倒置显微镜动态观察细胞形态及生长增殖情况,分别于1,2,3,4周时取标本,行组织学检查。 结果与结论：①体外成功培养出阴道平滑肌细胞,倒置显微镜下,见培养的阴道平滑肌细胞呈现长梭状,细胞集结于培养皿上形成典型的“峰和谷”样构型。②黏膜下层无细胞基质外观呈白色,半透明,有一定韧性。苏木精-伊红染色未见细胞成分存在。③阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片苏木精-伊红染色后,光镜下可见细胞成分逐渐增多,由表浅向深层部位生长。④阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片采用抗兔平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色后,均可见抗兔α-Actin的阳性细胞。结果初步证明了猪小肠黏膜下层基质可作为一种平滑肌细胞载体。 关键词：阴道平滑肌细胞;组织工程;猪小肠黏膜下层;细胞载体;支架材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.001     

三种方法原代培养人牙周膜细胞

背景：牙周膜细胞培养是牙周细胞生物学研究的基础。牙周膜细胞原代培养因其成功率较低,一直是制约牙周细胞生物学研究的瓶颈之一。如何寻找一种简单有效的培养方法,提高原代培养成功率一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一。 目的：比较组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法对人牙周膜细胞的培养效果,探索一种更有效的人牙周膜细胞的体外培养方法。 方法：取58例正常恒牙牙周膜组织,随机分为3组,分别采用组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法进行原代培养,再进行传代培养、倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态;免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白;取第4代细胞,绘制生长曲线。 结果与结论：酶消化结合组织块法培养成功率(35%)明显高于其他两种方法(11%和21%)。3种方法获得的细胞均符合正常人牙周膜细胞形态学特征和生物学特征,生长良好。第4代细胞生长曲线均为近似的“S”形,有明显的滞留期、对数生长期和平台期。提示实验建立的酶消化结合组织块法较为简单并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜细胞的可行办法。     

人脑动静脉畸形血管平滑肌细胞的培养和鉴定

目的:建立一个稳定的人脑动静脉畸形血管平滑肌细胞的培养体系。方法:取手术切除的人脑动静脉畸形组织块以酶消化法接种于铺有胶原底层的培养瓶中进行原代及传代培养,并对其进行形态学观察、免疫组化染色及透射电镜等一系列细胞定性研究。结果:接种后6-8 d后可见少量细胞贴壁,所获培养细胞经免疫组化、透射电镜鉴定证实为血管平滑肌细胞,而且细胞纯度较高,细胞可以连续传代18代。结论:应用酶消化法可获得纯化的血管平滑肌细胞,细胞可以连续传代培养。培养动静脉畸形血管平滑肌细胞可应用于体外作进一步的深入研究。     

第一鳃弓外胚间充质细胞体外培养模型的构建☆

背景：在牙颌面的发育形成过程中，第一鳃弓作为过渡结构，发挥着不可替代的重要作用。目前，国内外对于第一鳃弓外胚间充质细胞的研究资料相对较少。 目的：分离培养小鼠第一鳃弓外胚间充质细胞。 方法：显微解剖E9.5胎鼠第一鳃弓，采用组织块法和酶消化法对其进行原代培养，通过细胞形态观察、细胞生长曲线描记、计算细胞倍增时间和特异性标记物检测对其细胞生物学特性进行研究。 结果与结论：组织块法原代培养细胞的时间7~10 d，上皮细胞成分较多，酶消化法原代培养细胞时间两三天，上皮细胞成分较少，两组细胞传代后细胞形态、细胞生长曲线、群体倍增时间无明显差异。特异性标记物CD57/HNK1、波形丝蛋白免疫细胞化学染色呈均一表达。提示采用酶消化法可以在短时间内获得数量充足、纯度较高、满足实验要求的细胞。     

组织块法培养成体人牙髓细胞的增殖及分化状态

背景: 人牙髓组织较少,对酶解消化的耐受性较差,经胰蛋白酶和胶原酶分步消化处理后,细胞贴壁数量少,生长缓慢,难以成功传代,组织块酶解法获得的牙髓细胞种类少,活性差。 目的：探索组织块培养法在人牙髓细胞体外培养中的应用。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2005/2007年在吉林大学和平校区及口腔医学院进行。 材料：健康人正畸或阻生拔除的牙齿。 方法：选取第三磨牙,取出牙髓,在少量DMEM培养液浸润下,将牙髓组织剪碎至 1.0 mm×1.0 mm×0.5 mm组织块,将牙髓组织块移入含培养液的6孔板中,调整组织块密度至3~6块每孔,间距0.5 cm均匀摆置。将6孔板倒置放入37 ℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度条件的培养箱中,3h后翻转培养板,保持组织块贴壁生长,加培养液至2 mL后继续培养。4~6 d换液1次,细胞6~15 d从组织块边缘游出,在组织块周围形成生长晕。细胞渐进汇合时,以用0.25%的胰蛋白酶、0.02%EDTA的混合液消化2.0~3.0 min,按1∶(2~3)的比例传代培养至25 mL培养瓶。原代培养细胞通过反复消化传代的方式逐渐获得纯化的成纤维样细胞。 主要观察指标：采用免疫组织化学方法鉴定细胞形态,碱性磷酸酶值测定牙髓细胞分泌。MTT法绘制牙髓组织细胞生长曲线。 结果：相差显微镜下,获得的牙髓细胞主要是典型成纤维细胞,形态多呈星形、长梭形, 胞体丰满,胞浆均匀,核圆形或卵圆,核仁清晰。免疫组织化学检测显示,细胞表面波丝蛋白阳性、角蛋白阴性,碱性磷酸酶阳性。在接种于96孔平底培养板1 d后,细胞数量有所下降,但在接种2 d后数量又有所增加,此时细胞增加不很明显。4 d开始进入对数生长期,细胞增加显著,8 d进入平台期,9 d开始减少,整个细胞曲线呈“S”形。 结论：采用组织块培养法从成体人牙髓组织中可以分离培养出细胞,在体外能有效增殖并保持低分化状态。     

改良分步消化法培养原代软骨细胞**★

背景：胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂，容易污染，但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道。 目的：采用改良分步消化法进行软骨细胞培养，以获取大量纯净的软骨细胞。 方法：将新西兰白兔6只随机分2组，酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞，对照组用传统法进行原代软骨细胞培养。培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态，并进行细胞鉴定、计数，评估改良后的方法对细胞的影响。 结果与结论：酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞，与对照组相比，可将6 h以上的消化时间缩短至3 h。两组原代软骨细胞培养24 h均多呈圆形，悬浮状态，48 h后贴壁，培养1周后，两组软骨细胞可铺满培养瓶底。结果证实，采用改良分步消化法进行软骨细胞培养，在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变，可以顺利获取大量纯净的软骨细胞。     

人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性

背景：由于大量获取骨髓细胞存在困难,并且骨髓间充质干细胞随年龄的增加出现数量及分化潜能下降,因此需要寻找其他间充质干细胞来源。 目的：优化人脐带间充质干细胞的分离培养条件,进一步明确其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-09/2008-03在中国医学科学院血液学研究所国家重点实验室完成。 材料：17份脐带标本取自健康足月新生儿,由天津市中心妇产医院提供。 方法：脐带采集后在6 h内分别用植块法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶联合消化法进行分离培养,于培养第14天计数集落数,超过50个细胞计为集落。当细胞达70%~80%融合时,胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合消化,以(2.5~5.0)×103/cm2密度传代培养。 主要观察指标：比较不同培养方法所获贴壁细胞的形态学特征、细胞产率,应用流式细胞技术分析细胞增殖活性、免疫表型,特异性染色方法鉴定细胞的多向分化潜能。 结果：植块法培养6~10 d可见成纤维样细胞从植块边缘爬出,形态与骨髓间充质干细胞相似,散在分布或形成小克隆,原代可获得(5.2±1.7)×105个贴壁细胞/0.5 cm脐带组织,至少可稳定传15代,平均每代扩增6.2倍,在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍数上与胶原酶消化法比较存在明显差异(P < 0.05);而胶原酶与胰酶联合消化法接种后未见明显贴壁细胞。人脐带间充质干细胞的倍增时间为45 h,72.09%细胞处于G0/G1期,不表达造血细胞及内皮细胞标记,高表达整合素和黏附分子CD44,CD90,CD95以及CD73,CD105,在特定诱导条件下,人脐带间充质干细胞能够向成骨及成脂肪细胞方向分化。 结论：应用植块法可以从人脐带组织中简便高效地分离出一群具有高增殖活性及多向分化潜能的间充质干细胞,其免疫表型类似于骨髓间充质干细胞。     

骨关节炎软骨细胞的体外分离培养

背景：由于体外分离培养骨关节炎患者软骨细胞存在难度，同时软骨组织中因富含大量的基质, 且软骨细胞分布于其中的软骨陷窝中, 因此与其他细胞相比, 软骨细胞的分离更为困难。 目的：从骨关节炎行人工膝关节置换者的关节软骨中分离软骨细胞，并改良其酶消化法分离软骨组织，观察软骨细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：对比观察，实验于2007-04/2008-03在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室完成。 对象：标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织（> 3 cm）。 方法：切取原发性骨关节炎患者关节软骨，将软骨剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的碎块，以Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶消化分离关节软骨细胞,同期对比用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶消化法消化软骨后的收获细胞数及细胞成活率，分离细胞进行原代和传代培养。 主要观察指标：以倒置相差显微镜观察体外培养软骨细胞形态；以甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行软骨细胞鉴定；四甲基偶氮唑盐法测定骨关节炎细胞增殖情况。 结果：改良的Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶法，对原代关节软骨细胞的分离取得了优良而稳定的效果，与传统的胰蛋白酶消化法相比，收获细胞数为3.72×106，细胞存活率为97.5%，二者相比有显著性差异（P < 0.05）。体外培养观察软骨细胞贴壁和生长均较缓慢。原代和传代后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝异染反应均较弱。软骨细胞增殖和生长缓慢。 结论：Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶分离骨关节炎患者软骨细胞的技术简单且易操作, 分离培养的软骨细胞符合骨关节炎时软骨退变的表现, 可为骨关节炎的病因研究及软骨细胞移植治疗骨性关节炎提供实验基础。     

人正常神经组织许旺细胞的体外培养*

背景：周围神经组织工程所需要的许旺细胞数量巨大。在以往的研究中,由于正常人神经组织的缺乏,常选用大鼠、兔等动物神经组织分离许旺细胞进行培养,而作为异种细胞在临床的应用相对受限。 目的：体外培养人正常周围神经的许旺细胞,寻找一种最佳的获取、培养、纯化的方法。 方法：切取脑瘫患者周围神经缩窄术中的正常周围神经,以消化培养法为主,结合差速贴壁法纯化培养许旺细胞。将神经组织剪成碎块,接种于含胎牛血清、胶原酶、Dispase酶的培养液中消化培养,离心,将组织块加入培养基中,吹打成单细胞悬液,再移入有多聚赖氨酸的DMEM培养皿中,加入碱性成纤维细胞生长因子培养,当贴壁细胞覆盖培养皿达85%~90%即可开始传代培养。锥虫蓝染色对培养后的第 2,3,4,5,6,7,8,9,10天不同时间许旺细胞进行计数,并经S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定计算细胞纯度。 结果与结论：4 d后镜下可见基本为纯净的许旺细胞,密度在0.5×108 L-1以上。传3代后,许旺细胞计数可达到9×108 L-1以上;许旺细胞纯度达85 %以上。结果表明,以消化培养法结合差速贴壁方法培养许旺细胞所需时间短,可获得较高纯度的人许旺细胞,能够为进一步的神经组织工程提供细胞来源。