C型产气荚膜梭菌重组菌株B121（DE3）pXETAB2B1表达条件的优化

目的优化C型产气荚膜梭菌重组菌株B1221（DE3）pXETAB2B1融合蛋白表达的条件。方法以IPTG（异丙基硫代-β—D-半乳糖苷）为诱导剂，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳比较pH值、培养温度、诱导时间、菌体生长密度等因素对重组α-β2-β1融合蛋白表达进行表达条件的影响。结果C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21（DE3）pXETAB2B1的表达优化条件是：最适培养基pH值是7．5，最适诱导时间是5小时，最适表达温度是37℃，最适菌体生长密度是OD6001．0，IPTG最适诱导浓度是0．4mmol／L。结论获得C型产气荚膜梭菌重组菌株BL21（DE3）pXETAB2B1融合蛋白的最佳表达条件。     

C型产气荚膜梭菌BL21(DE3)pXETAB2B1三价灭活苗的免疫效力试验

目的 研究C型产气荚膜梭菌BL21(DE3)(pXETAB281)三价灭活苗的免疫效力.方法 制备C型产气荚膜梭菌B121(DE3)(pXETAB281)三价灭活苗,免疫接种奶牛及ICR小鼠,分别进行静脉采血,观察抗血清中和C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2毒素粗提物的情况.结果 奶牛抗血清中和C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2毒素粗提物达到60%;ICR小鼠抗血清中和C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2毒素粗提物达到100%.结论 C型产气荚膜梭菌BL21(DE3)(pXETAB281)三价灭活苗能中和C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2毒素粗提物.     

C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合蛋白的免疫原性研究

目的研究含α-β2-β1融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)的免疫原性。方法用重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)制备包涵体和全细胞培养物两种抗原,采用氢氧化铝胶体作为免疫佐剂,免疫ICR小白鼠,用C型产气荚膜梭菌外毒素粗提物进行攻毒,观察小鼠的保护情况。结果包涵体加氢氧化铝凝胶制备的抗原保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒均达到100%;全细胞培养物加氢氧化铝凝胶制备的抗原保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒达到50%和20%。结论已获得具有一定免疫原性重组菌株,可作为预防C型产气荚膜梭菌所致疾病的候选菌株。     

食品中产气荚膜梭菌的分离鉴定与基因分型

目的调查广州地区食品中产气荚膜梭菌的污染水平及菌型分布。方法参照国家标准方法进行产气荚膜梭菌的分离鉴定,采用针对产气荚梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2六种毒素的基因cpa、cpb、etx、iA、cpe和cpb2序列的6对特异性引物,用多重PCR方法对分离菌株进行基因分型鉴定。同时用产气荚膜梭菌A型参照株NCTC64609作为阳性对照。结果从142份食品中分离到21株产气荚膜梭菌,以冷冻肉的带菌率最高,为19.6%;鲜肉和速冻肉饺分别为12.2%和11.9%。经多重PCR方法鉴定,均扩增出预期大小为324bp的cpa基因片段的特异性条带,未扩增出针对cpb、etx和iA基因的特异性条带,证实均为A型产气荚膜梭菌。携带β2毒素基因的产气荚膜梭菌共19株(占总分离株的90.4%),其中1株为肠毒素基因阳性的A型菌株。结论初步调查表明广州地区食品中存在可致人食物中毒的肠毒素阳性A型产气荚膜梭菌污染,为进一步建立广州地区食品中及与食物中毒有关的厌氧菌分子分型数据库奠定了基础。     

含产气荚膜梭菌肠毒素基因重组质粒pET-28a-CPE的构建和表达

目的 构建含全长产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)基因的重组表达质粒pET-28a-CPE并进行原核表达.方法 培养并提取表达肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615的基因组DNA,PCR扩增出全长CPE基因片段并连接入pET-28a载体质粒中,构建重组原核表达质粒pET-28a-CPE,进行酶切及测序鉴定,并转化入感受态大肠杆菌(E.coli)BL21中,用IPTG诱导CPE表达.结果 复苏、培养成功产肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615,成功构建了表达质粒pET-28a-CPE,经酶切及测序鉴定结果 与设计的完全相符,成功用E.coil BL21进行了原核表达,目的 蛋白CPE占总表达蛋白45.37%.结论 本实验成功构建并表达了含CPE的重组质粒pET-28a-CPE,为进一步观察CPE时前列腺肿瘤等的生物学作用奠定了基础.     

非食源性腹泻中产气荚膜梭菌的毒力型分布特征

目的 探讨非食源性腹泻患者中分离的产气荚膜梭菌毒力型分布特征。方法 选取2020年1月1日至12月31日清华大学附属北京清华长庚医院收治的非食源性腹泻住院患者粪便样本分离的86株产气荚膜梭菌,其中59株分离于抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhea, AAD）患者,27株分离于非AAD患者。采用实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测菌株的6种毒素基因,即产气荚膜梭菌alpha毒素（cpa）、beta毒素（cpb）、epsilon毒素（etx）、iota毒素（ι-iap）、肠毒素（cpe）和坏死性肠炎B毒素（netB）,依据毒素类型将菌株分为A～G 7种毒力型,分析毒力型分布以及AAD组和非AAD组间毒力型的差异。结果 86株产气荚膜梭菌中,毒素基因cpa、cpb、etx、ι-iap、cpe和netB的检出率分别为100.0%、5.8%、0.0%、0.0%、18.6%和2.3%;A～G毒力型分别占74.4%、0.0%、5.8%、0.0%、0.0%、17.4%和2.3%。A毒力型在AAD组和非AAD组的...     

荧光定量PCR法检测小鼠肠道中产气荚膜梭菌的实验研究

目的 建立一系列浓度梯度的A型产气荚膜梭菌(clostridium perfringens,C.perfringens)感染小鼠肠道的动物模型,探讨实时荧光定量PCR法对肠道中C.perfringens的检测.方法 小鼠随机分成6组,每组10只,依次腹腔注射浓度为5.7×109、5.7×108、5.7×107、5.7×...     

HIV-1 SF2株env基因C1与C3区的嵌合表达

①目的 构建HIV-1SF2株env基因C1与C3区嵌合片段的克隆并在大肠杆菌中表达。②方法 用DNAstar软件辅助设计引物，以含有HIV-1SF2株前病毒基因组的9B1R6质粒为模板，PCR法分别扩增出env基因C1和C3段；两个片段经KpnⅠ酶切、T4连接酶连接和扩增后，再将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的嵌合片段插入表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达质粒pGEX-4T-2／ClC3；重组质粒经酶切、测序鉴定后，以TSS法转入大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达融合蛋白和SDS—PAGE电泳分析表达蛋白图谱。③结果 经酶切和测序分析，插入片段大小、方向和读码框架正确，无碱基错配，表明成功构建pGEX-4T-2／ClC3克隆；重组克隆在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导，高效表达出相对分子质量为4．3万的融合蛋白。④结论 重组质粒pGEX-4T-2／C1C3的构建和表达成功，为进一步研究该表达蛋白的活性和HIV疫苗的研制奠定了基础。     

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。     

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2＋浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2＋浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

正交试验设计优化重组蛋白溶细胞毒素的表达

目的:对创伤弧菌溶细胞毒素融合蛋白表达条件进行优化,从而获得高效稳定的溶细胞毒素(Vibrio vulnificus Hemolysin,VVH)原核表达系统。方法:质粒pGEX-4T-1-vvh转化E.coli BL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素:诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计,对结果进行直观分析及方差分析。并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果:直观分析表明诱导时间的R值最大,其次为摇菌转速和诱导剂IPTG浓度,诱导温度的R值最小;方差分析表明诱导时间的P<0.05,而转速、温度及IPTG浓度的P均>0.05。结论:诱导时间为主要因素(其为4h,表达水平最高),其次为摇菌转速、诱导剂IPTG浓度和诱导温度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数为250r/min、诱导时间4h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下,溶细胞毒素的表达量达到了55.31%。     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

果蝇神经特异性拼接因子Dxl6N变体在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

目的：表达与纯化果蝇中SR蛋白家族新成员Dxl6N端变体。方法：用PCR方法扩增得到Dxl6N端基因片段，经酶切亚克隆至pGEX-4T-1原核表达栽体。在大肠杆菌BL21（DE3）中与GST融合表达。并用谷胱甘肽-sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白。结果：表达产物以可溶形式经亲和层析柱纯化后获得相对分子质量约为37000的融合蛋白。结论：成功克隆、表达并纯化了果蝇神经特异性拼接因子Dxl6N端变体与GST的融合蛋白。     

pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

重组人IL2-MUC1融合蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建表达人IL2-MUC1融合蛋白的工程菌，为制备新型MUC1疫苗提供实验依据。方法：通过PCR方法钓取人IL-2基因片段,将其克隆入pBS-SK-MUC1重组载体中，再将人IL2-MUC1串联基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1。将重组的pGEX-IL2-MUC1转化大肠杆菌BL-21，通过IPTG诱导表达，采用SDS-PAGE 和Western blotting鉴定表达蛋白。结果：经酶切及基因测序证实获得的IL-2基因片段 402 bp及IL2-MUC1基因片段852 bp基因序列正确；构建的pGEX-IL2-MUC1表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达GST-IL2-MUC1蛋白，经SDS-PAGE证实其相对分子质量为64 000，与理论预期值相符。Western blotting分析表明该表达产物与抗人MUC1多克隆抗体及抗人IL-2单克隆抗体均具有特异性结合能力。结论：成功构建表达人IL2-MUC1融合蛋白的工程菌，为进一步研究以人MUC1为靶点的新型抗肿瘤疫苗奠定基础。     

抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达

目的　构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法　用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PCR方法将 VH和 VL拼接在一起 ,构建抗人 AFP单链抗体的基因。将 Sc Fv基因克隆至 p GEM- T载体构建 ,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 Sc Fv基因连接到 p ET32 (a )质粒 ,转化 BL - 2 1(DE3)细菌。抗性生长的克隆用异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导 4 h。溶解细菌并纯化 Sc Fv,通过 SDS-PAGE电泳及竞争抑制 EL ISA实验检测其活性。结果　获得的 VH含 339bp,来自小鼠 Ig Gγ链 ,VL含 312 bp,来自小鼠κ链。 VH和 VL通过编码 (G4 S) 3连接肽的 4 5 bp序列连接在一起构成含 6 96 bp的 Sc Fv基因。 BL - 2 1(DE3)中表达的 Sc Fv抗体与融合蛋白 (Trx A)融合在一起并以包涵体的形式存在。 Trx A- Sc Fv相对分子质量约 4 0× 10 3,Sc Fv相对分子质量约 2 4× 10 3。竞争 EL ISA实验显示 :Trx A - Sc Fv可抑制 4 1%的 Mc Ab与抗原结合 ,而Sc Fv抗体则可抑制 5 3%的 Mc Ab与抗原结合。结论　我们成功构建了由 6 96个碱基组成的抗人 AFP单链抗体的基因 ,并在大肠杆菌获得了     

人通用转录因子GTFIIF2表达与定位

目的构建不同标签的人通用转录因子 IIF多肽2(GTFIIF2)表达载体,观察其细胞内的表达和定位。方法设计GTFIIF2的引物,以全长cDNA序列为模板,利用聚合酶链式反应技术扩增 GTFIIF2全长序列,构建 pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和 pCDGFP-GTFIIF2质粒,利用 Western blot法和免疫荧光法检测其在细胞表达与定位;构建GST-GTFI-IF2质粒,转化到BL21菌株,用IPTG诱导剂诱导融合蛋白表达,用SDS-PAGE分析诱导表达情况。结果免疫荧光法检测GTFIIF2蛋白集中分布在COS7细胞核中,在细胞质没有分布;pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和pCDGFP-GTFIIF2质粒能够在HEK293T细胞中有效表达;GST-GTFIIF2在BL21菌株中很好的诱导表达。结论 GTFIIF2在 COS7细胞、HEK293T细胞和BL21感受态细胞中能有效表达,为更好地了解GTFIIF2蛋白在细胞内的功能提供一定的研究基础。