白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT表达及其启动子的影响

目的：观察白藜芦醇对大肠癌细胞生长增殖的影响,并从人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcfiptase,hTERT）表达及其启动子方面探讨可能的抗癌机制。方法：以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS-174T细胞后,收集细胞,分别采用荧光实时定量RT—PCR和蛋白质印迹法检测癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至大肠癌LS-174T细胞中后,加入不同浓度的白藜芦醇,孵育48h后,检测报告基因萤虫素酶活性。结果：白藜芦醇处理大肠癌细胞后,增殖明显受到抑制,且与浓度有关。癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。白藜芦醇处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：hTERT启动子活性和hTERT表达下调,可能是白藜芦醇抑制癌细胞增殖的重要机制之一。     

端粒酶hTERT基因反义核酸对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响

目的 探讨hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响.方法 采用TRAP-PCR-ELISA法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性;采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平;以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化.结果 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)作用于T24细胞48h,其端粒酶活性下降,作用72h,其端粒酶活性受到抑制.结论 通过hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)特异性抑制hTERT基因mRNA的表达降低膀胱癌细胞T24端粒酶活性.     

膜雌激素受体介导的NO途径对EPCs增殖和凋亡的影响

 【目的】 观察一氧化氮(NO)信号途径在膜雌激素受体介导的内皮祖细胞(EPCs)增殖和凋亡中的作用&;#65377; 【方法】 在培养的EPCs上,分别使用E2-BSA&;#65380;或加雌激素受体阻断剂ICI 182,780&;#65380;PI3K抑制剂LY294002和NOS抑制剂l-NAME,利用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性(10组,n = 9),利用化学比色法测定NO的含量(6组,n = 6),Hoechst 33258染色观察EPCs凋亡(8组,n = 5)以及免疫印迹法检测EPCs磷酸化eNOS蛋白表达的情况(4组,n = 4)&;#65377;【结果】 与对照组相比,E2-BSA 可以促进EPCs的增殖,ICI 182,780可以抑制其增殖作用,表明膜雌激素受体介导的信号通路参与雌激素对EPCs的增殖作用;NO合成和细胞凋亡结果显示,E2-BSA可以促进一氧化氮的合成和抑制血清撤退诱导的凋亡,PI3K抑制剂LY294002&;#65380;NOS 抑制剂l-NAME以及和ICI 182,780可以抑制上述作用;免疫印迹结果显示,E2-BSA可以促使eNOS的磷酸化,而LY294002可抑制上述作用&;#65377;【结论】 膜雌激素受体可通过PI3K/Akt/eNOS信号途径抑制EPCs的凋亡从而促进其增殖&;#65377;     

反义hTERT体外抑制白血病细胞增殖的研究

目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行检测。同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析反义hTERT对白血病细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低HL60细胞内源性hTERT mRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第25代后,与HL60、HL60-s比较,HL60-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加。结论反义hTERT在体外能抑制白血病细胞的生长增殖能力,其潜在、广谱的抗肿瘤作用的分子生物学机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达(端粒酶活性)而最终引发瘤细胞衰亡的途径来实现的。     

端粒酶在面突外胚间充质细胞干细胞中的表达

目的: 探讨面突外胚间充质干细胞的端粒酶活性状况. 方法: 体外培养妊娠50 d人胚胎面突外胚间充质干细胞,白血病抑制因子(LIF)抑制细胞分化,于第1, 8, 15和第22代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达并进行图像分析,同时检测无LIF抑制下,第5代细胞自发分化10 d端粒酶逆转录酶的表达情况. 结果: 外胚间充质干细胞表达端粒酶逆转录酶,表达强度随传代次数的增多而下降. 在分化状态,该细胞不再表达端粒酶逆转录酶. 结论: 早期胚胎面突外胚间充质干细胞具有较高的端粒酶活性,但不足以抑制该细胞的衰老.     

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的：观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶（hTERT）表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法：以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,2h后加入不同浓度的榄香烯乳,孵育48h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果：榄香烯乳处理后,胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性,抑制hTERT表达,从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

组蛋白去乙酰基酶抑制剂对卵巢癌生长的抑制作用

目的探讨组蛋白去乙酰基酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)和丁酸钠(NaB)对卵巢癌细胞株SK-OV-3的抑制作用。方法分别用ELISA法、流式细胞仪及PT-PCR方法测定分析不同浓度TSA和NaB处理的卵巢癌SK-OV-3细胞的增殖、凋亡、端粒酶活性和人端粒酶RNA(hTERC)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)的水平。结果TSA和NaB对SK-OV-3细胞的增殖均具有抑制作用,并呈剂量依赖性。TSA及NaB诱导SK-OV-3细胞凋亡,凋亡随药物剂量加大而增强。TSA及NaB不抑制端粒酶活性和hTERC及hTERT。结论TSA及NaB通过诱导SK-OV-3细胞凋亡,抑制SK-OV-3细胞生长。     

白藜芦醇与吉非替尼的协同抗肺癌作用及机制研究

目的探讨白藜芦醇是否能提高吉非替尼对肺癌细胞的杀伤活性并研究其机制。方法MTT法检测人非小细胞肺癌细胞系PC9细胞在低浓度吉非替尼和白藜芦醇处理下的细胞活力。Western blot实验检测低浓度吉非替尼和白藜芦醇对PC9细胞c-met表达水平,表皮生长因子受体(EGFR)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)磷酸化水平及caspases活化水平。流式细胞术检测PC9细胞在低浓度吉非替尼和白藜芦醇处理下的凋亡率。结果低浓度吉非替尼联合白藜芦醇对PC9的细胞活力抑制率显著高于低浓度吉非替尼组和白藜芦醇组[(57.7±3.3)%比(12.4±1.1)%、(8.6±0.8)%,P0.05]。白藜芦醇处理可诱导PC9细胞c-met蛋白的下调并显著增强低浓度吉非替尼对PC9细胞PI3K和AKT磷酸化水平的抑制作用。低浓度吉非替尼联合白藜芦醇组对PC9细胞活力的抑制率和凋亡诱导率显著高于低浓度吉非替尼组和低浓度吉非替尼+白藜芦醇+c-met质粒组[抑制率:(57.7±3.3)%比(12.4±1.1)%、(16.3±1.3)%,P0.05;凋亡率:(30.9±1.8)%比(7.2±0.5)%、(10.6±0.8)%,P0.05]。低浓度吉非替尼联合白藜芦醇组对PC9细胞caspase-9及caspase-3的活化显著强于低浓度吉非替尼组和低浓度吉非替尼+白藜芦醇+c-met质粒组。结论白藜芦醇可能通过下调c-met的表达提高肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。     

人喉癌细胞端粒酶催化亚基cDNA片段的扩增与克隆

目的 :测定人喉鳞状上皮癌 hep- 2细胞的端粒酶活性水平并获得 hep- 2细胞中 h TERT c DNA片段的克隆。方法 :采用 TRAP- ELISA法测定酶活性水平 ,RT- PCR技术扩增获得目的片段。利用酶切法、PCR法和序列分析法对所获克隆进行检测。结果 :hep- 2细胞具有较高的端粒酶活性水平 ,获得含h TERT c DNA片段的克隆。结论 :利用 RT- PCR法能够从具有较高端粒酶活性水平的 hep- 2细胞中扩增获得 h TERT c DNA片段     

转录因子Sp1和Sp3对Jurkat T细胞端粒酶活性的调节作用

目的探讨转录因子Sp1、Sp3对JurkatT细胞端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)的调节作用.方法用脂质体将Sp1、Sp3表达载体转入Jurkat T细胞,用Westem blotting方法检测蛋白表达水平;用端粒酶PCR-ELSA法检测细胞端粒酶活性并用银染显示端粒酶活性梯度;用RT-PCR方法检测hTERTmRNA水平.结果Sp1、Sp3载体转化36 h的细胞Sp1、Sp3蛋白水平分别升高59.6%(P〈0.01)和36.8%(P〈0.05);随着Sp1表达水平的增加,端粒酶活性和hTERT mRNA水平明显增加,增加率分别为38.5%(P〈0.05)和25.4%(P〈0.05).而Sp3表达载体对端粒酶活性和hTERT mRNA水平无明显影响.结论转录因子Sp1通过调节hTERT mRNA转录水平而调节Jurkat T细胞端粒酶活性,Sp3无此作用.     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40）,片段长度为1084bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

hTERT转染神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA检测

目的以逆转录病毒PLXSN为载体,将hTERT基因转染入体外培养的人神经干细胞,检测神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA表达情况,为建立永生化神经干细胞系提供一种新的思路.方法体外扩增人神经干细胞及基因转染后,应用PCR-ELISA法检测神经干细胞端粒酶活性,荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达情况.结果通过逆转录病毒介导的hTERT基因转染人神经干细胞后,端粒酶活性明显升高,持续表达,hTERT mRNA也早期呈高水平表达,但继之下降,维持在一个较低水平.结论转染hTERT基因后的神经干细胞具有表达高水平端粒酶活性,并稳定表达,这为建立基因工程的永生化神经干细胞系奠定了基础.而hTERT mRNA则逐渐下降,并维持在一个较低水平,不能作为检测神经干细胞增殖和分化能力的指标.