调节性T细胞对肝星状细胞增殖及透明质酸分泌的影响

目的研究CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)对肝星状细胞(HSC)增殖及透明质酸(HA)分泌的影响。方法 MASC法分离慢性乙型肝炎患者血中CD4+CD25+Treg细胞;传代培养人HSC LX-2(空白组),不同比例CD4+CD25+Treg细胞与HSC直接共培养(共培养组),不同剂量的重组人转化生长因子(TGF)β1和HSC共培养(对照组);使用CCK-8法检测HSC增殖、放射免疫法检测HA分泌情况。组间比较采用单因素方差分析。结果共培养组与空白对照组(0.6623±0.02702)相比,在比例为2.5∶1时HSC增殖最为明显(0.6836±0.00560),比例为1∶1、5∶1及7.5∶1时HSC增殖均明显减少,且随着比例升高其增殖水平逐渐降低,各组与空白对照组相比有统计学差异(F=11.421,5.272,84.514,490.639;均P<0.05)。不同浓度TGFβ1对照组的HSC均比空白对照组(0.3883±0.00189)细胞增殖明显(0.6720±0.00753,0.6773±0.00585,0.5373±0.00387),并于8 ng/μl时增殖达到高峰,各亚组与空白组相比有统计学差异(F=196.175,799.624,236.461;P<0.01)。共培养组与对照组中细胞上清液中HA浓度与HSC增殖呈正相关(r=0.661、0.871,均P<0.01)。结论 CD4+CD25+Treg细胞促HSC增殖并促进其分泌HA,并在体外证实CD4+CD25+Treg细胞在慢性乙型肝炎进展过程中发挥重要作用。     

系统性红斑狼疮患者CD4~+CD25~+CD127~(low/-)调节性T细胞中Foxp3的表达及免疫抑制功能研究

目的 研究系统性红斑狼疮(SEE)外周血中调节性T细胞不同标志以及调节性T细胞在SLE发病中的作用;探讨CD127与Foxp3的相关性,明确CD127定义调节性T细胞的特异性;鉴定CD4~+CD25~+CD127~(low/-)T淋巴细胞免疫抑制功能.方法 ①采用四色直接荧光素标记法和多参数流式细胞术检测40例SLE患者(19例初发和21例缓解)及15名健康对照外周血CD4~+CD25~+T淋巴细胞、CD4~+CD25~+CD127~(low-)T淋巴细胞、CD4~+CD25~+Foxp3~+T淋巴细胞、CD4~+CD25~(high)T淋巴细胞、CD4~+CD25~(high)CD127~(low/-)T淋巴细胞、CD4~+CD25~(high)Foxp3~+T淋巴细胞以及CD4~+CD127~(low/-)Foxp3~+T淋巴细胞占CD4~+T淋巴细胞的比率,并且将7种调节性T细胞比率与外周血抗双链DNA(dsDNA)等抗体及SLE疾病活动指数(SLEDA1)评分等进行相关性分析.②以流式细胞分选术结合细胞培养技术,检测和分析3例SLE患者和4名健康人外周血中CD4~+CD25~+CD127~(low/-)调节性T细胞对CD4~+CD25~-效应性T细胞增殖的抑制作用.采用两样本均数的t检验,重复测量的方差分析,Pearson相关与Spearman相关分析进行统计学处理.结果 ①SLE患者组7种调节性T细胞比率分别为(6.1±1.7)%,(3.1±1.3)%,(2.1±1.0)%,(1.6±0.3)%,(0.97±0.28)%,(0.69±0.23)%和(0.71±0.35)%.与健康对照组比较:SLE患者组前6种调节性T细胞比率均低于健康对照组(P<0.05).②SLE患者组:CD4~+CD25~+Foxp3~+、CD4~+CD25~(high)Foxp3~+T淋巴细胞比率与IgA呈正相关;CD4~+CD25~(high)CD127~(low/-)T淋巴细胞比率与抗SSB抗体呈正相关.③SLE患者初发组和缓解组比较:SLE患者初发组7种调节性T细胞中除CD4~+CD127~(low/-)Foxp3~+T淋巴细胞比率外,其余均低于缓解组(P<0.05).④SLE患者初发组治疗前后比较:激素治疗前6种调节性T细胞比率均低于激素治疗后(P<0.05).⑤SLE患者初发组、缓解组和对照组中,CD4~+CD25~+T淋巴细胞及CD4~+CD25~(high)T淋巴细胞中Foxp3的表达与CD127低表达均呈正相关.⑥SLE患者、健康人CD4+CD25-效应性T细胞的体外增殖都可以被自身CD4~+CD25~+CD127~(low/-)调节性T细胞所抑制,但SLE患者的抑制率明显低于健康对照.结论 SLE的免疫异常可能与调节性T细胞的数量和功能缺陷有关;CD127可能代替Foxp3作为调节性T细胞特异性的表面标记物.     

胸腺肽α1对慢性乙型肝炎CD4~+CD25~+CD127~(dim/-)调节性T淋巴细胞功能的影响

目的观察胸腺肽α1对慢性乙型肝炎CD4~+CD25~+CD127~(dim/-)调节性T淋巴细胞(Treg)功能的影响。方法选取2016年12月-2017年7月陕西省人民医院感染性疾病科收治的慢性乙型肝炎患者67例,其中38例接受恩替卡韦抗病毒治疗(对照组),29例接受恩替卡韦联合注射用胸腺肽α1治疗(治疗组),分别于治疗前后分离外周血单个核细胞,流式细胞术检测CD4~+CD25~+CD127~(dim/-)Treg水平,纯化CD4~+CD25~+CD127~(dim/-)Treg,与自体CD4+CD25-T淋巴细胞共培养,CCK-8法检测细胞增殖,ELISA法检测细胞因子分泌水平。计量资料2组间比较采用t检验,计数资料组间比较采用χ2检验。结果对照组、治疗组患者经治12周CD4~+CD25~+CD127~(dim/-)Treg均较基线水平明显下降,差异均有统计学意义(8.85±2.18)%vs(12.32±1.22)%、(9.26±2.30)%vs(13.71±2.32)%,t值分别为4.579、4.803,P值分别为0.0005、0.0003]。选取17例对照组患者和21例治疗组患者检测细胞因子分泌水平。经治12周对照组患者治疗12周后Treg与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养系统中细胞增殖和分泌细胞因子水平均无明显变化;治疗组共培养系统中细胞计数较基线水平明显升高,差异有统计学意义[(3.66±0.95)×106个vs(2.07±0.51)×106个,t=5.709,P0.0001];治疗组共培养细胞分泌抑制性细胞因子IL-10、IL-35水平明显降低,差异均有统计学意义[(41.40±11.89)pg/ml vs(56.53±27.85)pg/ml、(122.9±9.98)pg/ml vs(130.0±15.98)pg/ml,t值分别为2.639、2.459,P值分别为0.019、0.028)],分泌抗病毒细胞因子IFNα、IFNγ水平明显升高,差异均有统计学意义[(297.5±83.56)pg/ml vs(235.6±67.72)pg/ml、(5.83±0.85)pg/ml vs(4.39±0.95)pg/ml,t值分别为2.603、4.659,P值分别0.017、0.0004]。结论胸腺肽α1能够抑制慢性乙型肝炎CD4~+CD25~+CD127~(dim/-)Treg水平及免疫抑制功能,提高患者免疫功能。     

尖锐湿疣患者外周血Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞的检测及意义

目的 了解尖锐湿疣患者外周血Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞的表达水平,探讨其在尖锐湿疣发生发展机制中的作用.方法 分别收集30例尖锐湿疣患者(复发15例,初发15例)及20例健康者外周抗凝静脉血,分离出外周血单个核细胞.藻红蛋白(PE)标记抗CD4单抗,异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗CD25单抗,细胞破膜后PE标记的抗Foxp3单抗行细胞内染色,三色流式细胞术分析Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞比例.组间比较采用ANOVA检验.结果外周血中Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞水平在尖锐湿疣患者组为(3.4±1.0)%,在复发组为(4.7±1.2)%,均显著高于健康对照组的(1.2±0.5)%(P<0.01).外周血Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞水平在初发组为(2.1±1.0)%,高于健康对照组,但差异无统计学意义,而在复发组明显高于初发组(P<0.05).结论 尖锐湿疣患者外周血Foxp3+CD4<"+>CD25+调节性T细胞数量增加,这种细胞免疫功能失调可能与其免疫学发病机制有关.     

CD4+CD25+调节性T淋巴细胞在大鼠肝纤维化模型中的变化

目的 探讨CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Tregs)在肝纤维化免疫发病机制中的作用.方法 26只大鼠分为对照组(6只)和模型组(20只),通过皮下注射四氯化碳(CCl4)建立肝纤维化模型,检测血清肝功能和纤维化指标,观察肝脏病理学变化,流式细胞仪测定外周血及脾脏CD4+CD25+Tregs数量的变化.两组间差异比较采用t检验,相关性采用Pearson直线相关分析.结果 模型组血清ALT、AST升高,Alb下降;HA、PC Ⅲ、Ⅳ C分别为(177.42±61.25)/μg/L、(34.86±7.47)μg/L、(7.32±3.71)μg/L,较对照组明显升高(t=-3.670、-5.661、-3.950,均P<0.01);模型组肝脏组织胶原纤维大量增生,分割肝小叶并包绕成假小叶.模型组外周血中CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴细胞比例为(7.41±2.15)%,较对照组的(12.88±2.93)%低(t=3.752,P<0.01);模型组脾脏中Tregs为(9.49±1.16)%,较对照组的(13.16±2.36)%亦低(t=2.793,P<0.05).ALT、AST与外周血和脾脏中Tregs水平呈直线负相关(ALT、AST与外周血中Tregs:r分别为-0.727、-0.698,ALT、AST与脾脏中Tregs:r=-0.663、-0.535;均P<0.05);而Alb与外周血和脾脏中Tregs水平无直线相关(r=0.423、0.372,均P>0.05);HA、PCⅢ、ⅣC与外周血和脾脏中Tregs水平呈直线负相关(HA、PCⅢ、ⅣC与外周血中Tregs:r=-0.719、-0.558、-0.792,HA、PCⅢ、ⅣC与脾脏中Tregs:r=-0.424、-0.685、-0.506;均P<0.05).结论 CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型CD4+CD25+Tregs的表达降低,其肝纤维化的免疫学发病机制有待进一步研究.

Abstract：

Objective To investigate the role of CD4+ CD25+ regulatory T lymphocyte(Tregs)in the immunological pathogenesis of liver fibrosis.Methods Twenty-six rats were divided into two groups:control group(6 rats)and model group(twenty rats).The rat model of liver fibrosis was induced bv subcutaneous injection of carbon tetrachloride(CCl4).The serums were collected for detection of hepatic function and fibrosis parameters.Hepatic tissue samples were used to observe the histopathological changes.The flow cytometry was used to detect the proportions of Tregs in both peripheral blood and spleen.The data were evaluated by t-test.The relationship between two variables was analyzed using Pearson linear correlation.Results The levels of serum alanine aminotransferase (ALT)and aspartate aminotransferase (AST) were significantly increased,but the level of serum albumin (Alb) was obviously decreased.The concentrations of serum hyaluronic acid (HA),procollagen type Ⅲ(PCⅢ),collagen type Ⅳ(CⅣ)of the model group increased to(177.42±61.25)μg/L,(34.86±7.47)μg/L and(7.32±3.71)μg/L,respectively,which were higher than those in the control group(t=-3.670,-5.661,-3.950,respectively;all P<0.01).In model group,hepatic lobules were full of collagen fibers and the hepatic pseudolobule formation was observed.The proportion of peripheral blood Tregs in CD4+ T lymphocyte in liver fibrosis model was(7.41±2.15)%,which was significantly lower than that in control group(12.88±2.93)%(t=3.752,P<0.01).Furthermore,the frequency of Tregs in spleen of the model group was(9.49±1.16)%,which was also significantly lower than that in control group(13.16±2.36)%(t=2.793,P<0.05).In addition,the levels of serum ALT,AST and fibrosis parameters were inverselv correlated with the frequency of Tregs in spleens and peripheral blood(ALT and Tregs in blood:r=-0.727,AST and Tregs in blood:r=-0.698,ALT and Tregs in spleen:r=-0.663,AST and Tregs in spleen:r=-0.535,HA and Tregs in blood:r=-0.719,PCⅢ and Tregs in blood:r=-0.558,CⅣ and Tregs in blood:r=-0.792,HA and Tregs in spleen:,r=-0.424,PCⅢ and Tregs in spleen:r=-0.685,CⅣ and Tregs in spleen:r=-0.506;all P<0.05).However,the linear correlations between serum Alb and Tregs in spleens and peripheral bloods were not observed(r=0.423,0.372,respectively,both P>0.05).Conclusion These findings suggest that the reduction of CD4+ CD25+ Tregs probably play an important role in the immunological pathogenesis of liver fibrosis.     

CD4+CD25+CD127low/-T淋巴细胞在类风湿关节炎患者外周血中的表达及意义

目的 检测调节性T淋巴细胞新旧标志在活动性类风湿关节炎(RA)患者外周血中的表达,探讨用CD127代替FOXP3对调节性T淋巴细胞进行研究的可能性.方法 选取活动性RA患者32例,其中未经缓解病情抗风湿药(DMARDs)治疗者20例,经DMARDs治疗效果不佳者12例,以25例原发性干燥综合征(pSS)患者和24名健康人作为对照,采用流式细胞术检测外周血中CD4+CD25high、CD4+CD25+CD127low/-及CD4*CD25+FOXP3+T淋巴细胞的比例,同时检测外周血C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、免疫球蛋白、补体等水平并进行相关性分析.结果 RA患者CD4+CD25highT淋巴细胞百分率与健康对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).其CD4+CD25+FOXP3+T淋巴细胞与CD+CD25+CD127low/-T淋巴细胞的百分率均低于健康对照组(P<0.05),但CD4+D25+FOXP3+、CD4+CD25+CD127low/-T淋巴细胞在RA患者与pSS患者中的表达差异无统计学意义(P>0.05);这三群细胞的表达水平在RA未经治疗组和治疗效果不佳组之间差异均无统计学意义(P>0.05). RA患者CD4+CD25+FOXP3+T淋巴细胞与CD4+CD25+CD127low/-T淋巴细胞之间呈明显正相关(r=0.698,P=0.001),但这两群细胞与患者的CRP、ESR等水平及抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体、类风湿因子(RF)均无相关性(P>0.05).结论 活动性RA患者外周血中,CD4+CD25+CD127low/-T淋巴细胞的百分率降低,并且与CD4+CD25+FOXP3+T淋巴细胞呈显著正相关性,提示CD127可能被作为Treg细胞中FOXP3的替代标记.     

胰岛素抵抗的慢性丙型肝炎患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的数量及其功能

目的 了解胰岛素抵抗的慢性丙型肝炎患者外周血CD4 +CD25+调节性T细胞(Treg)数量和功能的变化.方法 筛选40例HLA-A2+慢性丙型肝炎患者(其中20例合并胰岛素抵抗),流式细胞仪检测患者CD4+CD25+Treg细胞占外周血中CD4+T细胞的频率,液闪计数仪检测对HCV特异性CD8+T细胞增殖的抑制作用,ELISA法检测IFN-y水平.统计学处理采用t检验.结果 胰岛素抵抗的慢性丙型肝炎患者外周血CD4 +CD25+ Treg细胞占CD4+T细胞的(9.5±1.9)％,明显低于慢性丙型肝炎患者的(11.2±2.2)％(t=2.615,P＜0.05).胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)≥4患者的CD4+CD25+ Treg细胞比例为(9.0±1.8)％,明显低于HOMA-IR＜4患者的(10.8±2.3)％(t=2.413,P＜0.05).胰岛素抵抗的慢性丙型肝炎患者CD4+CD25+ Treg细胞和去除Treg的外周血单个核细胞(PBMC)共培养上清液中IFN-y为(4 050±580) pg/mL,明显高于慢性丙型肝炎患者的(2 005±330)pg/mL(t=13.705,P＜0.01).HOMA-IR≥4患者IFN-y为(5 682±986)pg/mL,明显高于HOMA-IR＜4患者的(2 819±660) pg/mL(t=7.630,P＜0.01).结论 随着胰岛素抵抗程度加重,慢性丙型肝炎患者外周血CD4+ CD25+ Treg细胞频率减低,对HCV特异性CD8+T细胞增殖的抑制作用减弱.     

CD4+CD25-Foxp3+T淋巴细胞的表型鉴定及其在初发系统性红斑狼疮中的意义

目的 对初发系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血异常表达CD4+CD25-Foxp3+T淋巴细胞进行表型鉴定,并探讨其临床意义.方法 对初发SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞进行细胞表面分子[CD25、CD127、CCR4、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CT-LA-4)]和胞内分子(Foxp3)标染,流式细胞仪检测,并研究CD4+各细胞亚群与狼疮肾炎和疾病活动度(SLEDAI)相关性.结果 SLE患者外周血CD4+CD25-Foxp3+T淋巴细胞表面 GITR、CTLA-4和CCR4表达率与活化T淋巴细胞(CD4+CD25+Foxp3-)相比差异无统计学意义(P均>0.05),而显著低于调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Foxp3+)(P均<0.01);CD4+Foxp3+CD25high,CD4+Foxp3+CD25low和CD4+Foxp3+CD25-细胞中CD127low-百分率分别为(93.8±,3.5)%,(93.7±2.3)%,(92.0±2.1)%,三者之间差异无统计学意义(P>0.05);在CD4+细胞亚群中,当CD127low-时,Foxp3+在CD25high,CD25low和CD25-中表达率分别为 (91.4±2.6)%,(71.9±3.3)%,(9.0±2.2)%,三者之间差异均有统计学意义(P<0.01);SLE患者外周血CD4+CCR4+CD25highT淋巴细胞百分率与SLEDAI呈显著负相关(r=-0.695,P<0.001),狼疮肾炎患者(1.10±0.17)%显著低于SLE无肾炎组[(1.61±0.23)%,P<0.01]和健康对照组[(1.75±0.10)%,P<0.01];狼疮肾炎患者外周血CD4+ CCR4+CD25low-T淋巴细胞百分率显著高于健康对照组[(11.5 ±2.3)%与(8.0±1.0)%,P<0.01)].结论 初发SLE中异常升高的CD4+CD25-Foxp3+T淋巴细胞的表型类似早期活化效应T淋巴细胞.可以用CD4+CD25highCD127low-T淋巴细胞替选CD4+CD25highFoxp3+调节性T淋巴细胞.CCR4+调节性T淋巴细胞可能参与狼疮肾炎发病.     

乙型肝炎病毒感染不同阶段患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的测定

目的 测定HBV感染不同阶段患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的频率及标记分子,并分析其与临床指标的相关性.方法 采集79例慢性乙型肝炎(CHB)、12例急性乙型肝炎(AHB)患者、26例无症状HBV携带者(ASC)和20例健康对照的外周血,流式细胞仪分析Treg频率、Treg细胞表面和胞内特征性分子的表达.普通RT-PCR和相对荧光定量PCR测定叉头/翼状转录因子3(Foxp3)在CD25+Treg细胞的表达水平.所有患者及健康对照均经ELISA检测HBV血清标记物水平,实时荧光定量PCR测定血清HBV DNA载量,并进行肝功能检测.结果 总CD4+CD25+T细胞占外周血CD4+T细胞的比率,在各患者组和健康对照组之间差异均无统计学意义(P＞0.05).HBeAg阳性CHB组CD4+CD25高表达T细胞频率(3.42%±0.81%)与HBeAg阴性CHB组(3.19%±0.67%)、ASC组(3.05%±0.64%)比较,差异无统计学意义(均P＞0.05),但明显高于健康对照组(2.72%±0.71%,P=0.034)和AHB组(2.25%±0.54%,P=0.013).CD4+CD25高表达T细胞表面高表达CD45RO、CD25分子,低表达CD45RA,细胞内高表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和Foxp3.各患者组及健康对照组Treg中Foxp3表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05).CHB组患者的Treg频率与血清病毒载量呈正相关(r=0.48,P=0.018).结论 Treg可能通过抑制T细胞免疫应答反应而影响病毒清除,并与CHB患者的持续感染密切相关.     

慢性乙型肝炎患者浆样树突状细胞体外诱导CD4+CD25+调节性T细胞的研究

目的 观察慢性乙型肝炎患者,乙型肝炎恢复者和健康人浆样树突状细胞(pDCs)体外诱导CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)能力的差异,为阐明HBV感染慢性化的机制奠定基础.方法 采用免疫磁珠分离法体外分离46例慢性乙型肝炎患者,10例乙型肝炎恢复者和25名健康人外周血单个核细胞中pDCs,并将其分别与健康人CD4+CD45RA+初始T细胞共培养.采用HBcAg或破伤风毒素对去除CD25+细胞的外周血单个核细胞进行增殖刺激后,使用流式细胞仪及RT-PCR对pDCs-T共培养细胞中CD4+CD25+Treg的数量、表型及FOXP3基因表达情况进行测定;采用酶联免疫吸附法对共培养细胞上清液中的白细胞介素-10和转化生长因子β1进行了进一步检测.两组数据比较采用Mann Whitney U-test.结果 当细胞增殖刺激物为HBcAg时,细胞增殖幅度慢性乙型肝炎患者组为(7999.36±374.74)cpm,乙型肝炎恢复者组为(11 282.56±1174.46)cpm和健康人组为(12 304.58±1462.81)cpm,慢性乙型肝炎患者组细胞增殖幅度明显小于乙型肝炎恢复者组和健康人组,U=0～22.0,P值均<0.05·乙型肝炎恢复者组和健康人组间增殖幅度差异无统计学意义.当增殖刺激物为破伤风毒素时,细胞增殖幅度与阳性对照组之间,差异无统计学意义.CD4+CD25+Treg比例慢性乙型肝炎患者组为5.99%±1.85%,乙型肝炎恢复者组为3.04%±0.79%,健康人组为3.01%±1.53%,慢性乙型肝炎患者组中韵CD4+CD25+Treg比例明显高于乙型肝炎恢复者组和健康人组,U=6.0～71.5,P值均<0.05.3组人群pDCs-T共培养细胞的CD4+CD25+T细胞均检测到Fox p3 RNA,而在CD4+CD25 T细胞中,均未检测到Fox p3RNA.3组人群pDCs-T共培养细胞实验组上清液的白细胞介素-10和转化生长因子β1含量均明显高于阳性对照组.结论 pDCs以诱导CD4+CD25+Treg形式参与了乙型肝炎的慢性化.     

CD+4 Foxp3+调节性T细胞对断烟大鼠肺部炎症及肺气肿的作用

目的 观察香烟暴露及断烟后大鼠Treg细胞的变化,探讨Treg细胞与断烟后大鼠肺部炎症反应和肺气肿持续存在的关系.方法 将50只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为5组:健康对照组、香烟暴露组和断烟组,其中健康对照组和香烟暴露组又分为12周组(对照1组和实验1组)和24周组(对照2组和实验2组).香烟烟雾暴露法建立大鼠肺气肿模型.HE染色观察大鼠肺气肿的改变,酶联免疫吸附法检测大鼠BALF中白细胞介素(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,流式细胞术检测大鼠外周血和肺实质中CD4+Foxp3调节性T细胞(Treg细胞)比例,实时定量PCR法检测大鼠外周血和肺实质中Foxp3的mRNA表达.多组间比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用SNK和Games-Howell检验.结果 实验1组和实验2组平均内衬间隔(MLI)为(64.9±5.3)μm和(77.9±11.5)μm,均明显高于对照1组和对照2组的(39.0±3.8)μm和(40.3±2.7)μm,差异均有统计学意义(P＜0.01);断烟组MLI[(71.5 ±5.8)μm]介于实验1组和实验2组之间,但肺气肿程度较实验1组明显加重,差异有统计学意义(P＜0.01).实验1组和实验2组IL-8水平[(68±17)ng/L和(85±16)ng/L]及TNF-α水平[(14.1±1.8)ng/L和(20.1±8.7)ng/L]均明显高于对照1组和对照2组[(44±8)ng/L、(43±9)ng/L及(6.3±2.3)ng/L、(5.8±1.6)ng/L],差异均有统计学意义(P＜0.05).实验1组和实验2组肺实质中CD+4Foxp3+Treg细胞[(6.6±0.8)%和(5.3±0.9)%]明显少于对照1组和对照2组[(9.0±1.0)%和(9.6±0.9)%],差异均有统计学意义(P＜0.01);断烟组肺实质中CD+4Foxp3+Treg细胞[(7.2±0.6)%]与实验1组比较虽无明显减少,但未能恢复至正常水平.实验1组和实验2组肺实质中Foxp3的mRNA表达量(17±7和9±7)明显低于对照1组和对照2组(39±6和42±7),差异均有统计学意义(P＜0.01);断烟组肺实质中Foxp3的mRNA表达量(21±9)与实验1组比较未见明显减少,但未能恢复至正常水平.结论 香烟暴露肺气肿大鼠肺内调节性T细胞下调可能导致大鼠肺内炎症反应放大,并在断烟后持续存在,提示调节性T细胞下调可能是大鼠肺气肿持续进展的原因之一.     

CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞在小鼠肺结核发生中的作用

目的 研究CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞(Treg)在小鼠肺结核发生中的作用.方法 PC61处理组小鼠腹腔注射抗-CD25(PC61),50μg/只,消除体内的Treg,IgG对照组注射相同剂量的IgG同型对照抗体.3 d后静脉注射H37Rv 0.1 mL(含1×10~6CFU活菌),攻击小鼠.流式细胞技术分析PC61对小鼠体内不同组织中Treg的消除效果,体外分析Treg消除对特异性细胞免疫、肺组织病理学和肺组织内结核分枝杆菌生长情况的影响.采用方差齐性F检验和非配对t检验比较实验数据.结果 PC61处理组与IgG对照组小鼠脾细胞中Treg占CD4~+T淋巴细胞比例在第10天分别为(21.13± 3.58)%和(30.42± 4.20)%(f=2.38,P<0.05);第30天为(16.12± 1.26)%和(17.34± 1.62)%(t=0.84,P>0.05),Foxp3~+占CD4~+T淋巴细胞比例在第10天为(32.07± 3.95)%和(60.55± 5.48)%(t=5.96,P<0.05).外周血也有类似结果.在PC61处理组及IgG对照组,感染后第10、30和60天时体外培养小鼠脾细胞分泌的卡介苗特异性细胞因子1L-17(ng/L)分别为5.1± 0.9比0、43.1± 10.0比5.9±2.8、124.8± 5.8比102.5±8.1(t=7.90,t=5.10,t=3.19;均P<0.05);IFN-7(ng/L)分别为28.4±8.2比4.0± 1.3、685.9±128.6比418.7± 20.4、310.9± 119.7比32.8±7.5(t=4.21,t=8.43,t=3.27;均P<0.05);TNF-a(ng/L)分别为38.6±5.0比16.3±4.0、112.9± 12.3比71. 5± 12.6、86.2± 8.2比0(t=4.95,t=3.33,t=14.8;均P<0.05).PC61处理小鼠在感染早期(第10天)肺内结核菌量低于IgG对照小鼠(t=4.63.P<0.01),但后期比较差异无统计学意义.PC61处理小鼠感染后期(第120天)肺组织病理改变较IgG对照组为轻.结论 结核菌感染后小鼠Treg显著增加;Treg能有效抑制结核菌特异性细胞免疫.进而影响小鼠肺内结核菌的清除和结核病的发生.     

老年脓毒症休克患者CD4+CD25+调节性T细胞的变化及对预后的影响

目的 探讨老年脓毒症休克患者CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Treg)的变化及对预后的影响.方法 选择老年脓毒症休克患者75例,采用流式细胞仪检测患者外周血第1、4天和第7～10天CD4+CD25+叉头转录基因P3(FoxP3)/CD4+比例和白细胞DR抗原(HLA-DR)表达.结果 老年脓毒症休克患者平均年龄(69.2±7.5)岁,28 d病死率为53.3%.(1)休克死亡组与生存组CD4+CD25+FoxP3/CD4+比较,第1天(1.76±0.31)对(1.68±0.24)%,第4天(1.94±0.32)%对(1.82±0.28)%,差异均无统计学意义(P＞0.05),第7～10天休克死亡组(2.65±0.28)%,明显高于存活组(1.79±0.27)%,差异有统计学意义(t=11.30,P＜0.01);(2)死亡组第4天和第7～10天HLA-DR表达持续低下,显著低于生存组(t=7.29,t=16.80,均P＜0.01),并分别与CD4+CD25+FoxP3/CD4+比例呈显著负相关(r=-0.39,P＜0.05;r=-0.58,P＜0.01);(3)多元Logistic回归分析显示,脓毒症休克患者第7～10天CD4+CD25+FoxP3/CD4+(OR=3.47,95%CI:1.33～10.0)和HLA-DR(OR=0.27,95%CI:0.14～0.73)是影响其死亡的独立危险因素.结论 老年脓毒症休克患者CD4+CD25+Treg持续上升,提示机体免疫功能抑制,脓毒症休克死亡的危险性增加.     

系统性红斑狼疮患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量和Foxp3mRNA的表达水平与疾病活动性的相关性

目的 研究系统性红斑狼疮(SEE)患者CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞的数量及其功能基因Foxp3 mRNA的表达水平与SLE疾病活动性和肾脏损伤的相关性.方法 采用四色流式细胞术以Foxp3-异硫氰酸荧光素(FITC )/CD25-藻红蛋白/CD4-多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)/CD3-藻蓝蛋白7抗体组合检测40名健康对照者及42例SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞的数量,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测特异性转录因子Foxp3 mRNA的表达水平,并分析其与SLE患者疾病活动指数(SLEDAI)、补体C3及血清抗双链DNA(dsDNA)抗体的关系.统计学方法采用t检验和Spearman相关分析.结果 活动期SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量显著低于健康对照组[(4±3)％与(7±4)％,P＜0.05],稳定期与健康对照组差异无统计学意义(P＞0.05);活动期SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量及CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞/CD4+比值显著低于稳定期患者[(4±3)％,(9±6)％与(5±4)％,(10±6)％,P均＜0.05];活动期SLE患者外周血Foxp3 mRNA的表达水平明显低于稳定期和对照组(P＜0.01,P＜0.05);SLE患者并发肾病组外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量及CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞/CD4+比值显著低于SLE非肾病组(P＜0.05).相关分析显示,SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量与SLEDAI呈负相关(r=-0.5782,P＜0.05);CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞/CD4+比值与SLEDAI呈负相关(r=-0.4913,P＜0.05),与补体C3呈正相关(r=0.3687,P＜0.05);SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量与Foxp3 mRNA的表达水平呈正相关(r=0.6142,P＜0.0l).结论 SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞和Foxp3 mRNA的变化可能是导致SLE疾病发生和发展的关键因素之一,与疾病的活动性有密切关系.     

慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定前后T淋巴细胞亚群、CD4+CD25+调节性T淋巴细胞及白细胞介素-10、干扰素-γ的变化

目的 观察慢性乙型肝炎(CHB)患者应用拉米夫定抗病毒治疗前后外周血T淋巴细胞亚群、CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Treg)及IL-10、IFN-γ水平的变化.方法 选择CHB患者90例,在应用拉米夫定抗病毒治疗前及治疗后52周时,用流式细胞仪检测患者外周血T淋巴细胞亚群;在治疗前及治疗后12、24、36、52周时,用流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+Treg频率,用双抗体夹心ELISA法检测IL-10、IFN-γ水平.组间及组内总体均数比较采用方差齐性的单因素方差分析或Dunnett's检验,组内治疗前后两时段均数比较采用配对t检验.结果 在90例CHB患者中,完全应答的32例患者的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+较治疗前升高(t=4.055、3.267、2.328,均P＜0.05),外周血CD4+CD25+Treg频率在0、12、24、36、52周时分别为(5.40±0.60)%、(4.99±0.59)%、(4.54±0.72)%、(3.86±0.95)%、(3.44±0.76)%;IFN-γ水平、IFN-γ/IL-10逐步上升,IL-10水平逐步下降.部分应答的43例患者的CD4+T淋巴细胞及CD4+/CD8+较治疗前升高(t=3.484、2.018,均P＜0.05),CD8+T淋巴细胞较治疗前无明显差异,外周血CD4+CD25+Treg频率在0、12、24、36、52周时分别为(5.65±0.60)%、(5.23±0.63)%、(4.65±0.98)%、(4.42±0.97)%、(4.32±0.82)%,IFN-γ水平、IFN-γ/IL-10升高,IL-10水平降低.无应答的15例患者的外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+、外周血CD4+CD25+Treg频率及IFN-y水平、IFN-γ/IL-10、IL-10水平较治疗前无明显变化.结论 应用拉米夫定治疗过程中,获得满意应答的CHB患者的外周血CD4+CD25+Treg频率下降,CD4+/CD8+、IFN-γ/IL-10的比例升高.

Abstract：

Objective To explore the correlation between the efficacy of lamivudine (LAM)therapy and changes of T lymphocyte subsets,CD4+ CD25+ regulatory T lymphocytes (Treg),and levels of interleukin-10 (IL-10)and interferon-gamma (IFN-γ)in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B (CHB).Methods Ninety CHB patients were enrolled in this study.T lymphocyte subsets in the peripheral blood were detected by flow cytometry at baseline and week 52 of LAM therapy.The frequencies of CD4+ CD25+ Treg in the peripheral blood were detected by flow cytometry and levels of IL-10 and IFN-γ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)at baseline,week 12,24,36 and 52.The comparisons of overall means between groups and within groups were done by analysis of variance or Dunnett's test.The comparison of means before and after LAM therapy was done by paired t test.Results In 32 complete-responders of 90 CHB patients,the proportions of CD4+ T lymphocytes,CD8+ T lymphocytes and CD4+/CD8+ ratio were increased significantly after LAM therapy (t=4.055、3.267、2.328,all P＜0.05); the frequencies of CD4+CD25+ Treg at baseline,week 12,24,36 and 52 were (5.40±0.60)%,(4.99±0.59)%,(4.54± 0.72)%,(3.86±0.95)% and (3.44±0.76)%,respectively; the levels of IFN-γ,IFN-γ/IL-10 ratio were increased,while the IL-10 level was decreased after LAM therapy.In 43 partial-responders,the proportion of CD4+T lymphocytes and ratio of CD4+/CD8+ were increased after LAM therapy (t= 3.484,2.018,both P＜0.05); the proportion of CD8+ T lymphocytes was not changed significantly after therapy; the frequencies of CD4+ CD25+ Treg at baseline,week 12,24,36 and 52 were (5.65±0.60)%,(5.23±0.63)%,(4.65±0.98)%,(4.42±0.97)% and (4.32±0.82)%,respectively;IFN-γ level,IFN-γ/IL-10 ratio were increased,while IL-10 level was decreased.In 15 non-responders,the proportion of T lymphocyte subsets,the frequency of CD4+ CD25+ Treg,the levels of IFN-γ and IL-10 were not changed significantly after LAM treatment.Conclusions In CHB patients who have achieved response after LAM therapy,the frequency of CD4+ CD25+ Treg in the peripheral blood is decreased,while ratios of CD4+/CD8+ and IFN-γ/IL-10 in the peripheral blood are increased.     

烟草烟雾暴露大鼠中CD4白细胞介素-17+T细胞与CD+4Foxp3+调节性T细胞的变化及意义

目的 观察烟草烟雾暴露大鼠外周血与BALF中CD+4白细胞介素(IL)-17+T细胞(Th17细胞)与CD; Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)及相关因子的水平变化,探讨Th17和Treg细胞在烟草诱导气道炎症和COPD的发生与发展中的作用.方法 将40只健康清洁级雄性Wistar大鼠分为暴露12周组和24周组、对照12周组和24周组,每组10只.用烟熏法复制大鼠气道炎症的动物模型.收集BALF进行细胞学计数和分类,采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清和BALF上清液中IL-17和IL-6水平,用流式细胞术检测Th17和Treg细胞比例,用实时荧光定量PCR法检测IL-17和Foxp3 mRNA的表达.多组间比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用SNK法和GamesHowell法.结果 暴露12周组和24周组大鼠外周血IL-17浓度分别为(52.6±1.8) ng/L和(75.4±6.0) ng/L,BALF中IL-17浓度分别为(78.1 ±5.8) ng/L和(95.0±6.8)ng/L,均显著高于对照12周组[(40.0±3.2) ng/L和(54.5±4.6) ng/L]及24周组[(36.7±3.2) ng/L和(53.9±3.7) ng/L],暴露24周组与其他3组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).暴露24周组大鼠外周血中IL-6浓度为(31.4±2.1)ng/L,显著高于对照24周组[(11.5±0.5)ng/L];暴露12周组和24周组大鼠BALF中IL-6浓度分别为(33.3 ±2.3)ng/L和(44.6±3.0)ng/L,显著高于对照12周组和24周组[(15.6±1.8)ng/L和(18.0±1.9) ng/L].暴露12周组和24周组大鼠外周血中Th17细胞比例分别为(1.81±0.19)％和(3.74±0.55)％,BALF中Th17细胞比例分别为(7.84±0.28)％和(8.01±0.39)％,均显著高于对照12周组[(0.97±0.08)％和(5.64±0.54)％]及24周组[(1.08±0.10)％和(5.95±0.48)％],暴露24周组与其他3组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).暴露12周组和24周组大鼠BALF中Treg细胞比例分别为(8.81±0.49)％和(11.98±0.72)％,均显著高于对照12周组和24周组[(4.34±0.28)％和(5.21±0.42)％].暴露12周组和24周组大鼠外周血中IL-17 mRNA表达量分别为25.7±2.0和33.9±1.5,BALF中IL-17 mRNA表达量分别为22.2±1.8和34.7±4.2,均显著高于对照12周组(11.3±2.6和11.6 ±2.4)及24周组(11.1±2.0和13.5±3.4);暴露12周组和24周组大鼠BALF中Foxp3 mRNA表达量分别为24.4±2.7和30.3±2.7,显著高于对照12周组和24周组(12.7±2.7和14.6±3.8).暴露组大鼠BALF中Th17细胞与其BALF中细胞总数和巨噬细胞数呈正相关(r值分别为0.512和0.543,均P＜0.05).结论 烟草暴露可导致大鼠气道炎症模型的Th17细胞和Treg细胞及相关炎症因子水平升高,提示Treg细胞可能参与气道炎症的免疫调节,Th17细胞异常升高可能与大鼠气道炎症反应的发生及持续进展有关.     

初发系统性红斑狼疮患者外周血CD4+调节性T细胞CD73表达

目的 研究CD73在初发活动性系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD4+调节性T细胞的表达情况,探讨其在SLE发病中的作用.方法 采用流式细胞术检测29例初发未经治疗的活动期SLE患者(SLE组)和22例健康人(健康对照组)外周血CD4+CD25+CD73+T细胞百分率及CD4+CD73+、CD4+CDhi25、CD4+CD25+T细胞中叉头状转录因子3(FOXP3)蛋白表达,同时对CD73表达水平与SLE活动指标进行相关性分析.结果 SLE组患者外周血CD4+ CD25+ CD73+T细胞百分率低于健康对照组[(1.25±1. 32)%vs(2.35±1.09)%,P＜0.01].SLE组和健康正常对照组,CD73在C4+ CDhi25T细胞的表达水平[(29.05±12.53)%、(43.35±10.09)%]高于CD4+ CD25+T细胞[(17.48±6.92)%、(29.98±10.39)%,P＜0.001];FOXP3蛋白在CD4+ CD73+ T细胞[(65.36±14.40)%、(63.80±14.05)%]、CD4+ CDhi25 T细胞的表达水平[(67.30±13.04)%、(56.30±9.21)%]明显高于CD4+ CD25+ T细胞[(45.70±12.74)%、(43.98±5.17)%,P＜0.001],在CD4+ CD73-T细胞几乎不表达,而在CD4+ CD73+ T细胞、CD4+ CDhi25 T细胞中的表达差异无统计学意义(P值均大于0.05).CD73在CD4+ CD25+ T细胞的表达水平与SLE疾病活动指数、ESR、C反应蛋白、抗补体C1q、抗核小体抗体均无相关性(P＞0.05).结论 CD73可作为调节性T细胞新的表面标记,其在调节性T细胞中的异常表达可能参与SLE的发病机制.     

结肠癌细胞上清液对CD4~＋FOXP3~＋调节性T淋巴细胞形成影响

目的观察结肠癌细胞上清液是否能促进正常CD4＋T淋巴细胞转换成调节性T淋巴细胞,并且探讨TGFβ1在促细胞转换中的重要作用。方法应用流式细胞仪染色CD4＋FOXP3＋,ELISA检测结肠癌上清液中TGFβ1浓度。结果分选的CD4＋CD25-细胞纯度高达96.58%±0.59%,这群细胞中表达CD4＋FOXP3＋较低,为0.34%±0.03%。健康正常人CD4＋FOXP3-细胞分别与人结肠癌细胞colo320HSR及DLD-1上清液共培养后,CD4＋FOXP3＋细胞表达增高（colo320HSR组为4.78%±0.41%,DLD-1组为4.48%±0.29%）;这两组与RPMI 1640培养液阴性对照组CD4＋FOXP3＋细胞2.54%±0.41%相比差异有统计学意义（P〈0.05）。ELISA法检测colo320HSR细胞上清液TGFβ1浓度为（1 228.80±10.65）ng/mL,DLD-1细胞上清液TGFβ1浓度（624.50±12.26）ng/mL,而RPMI 1640无血清培养液中未检测到TGFβ1。在与结肠癌细胞上清液培养同时给与TGFβ抗体后,CD4＋FOXP3＋表达较未加入抗体组明显降低（colo320HSR组2.20%±0.09%,P=0.011;DLD-1组1.67%±0.34%,P=0.033）;而RPMI1640阴性对照组CD4＋FOXP3＋细胞表达下降不显著（1.80%±0.58%,P=0.159）。结论人结肠癌细胞上清液可以促进正常CD4＋T淋巴细胞（CD4＋FOXP3-细胞）转换为调节性T淋巴细胞（CD4＋FOXP3＋）,TGFβ1在肿瘤微环境中调节T淋巴细胞形成可能有一定的作用。识别人调节性T淋巴细胞（CD4＋FOXP3＋）的起源将为肿瘤治疗提供重要信息。