人外周血树突状细胞的体外分离、培养和表型鉴定

目的：建立从人外周血分离、纯化、培养树突状细胞的方法，研究细胞因子对树突状细胞体外增殖、分化成熟的影响。方法：取正常人外周血，经淋巴细胞分离液梯度分离，取中间白膜层细胞，通过贴壁处理，获得单个核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）1μg／ml和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）410ng／ml，体外培养7d后，加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）促进其分化成熟。第8天收获悬浮细胞，用相差显微镜和电镜观察其形态，经树突状细胞（DC）单克隆抗体染色后用流式细胞仪进行表型测定。结果：从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF、rhlL-4和TNF-α联合作用1周左右获得大量高纯度树突状细胞，树突状细胞特征：悬浮生长；具有树突状或裙褶状突起；高表达HLA-DR、CD1a、CD80、CD83、CD86和低表达CD14。结论：用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合作用可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞，经形态学观察及表型鉴定得以证实。该培养技术为进一步研究树突状细胞肿瘤疫苗的临床应用奠定了物质基础。     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的:探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞(DC)分离培养树突状细胞的优化方法。方法:取正常成人新鲜血液,经密度梯度离心法,利用连续贴壁的方法获得单个核细胞,采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导产生成熟DC,倒置显微镜观察树突状细胞结构,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果:连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10%胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83 HLA-DR 及CD80 CD86 。结论:采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞

目的 建立在体外从健康成人外周血单核细胞(Mo)诱导培养成熟的树突状细胞(DC)的方法.方法 采用密度梯度离心法分离健康成人外周血中的单个核细胞(PBMC),再以黏附法分离出Mo,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)体外培养12天,并于培养第6天加入重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)共同培养,于倒置显微镜下观察细胞的形态,以流式细胞仪检测培养6、9、12天DC表面CD1a、CD83、CD86和MHC-DR的表达水平,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力,进行比较分析.结果 Mo经rhGM-CSF rhIL-4诱导培养6 d后,细胞成簇,表型为CD1a 53.2%、CD83 13.6%、CD86 65.5%、MHC-DR 75.4%;TNF-α诱导后,即培养第9 d,细胞表型为CD1a 62.1%、CD83 73.5%、CD86 92.3%、MHC-DR 98.4%,激发初始T细胞增殖的能力最强.结论 rhGM-CSF rhIL-4诱导Mo 6 d,可获得大量不成熟的DC,该体系有利于DC扩增;加入TNF-α,培养第9 d,DC成熟度最高,适合于临床免疫治疗.     

人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究

目的探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,四氮唑蓝法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。结果体外培养第10天,大量细胞出现典型的树突状形态;流式细胞仪检测高表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD1a、人白细胞DR抗原;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞增殖反应。结论该方法可获得较高纯度典型的DC,为DC的临床免疫治疗提供实验依据。     

人外周血树突状细胞的体外培养及鉴定

目的在体外从人外周血中培养、鉴定树突状细胞。方法取正常健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,取贴壁细胞加入重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4,体外培养第7天,加入肿瘤坏死因子-α促进其分化成熟。用倒置显微镜观察其形态,用流式细胞仪进行表型测定。结果从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF,rhIL-4和TNF-α联合培养,获得大量树突状细胞。具有典型的树突状细胞形态和免疫表型,高表达HLA-DR,CD83,CD80,CD86、HLA-DR CD83 及CD80 CD86 。结论用rhGM-CSF,rhIL-4和TNF-α联合培养可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞且高表达HLA-DR,CD80,CD83,CD86、HLA-DR CD83 及CD80 CD86 。     

rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能

目的探讨rAAV-2-HBsAg(表达乙肝表面抗原的重组腺相关病毒)和rAAV-2-GM-CSF(表达粒细胞/巨嗜细胞-集落刺激因子的重组腺相关病毒)共感染对人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)免疫刺激功能的影响.方法用rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF同时感染新分离的树突状细胞;CytoTox 96 Non-Radioactive Ctoxicity Assay试剂盒检测细胞毒性T淋巴细胞(cTL)反应;混合白细胞反应(MLR)检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;流式细胞仪检测DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR.结果rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-CM-CSF共感染的DC刺激同种异体淋巴细胞增值的能力和激发的自身淋巴细胞的CTL效应增强,CD83表达水平提高.结论内源性表达的GM-CSF能促进DC成熟、增强DC的免疫刺激功能.     

肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率

目的:探讨胃癌细胞抗原致敏的树突状细胞(DC)诱导T淋巴细胞(T lymphocyte)增殖和杀伤胃癌细胞的效率.方法: 应用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞,经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhlL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α),体外诱导培养获取成熟DC,流式细胞术检测DC表面CD83,CD80,CD86及HLA-DR表型;同时经重组人白细胞介素2(rhlL-2)诱导扩增T淋巴细胞,检测CD3,CD4,CD8及CD56表型.以人胃癌OCUM-2MD3细胞株冻融抗原致敏DC,然后刺激T淋巴细胞,得到肿瘤抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL).MTT法检测致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响和致敏DC活化的特异性CTL对胃癌细胞的体外杀伤效率.结果: 体外诱导人外周血单个核细胞,可获得大量形态典型、具备强烈刺激增殖能力、且高表达CD80,CD86的DC及高表达CD3的T淋巴细胞;MTT法检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC组刺激T淋巴细胞增殖指数显著高于未致敏DC组和对照组(P<0.01);流式细胞术检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC主要刺激T淋巴细胞增殖为CD8 的CTL(60.58±8.43)%,经胃癌细胞抗原致敏DC刺激后,对胃癌细胞的杀伤效应显著增加,致敏DC组对胃癌细胞杀伤活性(71.57±4.83)%,较未致敏DC组(12.53±1.62)%和单纯T淋巴细胞组(10.45±1.40)%作用更为显著(P<0.01),而且随着效靶比增加,其杀伤效应亦显著增加.结论: 胃癌细胞抗原致敏DC可显著刺激T淋巴细胞增殖为CD8 CTL,进而发挥其高效杀伤胃癌细胞的作用.     

CpG-ODN促进小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟作用的实验研究

目的 改进目前体外扩增树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法,探讨含CpG序列的寡脱氧核糖核苷酸(CpG Oligodeoxynucleotide,CpG-ODN)促进DC成熟的作用.方法 用500u/ml重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和200u/ml重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)诱导小鼠骨髓细胞体外分化成DC,采用相差显微镜、扫描电镜、FACS检测细胞表面分子和混合淋巴细胞反应(MLR)等方法比较CpG-ODN、TNF-α等不同培养方法促进DC成熟的作用.结果 培养10d,可获得大量典型的DC,经FACS检测细胞表面分子、MLR等证实,CpG-ODN具有较强的促进DC成熟的作用.结论 CpG-ODN可以有效促进DC的功能成熟,可应用于科研及临床中.     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的：探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞（DC）分离培养树突状细胞的优化方法。方法：取正常成人新鲜血液，经密度梯度离心法，利用连续贴壁的方法获得单个核细胞，采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子-α（TNF—α）诱导产生成熟DC，倒置显微镜观察树突状细胞结构，流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果：连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC，所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10％胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83^＋HLA—DR^＋及CD80^＋CD86^＋。结论：采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

罗格列酮抑制糖基化-人白蛋白诱导的人单核细胞源树突状细胞的免疫成熟

目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂罗格列酮(rosiglitazone)对糖基化终产物(AGEs)诱导的人单核细胞源树突状细胞(DC)的免疫成熟的影响.方法:采用免疫磁珠法分离人外周血CDl4 单核细胞,经含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,100μg/L)和重组人白细胞介素4(IL-4,20μg/L)的RPMIl640培养5天,使其分化为未成熟DC.先经罗格列酮(50μmol/L)干预24h后,加入糖基化.人血清白蛋白(AGE-HSA,200μg/ml)再干预48h,采用流式细胞术检测树突状细胞表型(CD1a、CD80、CD86和HIA-DR),混合T淋巴细胞反应检测DC对淋巴细胞增殖的影响,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子a(TNF-α)和γ干扰素(INF-γ)的浓度.结果:与对照组相比,经罗格列酮处理的DC可明显下调由AGE-HSA促进的CD80、CD86、HLA-DR和CD1a的表达.使AGE-HSA促进的对T淋巴细胞的增殖作用明显减弱,明显抑制DC细胞因子IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ的分泌(P<0.05).结论:过氧化物酶体增殖物激活型受体γ激动剂罗格列酮可以抑制糖基化-人血清白蛋白诱导的树突状细胞的免疫成熟及其免疫功能,这可能是它抗炎的重要机制之一.     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。