腺病毒介导nm23-H1基因在Tca8113细胞中表达的实验研究

目的:利用人nm23-H1基因重组腺病毒转染Tca8113细胞,检测nm23-H1基因在Tca8113细胞中的表达。方法:制备人nm23-H1基因重组腺病毒并转染人舌癌Tca8113细胞系,采用Western blotting、免疫荧光法、免疫组化法和流式细胞术检测nm23-H1基因的表达。结果:Western blotting、免疫荧光法、免疫组化法和流式细胞术均检测到nm23-H1在Tca8113细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论:重组腺病毒载体Ad-nm23-H1成功介导了Tca8113细胞内nm23-H1基因的表达,为肿瘤的基因治疗提供了依据。     

高温对人舌鳞癌细胞中nm23-H1基因表达影响的实验研究

目的 研究高温治疗癌症与转移抑制基因nm23-H1之间的关系,探讨高温抑制肿瘤细胞侵袭及转移的机理.方法 对人舌鳞癌Tca8113细胞行体外43℃加温,采用电镜、免疫组织化学及流式细胞术等方法,分析加热后舌癌细胞超微结构的变化及nm23-H1表达量的改变.结果 加温使Tca8113细胞中细胞器增多,形态趋向良性分化.在加热43℃时随加热时间延长,细胞中nm23-H1表达量增加,在加热30 min时达到最高,此变化不随加热后培养时间的增加而改变.结论 高温能使肿瘤细胞中nm23-H1表达量增加,并使细胞形态出现一定分化,从而抑制肿瘤细胞的侵袭、转移能力.43℃加热30 min可能是临床治疗舌鳞癌的理想位点.     

nm23-H1基因对舌癌细胞株化疗敏感性的影响体外实验

目的：通过nm23-H1的转化及导入BcaCD885细胞株，观察nm23-H1对BcaCD885细胞株化疗敏感性的影响。方法：完成细胞培养和基因转染后，MTT法观察nm-23-H1对BcaCD885化疗敏感性影响。结果：转染前BcaCD885细胞株对ADM、5－FU、MTX的化疗敏感性无显著差异。但转染后的BcaCD885细胞株对CDDP明显增敏。结论：nm23-H1可能通过特异笥地影响细胞内的能量交换过程来达到对CDDP化疗增敏的效果。     

nm23-H1转染Tca8113细胞后稳定表达细胞株的建立

目的:建立稳定高表达nm23-H1的细胞株。方法:将nm23-H1真核表达质粒转化大肠杆菌,制备感受态细菌。提取质粒,酶切琼脂糖电泳对质粒进行鉴定。脂质体介导将质粒转染人舌鳞癌细胞株Tca8113,G418持续筛选5周,对获得的细胞株进行免疫组化、Western-blott和流式细胞仪鉴定。结果:酶切琼脂糖电泳证实插入nm23-H1片段长度为986bp,质粒片段长度为6550bp,nm23-H1的cDNA被插入在pCMV-Bam-Neo中的BamH1区域。免疫组化、Western-blott和流式细胞仪鉴定表明nm23-H1高表达。结论:成功建立稳定高表达nm23-H1的细胞株。     

有无区域性淋巴结转移的舌鳞癌中nm23-H1基因比较研究

目的:探讨nm23-H1基因与舌鳞癌区域性淋巴结转移的关系。方法:采用免疫组化SP法检测75例舌鳞癌原发灶中nm23-H1蛋白的表达分布,并应用反转录聚合酶链式反应检测其中20例舌鳞癌新鲜标本中nm23-H1mRNA的表达。结果:nm23-H1蛋白和nm23-H1mRNA的阳性表达率在区域性淋巴结转移组分别为27.8%(5/18)、42.9%(3/7),在无区域性淋巴结转移组分别为86.0%(49/57)、92.3%(12/13)。nm23-H1蛋白和nm23-H1mRNA的表达呈显著相关(P<0.05),两者与舌鳞癌区域性淋巴结转移皆呈负相关(P<0.05)。结论:nm23-H1蛋白和nm23-H1mRNA的阴性表达减弱了抑制舌鳞癌转移的能力,联合检测可在细胞及分子水平上了解该基因的表达变化情况,nm23-H1基因可作为评估舌鳞癌有无区域性淋巴结转移的重要指标。     

人舌鳞癌TCA8113细胞在不同温度下nm23-H1基因的表达及其意义

目的:通过测定肿瘤细胞内nm23-H,基因的表达情况,探讨高温治癌与转移抑制基因nm23-H_1之间的关系,以期阐明高温抑制肿瘤侵袭及转移的机理。方法:将人舌鳞癌细胞株Tca-8113细胞分为37℃对照组和43℃实验组,43℃组又分为10、20、30和40min共4个时间亚组。经相应的温度和时间处理后,通过MTT法、免疫组织化学技术及RT-PCR等方法对细胞进行观察、分析,以研究加热后舌癌细胞的生物学行为及nm23-H_1表达量的改变。结果:加温能抑制Tca-8113细胞的增殖活性,在43℃随着加热时间的延长,细胞中nm23-H_1表达量增加,并且在加热30min时达到最高.而在加热40min时有所下降.此变化不随加热后培养时间的延长而改变。结论:高温治疗可能是通过增加细胞中转移抑制基因nm23-H_1表达量来抑制肿瘤细胞的侵袭、转移能力;43℃加热30min可能是临床治疗的理想位点。     

nm23-H1基因在口腔鳞癌颈淋巴结转移不同阶段的调控作用

目的　探讨nm23-H1基因在口腔鳞癌区域淋巴结转移不同阶段的调控作用及影响。方法　利用免疫组化和Western Blot技术,结合淋巴结转移和原发灶浸润分型的资料,分组对照研究nm23-H1基因在200例口腔鳞癌颈淋巴结转移不同阶段的表达情况。结果　淋巴结转移组nm23-H1基因阴性表达率明显高于无淋巴结转移组(P<0·01)。N1期、转移仅累及1个淋巴结、Ⅳc型浸润,以及低分化肿瘤的患者,均有比其它患者明显增高的 nm23-H1基因的阴性表达率(P<0·01);转移至颌下或颌下-颈深上淋巴结平面者的阴性表达率,也高于转移到其它平面者(P<0·05)。结论　nm23-H1基因主要是通过干扰肿瘤实体内高转移细胞亚群的形成和初始转移的发生来调控口腔鳞癌患者的颈淋巴结转移。     

人nm23-H1基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建表达入nm23-H1基因的重组腺病毒载体,并在人胚肾293细胞中进行鉴定.方法:以重组质粒pcDNA3.1-nm23-H1中提取的nm23-H1基因为模板,采用PCR法扩增基因片段.将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α.筛选重组质粒pShuttle-C MV-nm23-H1,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞.筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长nm23-H1基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-nm23-H1.大量扩增Ad-nm23-H1病毒颗粒,并测定病毒滴度.采用RT-PCR法检测nm23-H1基因在293细胞中的转录.结果:经PCR、酶切鉴定及DNA测序结果证实pShuttleCMV-nm23-H1及pAdEasy-nm23-H1质粒正确构建,纯化后的Ad-nm23-H1病毒颗粒感染性滴度为109.5(3.4×109)CCIDs/ml,经RT-PCR扩增出的基因片段,与目的片段大小一致.结论:已成功构建了表达nm23-H1重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据.     

nm23-H1基因转染前后人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中蛋白激酶C转位的变化

目的 研究nm23-H1基因转染诱导人舌鳞状细胞癌(以下简称舌鳞癌)Tca8113 细胞凋亡过程中蛋白激酶C-θ(PKC-θ)的作用.方法 采用脂质体转染法将真核表达载体pAdEasy-nm23-H1 转染人舌鳞癌Tea8113细胞株.应用PKC-θ活化抑制剂 Calphostin C 和 DMSO 预处理细胞30 min 后,常规培养24 h,倒置显微镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot分析Tca8113细胞中PKc-θ裂解活化状况;酶标仪(ELISA)检测Caspase-3的相对活性.结果 人舌鳞癌Tea8113 细胞胞浆中及核周存在PKC-θ的表达,nm23-H1基因转染后PKC-θ从胞浆、核周转位到细胞核内表达.nm23-H1基因转染可导致PKC-θ的裂解活化,形成功能性的催化片段,而Calphostin C 抑制转染诱导的PKC-θ裂解活化.nm23-H1基因转染后,Calphostin C 预处理组和DMSO预处理组Tca8113 的凋亡率、Caspase-3的活性增加,两组间有明显差异(P<0.05).结论 nm23-H1诱导细胞凋亡过程中有PKC-θ的裂解活化,PKC-θ是 nm23-H1 诱导舌鳞癌 Tea8113 细胞株凋亡过程中的参与者,PKC-θ激活Caspase-3诱导细胞凋亡是nm23-H1基因诱导肿瘤细胞凋亡机制之一.     

nm23-H1cDNA克隆及腺病毒载体的构建

目的:在正常人肝组织中克隆nm23 -H1cDNA基因,构建腺病毒克隆载体。方法:应用逆转录多聚酶链式反应(RT- PCR)技术,从正常人肝组织中扩增出nm23- H1cDNA,连接到质粒pMD18- T上,经测序、鉴定,与腺病毒穿梭质粒正向连接,构建腺病毒克隆载体。结果:克隆的基因经测序鉴定,与已知nm23-H1cDNA编码区基因100%符合,以此基因成功构建正向腺病毒穿梭质粒载体。结论:利用分子克隆技术,成功克隆中国人nm23- H1cDNA基因,构建出正向重组腺病毒穿梭质粒载体。     

TRPM1在舌癌组织及Tca8113细胞中表达的研究

目的 观察瞬间受体势M亚基1(Transient Receptor Potential Melastatin-1,TRPM1)在舌癌组织及舌癌Tca8113细胞系中的表达情况。方法 选取25例舌癌组织作为实验组,15例正常舌组织作为对照组,应用免疫组化及Western-blot的方法检测TRPM1蛋白在舌癌组织及Tca8113细胞与正常舌组织中的表达;应用RT-PCR方法检测TRPM1 mRNA在舌癌细胞与正常舌组织中的表达。结果 免疫组化实验结果显示,23/25例舌癌组织中TRPM1呈强阳性表达,2/25例呈阴性表达;12/15例正常舌体组织中TRPM1呈阴性表达,3/15例呈弱阳性表达。TRPM1在舌癌与正常舌组织中的表达有显著性差异(P<0.05);Western-blot实验显示舌癌组织及舌癌细胞系Tca8113细胞中TRPM1蛋白的表达水平高于其在正常舌组织的表达;RT-PCR实验结果也证实TRPM1 mRNA在Tca8113细胞中的表达高于正常舌组织。结论 TRPM1与舌癌的发生可能存在相关性。     

血管内皮生长因子-C基因转染对Tca8113细胞转移能力影响的研究

目的　研究血管内皮生长因子-C(VEGF-C)对鳞癌细胞淋巴道转移能力的影响 ,以探讨其在口腔黏膜鳞癌淋巴道转移机制中的作用。方法　用本课题组前期建立的 VEGF-C高表达舌癌细胞株 ,以裸小鼠皮下接种构建动物肿瘤模型 ,观察VEGF-C高表达对移植瘤的生长和颈淋巴转移的影响。结果　VEGF-C高表达移植瘤实验组的颈淋巴结转移率高于对照 组 ,但实验组与对照组的移植瘤原发灶生长速度没有明显差异。结论　VEGF-C对舌鳞癌的淋巴道转移有相对特异的作用 ,可作为口腔癌颈淋巴转移预防和治疗的新靶位     

吉西他滨对舌鳞癌细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的:了解吉西他滨对舌鳞癌Tca8113细胞增殖及端粒酶活性的影响。方法:采用噻唑蓝(MTT)和碘化丙锭(PI)染色法,检测细胞增殖抑制率和细胞周期变化;采用TRAPPCRELISA法检测细胞端粒酶活性,PAGE-银染法显示端粒酶电泳图像。数据采用SPSS10.0中独立样本t检验法或单因素方差分析法进行统计学检验。结果:吉西他滨能够显著抑制Tca8113细胞增殖,并具有时间和浓度依赖性,5.0μg/ml组72h增殖抑制率均值为72.2%,高于0μg/ml组(F=161.854,P<0.05)。细胞周期检测显示:吉西他滨作用72h后,S期细胞比例下降,5.0μg/ml组均值为18.1%,低于0μg/ml组38.5%(t=5.801,P<0.05)。TRAPPCRELISA法检测细胞端粒酶活性(A值)随吉西他滨作用浓度增加和时间延长而下降:72h,0和5.0μg/ml组A值分别为1.32±0.12、0.28±0.02(F=811.208,P<0.05)。结论:吉西他滨能够有效抑制Tca8113细胞增殖,可以降低细胞端粒酶活性。     

加热对人舌癌Tca8113细胞尿激酶型纤溶酶原激活物表达的影响

目的　研究加热对人舌癌Tca8113细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(UPA)表达的影响。方法　采用免疫组织化学染色和流式细胞术检测Tca8113细胞在不同加热温度下(37℃、40℃、43℃、45℃)UPA表达情况。结果　与37℃组相比,40℃、43℃组加热后Tca8113细胞UPA表达明显下降(P<0·05),而45℃组UPA表达下降,但无统计学意义(P>0·05)。结论　口腔鳞癌局部热疗不会促进侵袭、转移,还会对肿瘤的侵袭、转移有抑制作用。     

体内诱导法建立的Tca8113细胞耐卡铂细胞株的耐药性表达研究

目的探讨通过体内诱导法得到的耐药细胞株的耐药性表达情况。方法以人舌癌Tca8113细胞系为研究对象,实验组采用荷瘤耐药动物的肿瘤细胞培养获得,对照组为体外连续培养诱导其产生耐药性。用四唑蓝法检测细胞耐药指数,标记生物素链亲和素法免疫细胞化学检测耐药相关蛋白P糖蛋白、谷胱甘肽S转移酶π、多药耐药蛋白和拓扑异构酶Ⅱ的表达,逆转录PCR检测多药耐药基因、多药耐药蛋白、拓扑异构酶Ⅱ和谷胱甘肽S转移酶π的表达。结果免疫细胞化学和逆转录PCR显示2组细胞多药耐药蛋白、谷胱甘肽S转移酶π、拓扑异构酶Ⅱ等表达均升高,但体内诱导较体外诱导可以获得更高、更稳定的耐药性。诱导后的Tca8113细胞对氨甲喋呤、卡铂、平阳霉素、长春新碱耐药性明显升高,而对5-氟尿嘧啶耐药性增加不明显。结论体内诱导得到的细胞株耐药性明显高于体外诱导株,肿瘤细胞的耐药现象受多种基因的调节。体内诱导Tca8113卡铂耐药细胞株Tca8113/CBP-vo可以作为肿瘤耐药研究的平台。     

PD184352对舌鳞状细胞癌细胞增殖及ERK蛋白表达的影响

目的:体外观察PD184352对人舌癌细胞Tca8113细胞增殖及ERK蛋白表达的影响。方法:采用MTT比色试验法观察PD184352对Tca8113细胞增殖的影响,免疫细胞化学观察ERK蛋白的表达。结果:随着PD184352作用浓度和作用时间的增加,其对舌癌细胞增殖抑制率显著增高(P<0.05)。当100μmol/L的PD184352刺激Tca8113细胞72h后,对舌鳞状细胞癌细胞抑制率达到69.2%。加入PD184352后ERK蛋白在舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113中表达降低(P<0.05),随着浓度的增加而更为明显。结论:体外PD184352对Tca8113细胞增殖有抑制作用,该作用可能与及抑制ERK蛋白表达有关。