天花粉蛋白抑制TCR介导的Jurkat T细胞蛋白酪氨酸磷酸化以及PLCγ1磷酸化

目的研究天花粉蛋白（Ｔｋ）抑制Ｔ细胞增殖的作用机理。方法以抗ＣＤ３的ＭｃＡｂ刺激ＪｕｒｋａｔＴ细胞增殖，以３Ｈ－ＴｄＲ同位素掺入法观察Ｔｋ对其抑制作用。用免疫沉淀和免疫印迹法测定胞浆蛋白酪氨酸磷酸化情况。结果Ｔｋ能够抑制ＣＤ３ＭｃＡｂ刺激的ＪｕｒｋａｔＴ细胞的增殖，并且经Ｔｋ脉冲处理后的ＪｕｒｋａｔＴ细胞对ＣＤ３ＭｃＡｂ活化作用的反应降低。深入分析后发现，在Ｔｋ作用下胞浆蛋白酪氨酸磷酸化水平降低，经ＰＬＣγ１免疫沉淀后，发现ＰＬＣγ１的磷酸化也能够被Ｔｋ作用所抑制。结论Ｔｋ对Ｔ细胞活化的抑制涉及并经由ＴＣＲ的激活信号传导，其机理与阻断胞浆蛋白酪氨酸激酶磷酸化有关     

天花粉蛋白对T细胞活化的抑制作用与信息传导

目的 观察天花粉蛋白经由ＴＣＲ／ＣＤ３介导的信号传递途径抑制Ｔ细胞活化增殖的效应方法 用各种不同的刺激信号来激活外周血淋巴细胞，然后观察天花粉蛋白对其增殖抑制的影响。接着测定天花粉蛋白对ＣＤ３单抗刺激后Ｔ淋巴细胞内一些信号传导物质变化的影响。结果 天花粉蛋白抑制经由ＴＣＲ／ＣＤ３信号传导途径诱发的淋巴细胞增殖。进而发现细胞内游离钙离子的升高，蛋白激酶Ｃ的转位和细胞内蛋白酪氨酸磷酸化受天花粉蛋白的抑     

天花粉蛋白对HepA-H细胞和HeLa细胞抑癌活性研究

目的：比较分析商品天花粉蛋白(TCS1) 和从鲜药材中提取分离出的天花粉蛋白粗品（TCS2），对HepA-H细胞（腹水型肝癌高转移株细胞）和HeLa细胞（人宫颈癌肿瘤细胞）的杀伤作用，并进一步探讨其抑癌作用机理。方法： MTT法检测药物的细胞毒作用，电镜观察细胞超微结构改变，电泳检测细胞DNA生物化学特征改变。结果： TCS1和TCS2对HepA-H细胞作用不明显（P>0.05），而对HeLa细胞具有显著性作用，呈明显时效、量效关系（r>0.864, P<0.05或P<0.01）。在相同作用时间内，TCS2作用组对细胞生长抑制率均高于TCS1组（P<0.01）。进一步研究发现，HeLa细胞经TCS2作用后，细胞表面微绒毛消失，胞膜发泡，核染色质浓缩边集，并出现凋亡小体，细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳呈典型的梯形带。结论： HepA-H细胞对天花粉蛋白不敏感，而HeLa细胞对TCS1和TCS2敏感，其中TCS2抑癌活性明显强于TCS1，细胞生长受抑制作用显著，作用机制与诱导细胞凋亡相关。     

天花粉毒蛋白免疫毒素对黑色素瘤细胞的体外抑制

用单链致核糖体失活蛋白天花粉蛋白(TCS)和抗人黑色素瘤单抗(Ng76)构建了免疫毒素(Ng76—TCS),它对体外培养的人黑色素瘤细胞M21具有强烈的抑制活性,IC_(50)为5.6×10~(-10)mol/L,其毒性比游离的TCS 和Ng76的混合物高2000倍,比TCS 与正常小鼠免疫球蛋白的复合物(NIgG—TCS)高160倍,而它对非靶细胞HeLa 的IC_(50)为7.0×10~(-?)mol/L,毒性较靶细胞低125倍。结果表明,免疫毒素TCS—Ng76对体外培养的黑色素瘤细胞有很强的选择性杀伤作用.     

天花粉蛋白联合CD40信号激发的人MoDC介导Th2细胞分化的研究

探讨天花粉蛋白(Tk)联合CD40信号诱导人单核细胞来源DC(MoDC)的成熟活化及其介导Th2细胞分化的作用和机制。采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导人MoDC,并利用鼠抗人CD40激发型单抗(5C11)刺激负载了Tk的DC制备成熟DC。采用免疫荧光标记和流式细胞术分析DC表型(CD80、CD83、CD86、CD14、PDL1)及其摄取FITC-Dextran的能力;ELISA法测定DC上清中IL-12p70的含量;胞内染色和流式细胞术检测经成熟DC活化的T细胞中CD4~+IFN-γ~+T和CD4~+IL-4~+T的比例。实验结果显示单独Tk不能刺激DC完全成熟,用Tk负载DC后必须联合外源性成熟刺激信号(如5C11),才能有效促进DC成熟,表现在CD80、CD83、CD86的上调表达,CD14下调表达,DC摄取FITC-Dextran的能力降低。与CD40信号单独诱导组相比,Tk联合CD40信号诱导的成熟DC表面PDL1分子呈下调表达,分泌IL-12的能力显著降低,明显提高T细胞中CD4~+IL-4~+T的比例。由此表明负载了Tk的成熟MoDC体外能有效介导Th2细胞分化。     

天花粉蛋白抑制HeLa细胞生长及诱导细胞凋亡之机制探讨

目的研究天花粉蛋白（TCS）对人宫颈癌HeLa细胞生长抑制作用及其机制,探讨HeLa细胞凋亡发生的分子机制.方法采用CCK-8的方法,检测TCS对HeLa细胞的抑制作用;流式细胞仪检测TCS对细胞周期的影响;电子显微镜和Annexin法观察TCS对HeLa细胞诱导凋亡的作用;应用Western blotting观察HeLa细胞caspase-3酶原的变化;用caspases活性检测试剂盒,检测caspase-3,8,9的活性.结果1.TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用;2.TCS可以将HeLa细胞阻滞于S期;3.TCS诱导HeLa细胞发生凋亡,HeLa细胞出现典型的凋亡特征--染色质浓缩和凋亡小体,且凋亡率具有时间依赖性;4.caspase-3酶原表达的降低呈现时间和浓度依赖性,而caspase-3活性随时间依赖性的增高,提示在TCS诱导HeLa细胞凋亡的过程中caspase-3被激活;5.caspase-8,9的活性增高,有时间依赖性,且具有时间顺序.100 mg/L TCS处理24h后,caspase-8早于caspase-3被激活,提示活化的caspase-8可能对caspase-3起到激活作用.结论TCS对HeLa细胞的抑制作用是通过将HeLa细胞阻滞于S期和诱导细胞凋亡来实现的.caspase-3的激活是介导TCS诱导HeLa细胞发生凋亡的通路,同时,活化的caspase-8,9可能参与了caspase-3的激活和凋亡的诱导.     

天花粉蛋白诱发CD8阳性细胞参与的人体免疫抑制

已证明0.05～5μg/ml 剂量范围内的天花粉蛋白对同种异体抗原、可溶性抗原、致分裂原诱发的人体淋巴细胞体外增殖的强烈抑制作用,与细胞裂解无关。本文提供的下列证据进一步表明,天花粉蛋白诱发的免疫低反应性属于免疫抑制:①经该蛋白脉冲处理过的 PBMC 照射后加到不含天花粉的培养组合中可抑制新鲜PBMC的增殖;②天花粉蛋白脉冲处理过的PBMC培养上清液显示抑制功能;③去除CD8阳性细胞抑制缓解;回加 CD8阳性细胞抑制再现,提示有CD8抑制性T细胞参与反应。     

天花粉蛋白对T淋巴细胞功能的调节作用

天花粉蛋白是从中药天花粉中提取纯化的一种活性蛋白,具有引产、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性。近年来的研究发现,天花粉蛋白对免疫系统具有调节作用。本文从细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡三个方面就其对T淋巴细胞功能的调节作用作一综述。     

天花粉蛋白合成肽通过激活抑制性CD8~+ T细胞诱导免疫抑制

为了探讨天花粉蛋白合成肽(M-Tk)诱导免疫抑制的机制,应用小鼠针对可溶性抗原OVA的增殖系统,检测M-Tk处理后对淋巴细胞增殖的抑制作用和细胞因子格局的变化,以及M-Tk激活的T淋巴细胞亚群的表型及功能。结果表明,M-Tk可诱导一群CD8+ T抑制性细胞,其表型为CD8+CD28-CTLA4+,采用双层非接触共培养系统发现,该群抑制性细胞主要依赖于细胞因子IL-10、IL-4和细胞间接触发挥免疫抑制作用。     

天花粉蛋白对不同小鼠品系T细胞亚群分化的影响

为进一步探讨不同品系小鼠对天花粉蛋白(Tk)免疫抑制敏感性不同的机制,选择Tk高敏感品系(C57BL/6)和低敏感品系(C3H/He)小鼠,建立OVA特异性体外增殖系统,应用流式细胞术胞内细胞因子染色技术分析Th和Tc细胞亚群,real-time PCR检测细胞因子及相关转录因子的mRNA水平。发现Tk作用下,高敏感品系小鼠C57BL/6 IL-4阳性T细胞明显增多,表达IFN-γ阳性T细胞则显著减少。而低敏感品系C3H/He相关变化不明显。T细胞分化相关细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ及转录因子T-bet、gata-3的基因表达水平也呈现类似的格局。提示Tk发挥免疫抑制作用可能与其诱导的以Th2/Tc2为主的T细胞亚群有关,且这种诱导特定细胞亚群的作用在小鼠中和H-2b基因型相关。     

天花粉蛋白抑制T细胞增殖的免疫学机制研究

目的研究天花粉蛋白(Tk)诱导免疫抑制的免疫学机制。方法应用淋巴细胞体外增殖抑制试验，分别对丝裂原ConA、可溶性抗原OVA及CD3联合CD28 McAb三种T细胞增殖系统进行Tk诱导免疫抑制的剂量依赖性试验。建立OVA特异性的T细胞系(Tova)，观察Tk对由IL-2-IL-2R信号介导的T细胞增殖的抑制作用。用FACS测定Tk处理过的脾脏单个核细胞(SMC)的凋亡。分离骨髓诱导产生未成熟的DC(iBDC)，比较Tk冲击处理前后DC激活T细胞增殖能力的差异。用Tk冲击处理Tova，观察Tk冲击处理前后T细胞增殖能力的变化。结果低剂量的Tk(1ng，ml～500ng/ml)对OVA增殖系统有强烈的抑制作用，对ConA增殖系统抑制较弱，而对CD3联合CD28 McAb及IL-2增殖系统的T细胞增殖几乎无抑制作用。在5μg/ml的Tk浓度以下，Tk不诱导SMC凋亡。Tk冲击处理过的iBDC提呈OVA激活特异性T细胞的能力明显下降；而Tk冲击处理过的Tova增殖能力没有受到影响。结论Tk通过影响APC来诱导免疫抑制。     

天花粉蛋白对T细胞活化的抑制作用与信号传导

目的观察天花粉蛋白经由ＴＣＲ／ＣＤ３介导的信号传递途径抑制Ｔ细胞活化增殖的效应。方法用各种不同的剌激信号来激活外周血淋巴细胞，然后观察天花粉蛋白对其增殖抑制的影响。接着测定天花粉蛋白对ＣＤ３单抗剌激后Ｔ淋巴细胞内一些信号传导物质变化的影响。结果天花粉蛋白抑制经由ＴＣＲ／ＣＤ３信号传导途径诱发的淋巴细胞增殖。进而发现细胞内游离钙离子的升高，蛋白激酶Ｃ的转位和细胞内蛋白酪氨酸磷酸化受天花粉蛋白的抑制。结论天花粉蛋白可通过ＴＣＲ／ＣＤ３的信号传导途径抑制Ｔ细胞增殖。     

抗天花粉蛋白单抗用于天花粉蛋白免疫毒素的亲和纯化

天花粉蛋白（ＴＣＳ）是一种单链致核糖体失活的蛋白，用细胞融合技术筛选到一株分泌抗该蛋白单抗的杂交瘤细胞株（Ｔ１Ａ９），并将单抗Ｔ１Ａ９制成免疫亲和凝胶，用此亲和凝胶纯化以ＴＣＳ和抗人黑色素瘤单抗Ｎｇ７６构建的免疫毒素，能有效地分离掉样品中的游离抗体，提高免疫毒素的毒效。体外细胞毒性实验表明，亲和纯化的免疫毒素对黑色素瘤细胞（Ｍ２１）的杀伤作用比分子筛（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００）层析后的样品提高了６．３倍。它对Ｍ２１细胞的半致死浓度（ＩＣ＿（５０））为１．０×１０￣（－１０）ｍｏｌ／Ｌ。比ＴＣＳ和Ｎｇ７６的混合物的毒性（ＩＣ＿（５０）＝２．５×１０￣（－７）ｍｏｌ／Ｌ）提高了２５００倍。ＴＣＳ是制备免疫毒素的一种有效和常用的“弹头”，用此法纯化这类免疫毒素将会有一定的普遍性。     

天花粉蛋白诱导黑色素瘤凋亡机制的研究

目的：研究天花粉蛋白(TCS)对黑色素瘤B-16细胞的作用，探讨天花粉蛋白抗肿瘤的机制。方法：(1)应用单细胞电泳及Hoechst33258染核形态观察来研究TCS对黑色素瘤B-16细胞损伤作用。(2)应用激光共聚焦扫描显微术结合特异性荧光探针Fluo-3/AM、H₂DCF-DA和DAF-FM diacetate观察在TCS作用下，单个瘤细胞内钙离子（Ca²⁺）、一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的信号动态变化，并探讨细胞内ROS和NO的增加与钙离子的关系。结果：(1)终浓度50 mg/L TCS孵育3 h、6 h后，单细胞电泳、Hoechst33258染色的核形态观察未发现与对照组有明显区别；孵育12 h后单细胞电泳可见DNA损伤的特征性现象-彗星尾巴；Hoechst33258染色的核形态观察发现有明显的核浓缩和边集现象，出现特征性凋亡小体。(2)终浓度50 mg/L的TCS可引起细胞内Ca²⁺、NO和ROS的生成量明显高于对照组（P＜0.01）。细胞内ROS和NO的增加与钙离子的增加密切相关。结论：天花粉蛋白对黑色素瘤B-16细胞DNA具有较强损伤作用，可诱导其发生凋亡；天花粉蛋白诱导凋亡可能与细胞内钙、ROS和NO的增加有关。     

天花粉蛋白诱导人类白血病细胞株HL-60细胞凋亡的研究

目的:研究单链核糖体失活蛋白天花粉蛋白(TCS)诱导人类白血病细胞株HL-60细胞发生凋亡的作用及放线菌酮(CHX)对此作用的影响。方法:采用流式细胞术分析及荧光显微镜观察研究TCS诱导HL-60细胞发生凋亡的情况。结果:流式细胞术分析表明TCS能够诱导HL-60细胞发生明显的凋亡现象,TCS(20mg/L)处理48h细胞凋亡百分率为48.7%±2.3%(x±s),明显高于对照组的凋亡率(6.3%±1.0%)(P＜0.05),而CHX(5mg/L)相同条件下诱导的凋亡率为65.3%±3.9%。TCS诱导的凋亡现象进一步为荧光显微镜的观察及DNA凝胶电泳所证实,TCS处理的细胞中有许多细胞呈现典型的凋亡细胞核形态改变,如染色体凝缩、核碎裂等;DNA凝胶电泳显示TCS处理的细胞呈典型的梯级格局。进一步研究表明预先以低浓度CHX(0.2mg/L)处理可显著加强TCS的作用,而在这个浓度下单独CHX并不诱导明显的细胞凋亡。TCS诱导HL-60细胞的凋亡呈时间和剂量依赖关系。结论:TCS能够诱导HL-60细胞发生明显的凋亡,CHX可加强这种作用。这些结果提示TCS诱导的凋亡不依赖于新的蛋白质合成。     

McAb共激活T细胞介导肝癌细胞前后的膜分子与TCR Vβ基因的 …

Ｔ淋巴细胞活化是一个涉及多种膜表面分子和受体以及一系列相关多肽的复杂过程，为了使Ｔ细胞发挥更好的识别和杀伤癌细胞的功能，采用抗ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ２、ＣＤ５８ＭｃＡｂ分别刺激健康人ＰＢＬｓ后作用肝癌细胞，对作用前后ＰＢＬｓ用ＦＡＣＳ进行表型分析，结果发现：作用后ＣＤ３和ＣＤ８分子表达比作用前明显增高，而ＣＤ４分子无显著变化，同时基因家族采用ＲＴ－ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹     

TCR/CD3介导T细胞活化的信号途径

T淋巴细胞经特异抗原刺激后，由于TCR／CD3的介导作用，使细胞骨架蛋白及核内转录因子活化，并引起细胞形态改变、生长因子分泌、细胞黏附性改变等免疫应答，使细胞发生活化或激活诱导的细胞死亡（Activation—induced cell death，AICD）。T细胞活化需要两种信号，一种是TCR／CD3与抗原提呈细胞（Antigen presenting cells，APCs）表面特异的MHC-抗原肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号；另一种是非特异性抗原刺激信号，如：CD2、CD28、CD80、LFA-1（Lymphocyte function associated antigen-1）和ICAM（Intercellular adhesion moleculel）等与各自相应配体结合而产生的协同刺激信号。如果只有TCR／CD3复合物存在，没有协同刺激信号参与，则不能有效地激活T细胞，而可能导致T细胞产生不应性（Anergy），甚至细胞凋亡（Apoptosis）。T细胞特异性抗原或TCR／CD3的特异性抗体可引起T细胞跨膜受体以及膜附近的其它信号分子的活化或抑制，调节T细胞的增殖、分化或凋亡，这个过程涉及一系列下游信号传导和基因表达调控。近几年对TCR／CD3近膜区的信号复合体的形成、相关信号分子的磷酸化、细胞骨架重组、NF—κB活化、以及与多个信号通路密切相关的蛋白分子，如PI-3K和PKCθ等，在信号通路中的作用有了更深刻的了解，本文就这方面的进展作一简要综述。     

前列腺素E2抑制T细胞活化的机制

机体在严重烧伤、创伤、败血症等情况下,T细胞免疫功能受到抑制.前列腺素E2是抑制T细胞免疫活化的重要炎性介质之一,它通过对T细胞活化途径中的信号转导分子的抑制作用,使T细胞处于免疫失活或无能状态,这种免疫调节作用,在机体处于应急状态下,发挥免疫保护作用.