人类晶体上皮细胞的体外培养与观察

目的：建立人类晶体上皮细胞培养的简便方法并观察原代和传代细胞的生物学特征和组织学变化。方法：将人工晶体植入术中取下的前囊膜分割成小碎片，吸管转移至培养瓶底部进行原代培养，7—10d后常规方法进行传代培养，采用相差显微镜观察活体细胞的增殖活动和形态学变化。结果：人类晶体上皮细胞在体外培养时可以存活并传代，但是其生存能力与供体年龄有关。传代后期细胞发生纤维化改变。结论：本方法简便，有效。可用于实验研究。     

老年性白内障晶状体上皮细胞超微结构的研究

目的　观察老年性白内障晶状体上皮细胞超微结构的改变 ,探讨细胞凋亡在老年性白内障形成中的作用。方法　老年性白内障患者 2 4例 ,行囊外或超声乳化联合后房型人工晶状体植入术 ,术中取中央部晶状体前囊膜 ,分别行光镜、扫描电镜、透射电镜观察。结果　老年性白内障晶状体上皮细胞的超微结构改变有细胞形态大小不一 ,扁平细胞多无正常细胞结构 ,低柱状及柱状细胞结构大体正常 ,但细胞间隙增大 ,胞浆内可见空泡变性 ,部分细胞溶解坏死或发生皱缩 ,未见凋亡细胞。结论　老年性白内障的发生与晶状体上皮细胞变形坏死密切相关 ,与晶状体上皮细胞凋亡无关     

晶状体上皮细胞DNA损伤的SCGE测定法

目的 研究晶状体上皮细胞DNA的损伤.方法 应用单细胞凝胶电泳(SCGE)法测定氧化、辐射及细胞外高糖、高钙环境对晶状体上皮细胞DNA的损伤.结果 对照组中晶状体上皮细胞呈圆形无拖尾,表明其DNA未受损伤.各处理组细胞呈不同程度的典型彗星图像,头尾分明,与对照组相比差异具有显著性(P＜0.001).结论 以SCGE法测定出多种因素均可导致体外培养的晶状体上皮细胞DNA损伤,考虑其可能与白内障的形成有关.     

微波辐射后晶状体上皮细胞与未辐射晶状体上皮细胞蛋白质组双向电泳图谱比较

[目的]比较正常晶状体上皮细胞与微波辐射后晶状体上皮细胞蛋白质组双向电泳图谱差异,从蛋白质组水平初步探索微波辐射对人眼晶状体的损伤。[方法]体外培养人晶状体上皮细胞株,随机分为实验组和对照组,实验组用SAR值为4.0 W/kg的1800 MHz制式微波辐照2 h,对照组同一辐射箱培养但不辐射。辐照后立即提取总蛋白质,固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳进行蛋白质分离,银染显色的凝胶通过GS-800扫描仪获取图像,使用PDQuest专业图像分析软件分析电泳图像。[结果]正常晶状体上皮细胞与微波辐射后晶状体上皮细胞分别检出897个和981个蛋白质斑点。对2张电泳图进行匹配后,发现有4个蛋白质点在辐射后细胞蛋白质组图谱中上调表达,3个蛋白质点下调表达。[结论]初步建立了人晶状体上皮细胞比较蛋白质组学的实验方法;差异蛋白质的发现为深入理解辐射性白内障发病机制提供了有益的线索。     

老年性白内障晶状体上皮细胞的形态学变化

目的 观察老年性白内障晶状体上皮细胞的形态学改变，探讨其与白内障形成的关系。方法 采集老年性白内障晶状体囊外除术中取出的前囊膜，采用铺片及ＨＥ染色、平板包埋及制备超薄切片等技术，分别在光镜和电镜下观察晶状体上皮细胞的密度、细胞形态和超微结构变化。结果 白内障 晶状体上皮细胞密度较正常晶状体明显减小（Ｐ〈０．０１），６０岁以上组细胞低于６０岁以下组（Ｐ〈０．０１）。光镜下，形态异常的细胞散在分布，     

硫氧还蛋白-2 在氧化损伤的人晶状体上皮细胞中的表达及其意义

目的：探讨硫氧还蛋白-2(thioredoin-2,Trx-2)是否参与白内障的发病过程及其对过氧化氢(H2O2)诱导的 人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响。方法：选取志愿者(因外伤行透明晶状体取出术患者)10例和行超声乳化白内 障手术患者(年龄大于60岁)30例的晶状体前囊膜,采用链霉素亲生物素蛋白-过氧化物酶标免疫组织化学法检测志 愿者和白内障患者晶状体上皮细胞中Trx-2蛋白的表达情况。体外培养SRA01/04细胞,根据不同处理分为空白对照 组、20 μmol/L H2O2组、50 μmol/L H2O2组、100 μmol/L H2O2组、阴性对照组(转染对照空pCMV6质粒并用100 μmol/L H2O2处理)和过表达Trx-2组(转染pCMV6-Trx-2过表达质粒并用100 μmol/L H2O2处理)。采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法检测各组细胞活力;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡;采用 化学比色法检测各组细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,谷胱甘肽 (glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;采用Western印迹检测各组细胞中Trx-2以及B细胞淋巴瘤/白 血病-2蛋白(B-cell lymphoma 2 protein,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)的表达。结果：与志愿者相比,白内障患者晶状体上皮 细胞中Trx-2蛋白表达明显减少(P<0.05)。与空白对照组比较,20, 50,100 μmol/L H2O2组Trx-2蛋白表达量均明显降低 (均P<0.05)。与空白对照组相比,100 μmol/L H2O2组和阴性对照组细胞存活率降低、凋亡率增加,细胞内SOD和CAT 活性降低、GSH含量减少、MDA含量增加,Trx-2和Bcl-2蛋白表达降低,Bax和caspase-3蛋白表达增加(均P<0.05)。与 阴性对照组比较,过表达Trx-2组细胞存活率增加、凋亡率降低,SOD和CAT活性增加、GSH含量升高、MDA含量降 低,Trx-2和Bcl-2蛋白表达增加,Bax和caspase-3蛋白表达减少(均P<0.05)。结论：Trx-2参与白内障发病中上皮细胞的凋 亡,过表达Trx-2能够减少H2O2诱导的细胞凋亡,这可能与拮抗H2O2诱导的氧化损伤有关。     

人晶状体上皮细胞体外培养方法的改良

目的改良现有人晶体上皮细胞的培养方法,建立稳定的体外培养模型。方法用改良培养法对人胚胎眼晶体前囊膜进行培养,并利用形态学检查方法进行检测和鉴定。结果组织块法在加入培养基24 h内即可见细胞生长,且保持上皮细胞形态,1wk左右细胞融合。在体外可传5代以后细胞衰老,存活者呈成纤维细胞状。消化法中2 d后见细胞壁生长,1周左右细胞融合。结论成功地改进了建立晶状体上皮细胞体外培养模型的方法,为研究后囊膜混浊发病机制提供了方法学基础。     

紫外线对人晶状体上皮细胞凋亡的诱导及Bcl-2,Bax基因的影响

目的:研究紫外线照射体外培养人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC)对凋亡的诱导、凋亡调控基因(Bax,Bcl-2)表达的变化,探讨紫外线诱导HLEC凋亡的机制。方法:以实验室培养的HLEC细胞株为研究模型,采用同一紫外线光源对HLEC进行照射。按紫外线照射时间将HLEC分为0,5,10,15及30 min组。采用Annexin V+PI双染流式细胞计数对HLEC凋亡进行检测,用原位杂交的方法检测各组Bax,Bcl-2 mRNA的表达。结果:随紫外线照射时间的延长HLEC凋亡率增加,Bcl-2阳性细胞率逐渐降低;而Bax阳性细胞率逐渐增加。HLEC凋亡率与Bcl-2和Bax的比率呈负相关(r=-0.874,P<0.05)。结论:紫外线照射可诱导HLEC凋亡,Bax和Bcl-2可能参与了紫外线诱导的HLEC凋亡的基因调控过程。     

ROCK2在ARC中的表达及对晶状体上皮细胞的自噬及氧化损伤的影响

目的 探讨Rho激酶2(ROCK2)在年龄相关性白内障(ARC)晶状体前囊膜中的表达及其对H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞自噬及氧化损伤的影响。方法 收集2020年6月～2021年4月在我院行超声乳化白内障吸出术的ARC患者20例,获取晶状体前囊膜,并获取眼科标本库中无眼科疾病、眼球结构完整且晶状体透明的正常晶状体前囊膜。免疫组织化学染色和Western blot检测ROCK2蛋白表达;将人晶状体上皮细胞HLE-B3随机分为对照组、H₂O₂组、sh-NC+H₂O₂组和sh-ROCK2+H₂O₂组,转染sh-NC或sh-ROCK2至对应组细胞,并用H₂O₂处理细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞转染效率,MTT法检测各处理组细胞增殖活性,透射电镜观察细胞内自噬现象,自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染细胞后观察自噬溶酶体和自噬体水平,Wester...     

姜黄素抑制晶状体上皮细胞增殖的信号转导机制

目的:探讨姜黄素(curcumin,Cur)抑制重组人表皮生长因子(recom binanthuman epidermal growth factor,rhEGF)诱导的牛晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)增殖的信号转导机制。方法:采用荧光分光光度法检测Cur作用后LEC内游离Ca2 浓度;应用放射免疫分析法检测Cur作用后LEC内cAMP和cGMP含量的变化。结果:经50μg/LrhEGF作用后,LEC内游离Ca2 浓度明显升高,Cur可使LEC内游离Ca2 浓度进一步升高。经50μg/LrhEGF作用后,LEC内cAMP浓度明显下降,cGMP浓度明显升高;而Cur则可使rhEGF作用后的LEC内cAMP浓度明显升高,cGMP浓度明显降低。结论:Cur可抑制rhEGF诱导的LEC增殖,其抑制细胞增殖的作用可能是通过多条信号转导途径来实现的。     

The Apoptosis of Bovine Lens Epithelial Cells Induced by Proteasome Inhibitor MG132

To investigate the effect of proteasome inhibitor MG132 on the apoptosis of bovine lens epithelial cells （BLECs）, the cells were treated with MG132 at different concentrations for12, 24 and 36 h. The cell viability was analyzed by MTT assay and the effect of MG132 on the apoptosis of BLECs was assessed by flow cytometry （FCM）. The results showed that after treatment for the same period, the inhibitory effect of MG132 on BLECs proliferation was enhanced with the increment of the concentration of MG132 （0, 2, 5, 10, μmol/L） （P〈0.05）. The 50% inhibiting concentration （IC50） was 2.03 μmol/L when the BLECs were treated with MG132 for 36 h. MG132 also induced the apop- tosis of BLECs obviously. FCM showed that the apoptosis index of the cells treated by MG132 at 2 μmol/L for 12 h was （20.24±1.51）%, and that of the control was （0.98±0.20）% respectively （P〈0.01, n=3）. It was concluded that MG132 could lead to apoptosis of BLECs. The decrease of proteasome activity may play an important role in the formation and development of cataract.     

Expression of P53 during lens epithelial cell apoptosis induced by ultraviolet

Cataract is a disease induced by multi- factorsand its pathologic mechanism isstill unknown.Ithasbeen accepted that ultraviolet irradiation ( UVR) isone of the most important pathogenesis.Li etal hasreported that UVR could induce the apoptosis of lensepithelial cells( LECs) and resulted in lens opacities.In order to study the pathologic mechanism of UVR-induced cataract at molecular and cellular levels,weinvestigated the apoptosisof LECs and the expressionof P5 3.1　 MATERIALSAND M…     

Effects of rapamycin on expression of Bcl-2 and Bax in human lens epithelial cells and cell cycle in rats

The effects of rapamycin on the expression of Bcl-2 and Bax protein in in vitro cultured human lens epithelial cells(LECs) and cell cycle were investigated in order to provide the theoretical basis for the development of new inhibitory drugs for clinical prevention and treatment of after-cataract.The cultured LECs of second and third passages were collected and treated with rapamycin.The LECs were transferred into 96-well culture plates and divided into 6 groups,and each group was set to have 8 duplicate wells.In the negative control group,the LECs were given culture medium only,and in the blank control group,only culture medium was given.In the four rapamycin-treated groups,different concentrations(20,40,60 and 80 ng/mL) of rapamycin were given.After treatment for 24,48 and 72 h,the absorbance(A) values in each well were determined by MTT assay.The cell cycles of all groups were detected by using flow cytometry.Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(RFQ-PCR) and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax respectively.MTT assay showed that rapamycin could inhibit proliferation of LECs in a time-and dose-dependent manner.Flow cytometry revealed that rapamycin could block the conversion of LECs from G1 phase to S phase,resulting in the increase of cells in G1 phase and the decrease of the cells in S phase.RFQ-PCR indicated that rapamycin could down-regulate the expression of Bcl-2 mRNA,but up-regulate the expression of Bax mRNA,suggesting it could induce apoptosis of LECs.Western blot demonstrated that rapamycin could suppress the expression of Bcl-2 protein,but promote the expression of Bax protein.It is concluded that rapamycin could inhibit proliferation of LECs probably not only by blocking the progression of cell cycle,but also by promoting the induction of apoptosis.     

Caspase-3及Bax在人晶状体上皮细胞中的表达

目的 :观察Caspase 3及Bax在人晶状体上皮细胞中的表达 .方法 :收集 30只白内障晶状体前囊膜以及胚胎晶状体 (6只 )和成人透明晶状体 (4只 )的前囊膜 ,采用免疫组织化学的方法观察Caspase 3及Bax的表达情况及染色强度 .结果 :Caspase 3及Bax在各型白内障中均有很好的表达 ,在年龄相关性白内障中Caspase 3及Bax的表达为 11/ 12 ,10 / 12 ,在高度近视性白内障中Caspase 3及Bax的表达为 7/ 8,6 / 8,在外伤性白内障中Caspase 3及Bax的表达为 5 / 6 ,5 / 6 ,在并发性白内障中Caspase 3及Bax的表达为 3/ 4 ,4 / 4 ;在各型白内障中Caspase 3及Bax的表达没有显著性差异 (P >0 .0 5 ) .结论 :在白内障的发生中存在晶体上皮细胞的凋亡     

胰岛素样生长因子-1对人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法对永生化人晶状体上皮细胞系B-3(HLEB-3)进行培养及传代,应用不同浓度的IGF-1(5、10、20、30、40、50、60μg.L-1)作用于HLEB-3细胞,在不同时间点采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测IGF-1对HLEB-3细胞增殖的影响。采用蛋白质印迹(West-ern blotting)方法检测晶状体上皮α-肌动蛋白(α-actin)的表达。结果 IGF-1在5μg.L-1时就对HLEB-3细胞有明显的促增殖作用(P<0.05),且随着IGF-1浓度的升高,促增殖作用增加,即促增殖效应具有浓度依赖性;同时也可上调α-actin蛋白的表达,与对照组比较,各浓度组IGF-1均可显著促进α-actin蛋白表达上调(P<0.01),且随着IGF-1浓度的增加,α-actin蛋白含量逐渐升高。结论 IGF-1具有促进人晶状体上皮细胞增殖的作用,其作用强度呈浓度依赖性。     

核因子E2相关因子2在晶状体上皮细胞抗氧化损伤中的作用*

目的 探讨核因子E2相关因子2（Nrf2）在晶状体上皮细胞抗过氧化氢（H2O2）氧化损伤和凋亡中的作用。方法 通过MTT测定不同浓度H2O2对人晶状体上皮细胞（HLECs）活力的影响;流式细胞术检测正常对照组（不加H2O2）,不同浓度H2O2处理组（100、200及300?μmol/L）和Nrf2抑制组（GSK-3β+H2O2 300?μmol/L）活性氧（ROS）及超氧化物酶歧化酶（SOD）的含量;Western blotting检测凋亡相关蛋白剪切型Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）、Bax、Bcl-2、Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白及Nrf2浆蛋白的表达;免疫荧光法检查Nrf2在晶状体上皮细胞的表达和定位。结果 当H2O2浓度为400?μmol/L时,晶状体上皮细胞不可逆死亡。细胞经H2O2处理48?h后,各组ROS的表达量比较,差异有统计学意义（P?<0.05）,与正常对照组比较,各处理组ROS含量升高（P?<0.05）,Nrf2抑制组与H2O2高浓度组比较,差异无统计学意义（P?>0.05）。处理48 h后,各组SOD的含量比较,差异有统计学意义（P?<0.05）;与正常对照组比较,各处理组的SOD含量降低（P?<0.05）,与H2O2高浓度组比较,Nrf2抑制组SOD含量下降（P?<0.05）。处理48?h后,各组Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2表达的比较,差异有统计学意义（P?<0.05）,与正常对照组比较,H2O2各个浓度组Caspase-3、Bax降低（P?<0.05）,Bcl-2升高（P?<0.05）,与H2O2高浓度组比较,Nrf2抑制组的Cleaved-Caspase-3、Bax升高（P?<0.05）,而Bcl-2降低（P?<0.05）;H2O2各浓度组中Nrf2相对表达相应增多且有核内转移的趋势,Nrf2抑制组无Nrf2表达。结论 Nrf2在人晶状体上皮细胞中的表达及核易位能增加抗氧化酶和抗凋亡蛋白的含量,降低促凋亡蛋白含量,从而起到自身抗氧化损伤和抗凋亡的作用。     

同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用

目的 建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础.方法 将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴定,研究iTRAQ在HK-2细胞的标记情况和蛋白质组学.结果 通过质谱检测,检测到带有iTRAQ标记肽段.随机选取20个前体离子,通过3次重复试验,鉴定出iTRAQ标记多肽肽段分别为17、15和18个,标记效率在75.5% ～90.0%,且组间标记效率差异无统计学意义(P>0.05).结论 iTRAQ可以在HK-2细胞中标记效果满意,且重复性较好,为进一步研究肾脏疾病的蛋白质组学奠定了基础.     

风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的初步研究

目的观察风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法利用相差显微镜、透射电子显微镜、免疫细胞化学技术观察风疹病毒R16株在人胚晶状体上皮细胞中的形态学及生长特性。结果风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞后,细胞不产生明显的病变效应。受病毒感染的人胚晶状体上皮细胞生长速度较慢,10d后可在细胞质内观察到呈不规则球形、由单层脂质膜包绕、直径60～80nm的病毒颗粒,包括致密核心和无致密核心两种颗粒。而在胞核中未发现病毒颗粒。结论风疹病毒R16株能在人胚晶状体上皮细胞中增殖,为进一步研究风疹病毒感染后先天性白内障的发生机制打下基础。     

白藜芦醇对过氧化氢诱导鼠晶状体上皮细胞凋亡保护作用的实验研究

目的 探讨白藜芦醇对过氧化氢(H2O2)诱导鼠晶状体上皮细胞凋亡损伤的保护作用.方法 取健康SD大鼠透明晶状体60只,随机分为5组,每组12只,分别给予高、中、低剂量(5、10、20μmol/L)的白藜芦醇和100 μmol/L H2O2,利用透射电镜观察超微结构变化并测定凋亡因子caspase-3及caspase-9的表达.结果 伴随白藜芦醇给药浓度的增加,透射电镜下鼠晶状体上皮细胞损伤的程度减轻,此外,白藜芦醇对caspase-3及caspase-9的表达具有抑制作用.结论 白藜芦醇可以抑制H2O2诱导的晶状体上皮细胞的凋亡,对氧化损伤性白内障具有预防作用,为寻求有效防治白内障药物提供了可靠的实验依据.     

反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的晶体上皮细胞生长的抑制作用

目的探讨反义c-myc寡核苷酸(ASODN)对半乳糖诱导的兔晶体上皮细胞(LEC)生长的影响.方法人工合成与c-myc基因第二外显子翻译起始区序列互补的寡核苷酸,用半乳糖和反义寡核苷酸处理培养的晶体上皮细胞,应用细胞计数法和MTT法观察反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的晶体上皮细胞增殖的影响.结果 2.5～10.0 μmol/L反义c-myc寡核苷酸能抑制半乳糖诱导的晶体上皮细胞的增殖,10.0 μmol/L时作用较显著.结论反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的白内障晶体上皮细胞的生长增殖有抑制作用.