超声微泡介导转染FKBP12.6基因对小鼠H9c2(2-1)心肌细胞中Ca2+浓度的影响

目的:探讨超声微泡介导转染FKBP12.6基因后,对小鼠H9c2(2-1)心肌细胞中Ca2 浓度的影响。方法:将pcDNA3.1-FKBP12.6质粒与白蛋白包裹微泡造影剂混合,经超声转染H9c2(2-1)细胞后,通过倒置显微镜观察心肌细胞生长状况的变化;激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2 浓度的变化;免疫组织化学方法检测FKBP12.6蛋白的表达。结果:超声触发微泡破裂转染的FKBP12.6基因可在心肌细胞高效表达,细胞生长良好。高表达FKBP12.6的心肌细胞中,总的钙离子浓度增加。结论:超声微泡介导FKBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显增加心肌细胞中的Ca2 浓度,心肌细胞的收缩能力增强。     

脂肪分化相关蛋白真核表达载体的构建及其对H9c2心肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建编码脂肪分化相关蛋白（adipose differentiation-related protein, ADRP）基因全长序列的真核表达载体,探讨ADRP过表达对软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡有何影响。方法：(1) RT-PCR扩增编码ADRP全长的DNA 序列,重组入pEGFP-C1质粒表达载体中,酶切、测序鉴定后转化大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,扩增后提取质粒并进行鉴定;采用脂质体转染法将鉴定后的重组质粒稳定转染H9c2心肌细胞;荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况;RT-qPCR和Western blotting检测ADRP表达情况;(2) 采用MTT比色法和流式细胞术检测不同浓度软脂酸对细胞增殖和凋亡的影响。结果：(1) 成功构建了真核质粒表达载体pEGFP-C1-ADRP,转染H9c2细胞后,荧光显微镜下观察发现细胞内有绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR和Western blotting显示重组质粒转染H9c2细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平明显高于空质粒转染组和正常对照组（P<0.01）;(2) 经不同软脂酸刺激后,重组质粒转染H9c2细胞增殖抑制率和凋亡率均明显低于空质粒转染组和正常对照组（P<0.05）。结论：(1) 成功获得了稳定表达ADRP的H9c2心肌细胞株;(2) 软脂酸可抑制H9c2心肌细胞增殖并可诱导其凋亡,而ADRP高表达可对抗软脂酸的这一作用,表明ADRP对高脂环境中心肌细胞可能具有一定的保护作用。     

脂肪分化相关蛋白对软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响

目的:构建编码脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因全长序列的真核表达载体,探讨ADRP过表达对软脂酸诱导的H9 c2心肌细胞凋亡有何影响。方法:(1)采用PCR的方法,以成年SD大鼠心肌cDNA为模板扩增编码ADRP全长的DNA序列,重组入pEGFP-C1质粒表达载体中,酶切、测序鉴定后转化大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,扩增后提取质粒,进行酶切和测序鉴定;(2)采用脂质体转染法将鉴定后的重组质粒转染H9 c2心肌细胞株,经G418筛选获得抗性细胞克隆后扩大培养;荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白报告基因表达情况;RT-qPCR和Western blot检测转染细胞与正常细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平;(3)采用流式细胞术检测不同浓度软脂酸对上述细胞细胞凋亡率的影响。结果:(1)酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入表达质粒pEGFP-C1;(2)荧光显微镜观察细胞内有绿色荧光蛋白表达且传20代以上无消失;RT-qPCR和Western blot证明重组质粒转染H9 c2细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平明显高于空质粒转染组和正常对照组(P<0.01);(3)经不同软脂酸刺激后,重组质粒转染H9 ...     

超声靶向微泡破碎介导EGFP基因转染肝癌细胞的影响因素研究

观察超声靶向微泡破碎(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)在不同转染条件和细胞状态下对肝癌细胞HepG2转染率及细胞活性的影响.体外培养HepG2细胞,随机分为4组:质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和超声+微泡+质粒组,各组再分为贴壁和悬浮状态2组.悬浮状态的超声+微泡+质粒组根据质粒和微泡浓度不同分为微泡浓度组和质粒浓度组,转染24h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪测定细胞转染率,MTT法检测细胞活性.结果 在超声声强2w/cm2、占空比20％、照射时间60s的超声参数作用下,质粒5μg/ml、微泡:细胞20∶1时,悬浮状态细胞转染率为7.33％±0.98％,存活率为90.37％±1.80％贴壁状态细胞转染率为1.56％±0.81％,存活率为81.10±1.26％,两者比较有显著差异(P＜0.01).悬浮状态下,提高质粒和微泡浓度至质粒10 μg/ml、微泡:细胞40∶1时转染效率增至15.63％±1.81％,且细胞生存率＞80％.结论 相同转染条件下悬浮状态细胞转染率及存活率明显优于贴壁状态.优化质粒、微泡浓度可进一步提高超声微泡介导的基因转染效率和存活率.     

超声微泡介导转染FK12.6结合蛋白基因对心力衰竭犬心功能的影响

目的： 探讨白蛋白微泡介导的外源性pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染对心衰犬的治疗作用。方法: 以白蛋白微泡为载体，在超声破坏下将人工合成的pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染入快速起搏心衰犬心肌中。分别在转染后第4、14 d，通过超声和有创血流动力学检查测定左室内径和心功能，同时检测血浆心钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP），评价FK12.6结合蛋白（FKBP12.6）基因对心衰的治疗效果。应用RT-PCR检测各组FKBP12.6基因的表达情况。结果: 超声微泡介导的转染可以提高心肌FKBP12.6 mRNA的表达。射血分数（EF）、缩短分数（FS）、血流动力学指标及血浆ANP、BNP在第4 d可见明显好转，并在14 d时保持稳定，但EF、FS和心输出量（CO）一直低于正常水平。在第4 d时LVEDD无变化，而左室舒张末期容积（LVEDV）下降（P<0.05），在14 d时2指标与对照组比较均缩小（P<0.05，P<0.01）。结论: 通过超声微泡介导转染FKBP12.6基因可以改善心脏功能，是心衰基因治疗的新手段。     

TRPM7干扰载体修复低氧/复氧致大鼠心肌细胞系H9C2损伤

目的研究瞬时受体电位通道7(TRPM7)干扰载体对低氧大鼠心肌细胞系(H9C2)修复功能的影响及其机理。方法建立H9C2心肌细胞低氧/复氧模型,构建TRPM7干扰表达载体转染H9C2细胞,用RT-qPCR与Western blot检测H9C2细胞低氧诱导因子(HIF1-α)和TRPM7的表达,流式细胞计量术检测胞内钙离子水平([Ca^2+]i)和细胞凋亡,确定TRPM7对H9C2心肌细胞的修复作用。结果H9C2细胞转染TRPM7干扰载体后,细胞的HIF1-α和TRPM7表达显著下降(P<0.05),[Ca^2+]i降低及凋亡率减少(P<0.05)。结论TRPM7干扰载体可能通过PI3K/Akt通路对低氧H9C2心肌细胞有显著的修复作用。     

新型载基因微泡的制备及其在心肌细胞报告基因转染中的应用

为了提高基因黏附微泡的稳定性和基因携带容量，采用改良超声声振法将质粒-多聚乙酰亚胺（PEI）复合物整合至微泡包膜上而制备出新型载基因微泡。电泳分析及细菌转化实验表明PEI能降低超声声振对质粒结构及功能的破坏。新型载基因微泡具有良好的声学及血液流变学性能，其基因携带量明显高于基因黏附微泡。分别采用超声破裂新型载基因微泡及基因黏附微泡介导心肌细胞β-半乳糖酶基因转染。结果表明，超声破裂载基因微泡能增强裸质粒转染效率达107倍．其基因表达水平为超声破裂基因黏附微泡组的6．85倍。提示经改良法制备的新型载基因微泡是一种安全高效的基因转运载体，超声破裂载基因微泡能明显增强心肌细胞的基因转染效率。     

超声微泡介导pEGFP-N1转染大鼠牙囊细胞:细胞生物学性质相对稳定

背景:利用超声波和微泡对比剂相互作用,产生空化效应和机械效应,破坏细胞膜的完整性,产生暂时性、可逆性的小孔,增加细胞膜的通透性,增强微泡载体对基因的转移,提高基因转染率。目的:探讨在超声波辐照下微泡对比剂介导p EGFP-N1质粒转染SD大鼠乳鼠牙囊细胞的效率及安全性。方法:体外原代培养新生SD大鼠牙囊细胞并传至第4代,在不同条件下采用p EGFP-N1质粒转染乳鼠牙囊细胞。以不同的超声辐照时间(15,30,45,60 s)和辐照强度(0.5,1 W/cm2)两两组合进行辐照,筛选较高转染效率的参数组合并应用于后续实验。实验分组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组和脂质体+质粒组。转染48 h后倒置荧光显微镜观察p EGFP表达,MTT法检测转染后的乳鼠牙囊细胞增殖抑制率。结果与结论:超声强度为0.5 W/cm2且辐照时间为30 s时转染率明显高于其他超声参数组合。该条件下超声微泡介导p EGFP-N1质粒对乳鼠牙囊细胞的转染率高于传统脂质体介导的转染率,且对细胞活力无明显影响。提示超声微泡能安全、高效介导p EGFP-N1质粒转染大鼠牙囊细胞,其细胞生物学性质相对稳定,可为牙周组织工程提供一种较理想的基因转染方法。     

超声微泡联合脂质体介导双自杀基因杀伤 MCF-7 细胞的实验研究简

目的探讨超声辐照微泡联合脂质体介导双自杀基因（CD/TK）对MCF-7细胞的体外杀伤作用。方法将培养的MCF-7细胞分为5组：裸质粒组、脂质体组、超声辐照微泡组、超声辐照脂质体组、超声辐照微泡联合脂质体组。转染DEGFP-KDRp-CD／TK质粒于MCF-7细胞.用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率。转染后,再分为空白对照组、未转染组、转染组;未转染组和转染组又各分为3个亚组,给予前药丙氧鸟苷（GCV）、5-氟胞嘧啶（5-Fc）、GCV＋5-Fc。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测双自杀基因对MCF-7细胞的体外杀伤作用。结果超声辐照微泡联合脂质体组绿色荧光蛋白（GFP）表达最多、最强。超声辐照微泡联合脂质体组转染率（39.59％±1.19％）最高（P〈0.05）。MTr检测细胞抑制率结果显示,转染组细胞抑制率明显高于未转染组（P〈0.01）,转染组中联合用药组细胞抑制率明显高于单一用药组（90.77％±2.68％vs64.75％±2.27％、67.81％±2.43％：P〈0.05）。转染组各前药组细胞抑制率均显著高于超声辐照微泡联合脂质体对MCF-7细胞的转染率（P〈0.05）。结论超声辐照微泡联合脂质体能明显提高基因转染效率,是较理想的乳腺癌基因治疗策略。     

超声微泡介导Itch基因沉默增强T细胞对肺腺癌细胞LA795免疫杀伤作用

目的利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率。方法磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,Western blot检测Itch蛋白表达。转染72 h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-2和IFN-γ分泌水平,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠肺腺癌细胞LA795共培养时肿瘤杀伤率。结果利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3%±3.8%,Itch蛋白表达能够有效被抑制。转染72 h后,超声微泡介导沉默Itch基因显著增加T细胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平(P0.05);与空白组或阴性对照组T细胞相比,在不同的靶效比水平(10∶1、20∶1、40∶1),转染T细胞杀瘤活性均明显增高(P0.05)。结论利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Itch基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率。     

柯萨奇病毒B3调控CAPN总体活性促进H9c2细胞凋亡的机制

目的 探讨柯萨奇病毒B3(CVB3)调控进H9c2细胞凋亡的潜在机制.方法 CVB3感染大鼠心肌细胞H9c2后,通过Annexin-PI染色和流式细胞仪检测H9c2的凋亡水平.抽取感染CVB3和未感染的H9c2细胞的总RNA后进行高通量测序.使用siRNA敲低测序结果中差异较大的基因,并检测H9c2细胞的凋亡水平.结果 CVB3感染大鼠心肌细胞H9c2后,细胞的凋亡水平上升(P＜0.05).高通量测序发现感染CVB3和未感染的H9c2细胞表达差异大于5倍的基因有40个.siRNA敲低这些基因后,发现当敲低CAPN1、CAPN2、CAPN3、CAPN10时,H9c2细胞凋亡水平下降(P＜0.05).感染CVB3后,H9c2细胞中CAPN 1、CAPN2、CAPN3、CAPN10的蛋白水平上升.感染CVB3后12h、24 h、48hH9c2细胞中总体Calpain活性上升(P＜0.05).感染CVB3的同时使用Calpain抑制剂Z-LLY-FMK处理,Calpain总体活性和H9c2细胞凋亡水平无显著变化(P＞0.05).结论 CVB3通过上调CAPN1、CAPN2、CAPN3、CAPN10的表达水平提高了Calpain的总体活性来诱导大鼠心肌细胞H9c2凋亡.     

AMPKα2基因shRNA重组质粒的构建以及在氯离子介导的大鼠心肌缺氧/复氧损伤中的作用

 目的：构建AMP活化的蛋白激酶α2亚基(AMPKα2)基因shRNA重组表达质粒,转染H9c2心肌细胞,探讨其在氯离子(Cl^-)介导的心肌细胞缺氧/复氧（A/R）损伤中的作用。方法：构建靶向AMPKα2基因的shRNA重组质粒pSuper-AMPKα2 shRNA,转染H9c2细胞;Western blotting法测定AMPKα2的蛋白表达情况。实验分5组,每组重复6次：(1) Control组;(2) A/R组;(3) Cl^--free A/R组;(4) pSuper+Cl^--free A/R组;(5) pSuper-AMPKα2 shRNA+ Cl^--free A/R组。处理结束后,生化自动分析仪测定LDH活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧（ROS）水平,试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果：重组表达质粒pSuper-AMPKα2 shRNA经测序证明构建正确;转染心肌细胞后,AMPKα2蛋白表达明显下降;Cl^--free A/R组较之A/R组细胞存活率升高,LDH含量下降,细胞凋亡减少,ROS生成减少,SOD和GSH-Px活性增加;转染pSuper-AMPKα2 shRNA质粒后,阻断了Cl--free液的保护作用,且ROS生成增加,SOD和GSH-Px活性也下降。结论：成功构建pSuper-AMPKα2 shRNA重组质粒。AMPKα2基因沉默阻断了Cl^--free液对心肌细胞A/R损伤的保护作用。     

9型腺相关病毒介导RNA干扰抑制p65基因表达对血管紧张素Ⅱ诱导H9c2细胞凋亡的影响

目的:以9型腺相关病毒(AAV9)介导的RNA干扰抑制大鼠心室肌H9c2细胞中p65基因表达,研究其在血管紧张素II(Ang II)诱导下对H9c2细胞凋亡的影响,并阐明其可能机制。方法:分别将r AAV9-eGFP及r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA按转染复数(MOI)=4×106vg/cell转染至H9c2细胞,在荧光倒置显微镜下观察e GFP的阳性表达情况,采用流式细胞术检测其转染效率,并用Western blot法分析p65的表达情况。CCK-8法检测病毒对H9c2细胞活力的影响。流式细胞术分析各组细胞的凋亡情况。结果:病毒转染48 h后e GFP开始有表达,并且表达强度随着时间延长而增加,第5天达最高值,此时流式细胞术检测转染率为(52. 7±1. 9)%。与空白组相比,转染病毒后H9c2细胞的活力无明显变化。静息状态下H9c2细胞的NF-κB p65有一定活性,给予Ang II刺激后NF-κB p65的活性明显增高,而转染r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制NF-κB p65的活性。流式细胞术检测发现Ang II刺激组的凋亡程度明显高于空白组,而r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA组的细胞凋亡明显受到抑制。结论:通过r AAV9介导的RNA干扰能有效抑制H9c2细胞NF-κB p65基因的表达;抑制p65基因表达对H9c2细胞活力无明显抑制,但能减少Ang II诱导下的细胞凋亡。     

转录因子ZFP580在缺氧预处理抗大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

 目的：通过观察缺氧预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及锌指核转录因子ZFP580表达的改变,探讨ZFP580的作用及机制。方法：培养大鼠H9c2心肌细胞,分为3组：（1） 缺氧/复氧(H/R)组：H9c2心肌细胞换用模拟缺血溶液(pH=6.2)缺氧(95% N2 + 5% CO2)培养3 h,复氧培养2 h;（2） 缺氧预适应(HPC)组：H9c2心肌细胞经3个循环的短暂缺氧(10 min)/复氧(20 min)处理后,进行同上H/R实验;(3) 对照(C)组：正常培养的H9c2心肌细胞。通过MTT染色及LDH水平判定HPC的作用。Western blotting方法观察心肌细胞中转录因子ZFP580表达及ERK1/2磷酸化情况,以及ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059对ZFP580表达的影响。分别构建高/低表达ZFP580的慢病毒载体并转染H9c2心肌细胞,经H/R实验后利用Annexin V-PE/7-AAD染色及流式细胞术检测H9c2细胞凋亡情况,Western bloting方法观察caspase-3活化情况。结果：HPC能显著改善H/R处理后H9c2心肌细胞存活率降低和LDH漏出的现象。Western blotting结果显示,HPC组心肌细胞中ZFP580表达及ERK1/2磷酸化程度较H/R处理组明显上升,且PD98059预处理明显抑制HPC诱导的ZFP580的表达上调。慢病毒介导的基因转染实验发现,ZFP580高表达的H9c2心肌细胞在H/R损伤后凋亡率降低且细胞中活化caspase-3表达下降。结论：HPC可引起心肌细胞中转录因子ZFP580表达上调,ZFP580作为ERK1/2通路的下游靶分子发挥抗心肌细胞凋亡的作用。ZFP580表达上调可能作为内源性保护机制之一介导了HPC的细胞保护作用。     

NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用

目的：探讨NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用。方法：用RT-PCR获取NDRG2基因。测序判断正确后，将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2-EGFP中，并转染NDRG2表达阴性的HepG2细胞。用光镜观察转染细胞的形态变化；荧光显微镜观察NDRG2蛋白的定位；流式细胞仪分析细胞周期的改变；透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变。结果：获得了NDRG2基因，成功地构建了pIRES2-EGFP-NDRG2真核表达载体。转染HepG2细胞后，细胞生长受抑，结构破坏并死亡。荧光显微镜观察到NDRG2在胞质中表达，流式细胞仪检测出现G1期阻滞和凋亡峰，透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征。结论：NDRG2基因具有诱导HepG2细胞凋亡的作用，其机制有待进一步研究。     

DDAH2抑制低氧诱导大鼠心肌细胞H9c2(2-1)凋亡

 目的 探讨过表达二甲基精氨酸二甲胺水解酶-Ⅱ（DDAH2）对低氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用和是否通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活化来保护心肌细胞。方法 低氧诱导大鼠心肌细胞H9c2(2-1)36h从而诱导凋亡,同时转染DDAH2真核细胞表达质粒,用WST-1细胞毒试验和流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测eNOS磷酸化。结果 低氧组心肌细胞存活率显著性降低;过表达DDAH2基因使低氧下心肌细胞存活率明显地上升。DDAH2过表达组心肌细胞凋亡率为17.38%±1.52%,显著性低于低氧组（27.34%±1.33%）（P<0.05）。转染DDAH2基因可以显著上调低氧组心肌细胞的eNOS磷酸化水平;过表达DDAH2基因的低氧组用eNOS抑制剂L-NAME干预后,凋亡水平明显上升。结论 过表达DDAH2基因上调eNOS磷酸化抑制低氧所致的大鼠心肌细胞H9c2（2-1）凋亡。     

超声破坏微泡法介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染兔股骨头组织的安全性及可行性

背景：超声微泡转染系统已尝试于体内多部位的基因转染,但尚未见有用于骨部位基因转染的报告。 目的：观察超声破坏微泡法介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染兔股骨头组织的效率及可行性。 方法：将日本大耳白兔按随机均分为裸转染组,预照射+裸转染组,超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组。其中前2组不给予超声定向转染照射,后3组利用超声微泡破裂法介导增强型绿色荧光蛋白质粒,定向基因转染兔股骨头。各组转染1周后,于荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白在股骨头组织中的表达情况。 结果与结论：超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组均有增强型绿色荧光蛋白表达,且复定位转染组增强型绿色荧光蛋白质粒在兔股骨头内的转染效率明显高于其他组(P < 0.01)。超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组兔超声照射部位软组织和骨组织切片未观察到明显损伤病灶。结果证实,超声微泡破裂法能安全、有效实现增强型绿色荧光蛋白质粒在兔股骨头组织的转染。     

过表达连接子蛋白40(Cx40)通过引起细胞周期阻滞抑制H9c2大鼠心肌细胞增殖

目的 建立过表达连接子蛋白40(Cx40)的H9c2心肌细胞稳定株，初步探讨慢病毒载体介导的Cx40蛋白过表达对H9c2细胞增殖的影响及其相关机制。方法 采用实时定量PCR从H9c2细胞株扩增Cx40基因片段，与慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro连接，获得重组pLVX-Flag-Cx40表达载体。通过与包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞，获得携带Flag-Cx40的重组慢病毒颗粒。感染的H9c2细胞经嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定表达株(H9c2-Flag-Cx40细胞)。采用Western blot法检测Cx40蛋白表达情况；通过CCK-8法检测Cx40对H9c2细胞增殖的影响；流式细胞术检测细胞周期的变化；实时定量PCR检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的mRNA表达；Western blot法检测cyclin D1蛋白表达；免疫共沉淀(Co-IP)实验检测H9c2细胞Cx40和Yes相关蛋白(YAP)的相互结合情况；分离胞质、胞核蛋白，利用Western blot法检测Cx40对YAP细胞定位的影响。结果 测序结果显示成功构建重组pLVX-Flag-...     

小鼠Tim-2基因在L929细胞表达后促进铁蛋白的内吞

目的获取BALB／c小鼠T细胞免疫球蛋白域．黏蛋白域蛋白-2（T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecules-2，Tim-2）基因，构建真核表达载体在L929细胞中表达并研究其功能。方法RT-PCR获取BALB／c小鼠Tim-2基因，T-A克隆后经测序鉴定后酶切，插入pEGFP-N1真核表达载体，脂质体转染L929细胞，荧光显微镜观察外源基因的表达，然后加入铁蛋白与转染细胞作用。结果外源基因在L929细胞中得到高效表达，荧光显微镜的结果显示，外源基因定位于细胞膜上，并能促进细胞对铁蛋白的内吞。结论Tim-2基因在真核细胞中表达后定位于细胞膜上，并促进细胞对铁蛋白的内吞。     

Wnt3a联合BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化

目的探讨Wnt3a单独以及联合骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化的作用。方法利用HEK293细胞扩增重组腺病毒AdGFP、AdBMP9、AdWnt3a;分别转染C3H10T1/2细胞3周后,倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达;流式细胞术检测细胞转染效率;Westernblot法、免疫荧光技术及实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测缝隙连接蛋白43(Cx43)、肌钙蛋白T(cTnT)、GATA结合蛋白4(GATA4)、心肌细胞增强因子2C(MEF2C)的表达。结果经HEK293细胞扩增可得到高滴度的重组腺病毒;转染C3H10T1/2细胞3周后,Wnt3a组Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C的表达量与空白组比较无明显差异;Wnt3a联合BMP9组的Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C基因的表达量显著高于空白组、GFP组和Wnt3a组,与单独BMP9组相比无显著性差异。结论Wnt3a不能单独诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化;Wnt3a联合BMP9可诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化。