NF-κB信号通路介导AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9

目的： 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导人单核/巨噬细胞（THP-1细胞）基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的机制。方法: 用0.1 μmol/L佛波酯（PMA）作用48 h,诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞后,随机分为4组：（1）PMA组,即对照组;（2）PMA+AngⅡ组（10-7mol/L,1 h）;（3）PMA+AngⅡ+2-硫代氨基甲酸吡咯烷组［PDTC（10 μmol/L,30 min）］;（4）PDTC组。用Western blotting蛋白印记技术分别检测总蛋白MMP-9及磷酸化核转录因子-κB p65（NF-κB p65）的变化,用RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达的变化。结果: 与对照组相比,AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞磷酸化NF-κB p65增加（1.02±0.10,P<0.05）,MMP-9蛋白量也增加（1.06 ±0.11,P<0.05）,MMP-9 mRNA表达上调（1.22±0.08,P<0.05）,而使用NF-κB的抑制剂PDTC后磷酸化NF-κB p65（0.99±0.12,P<0.01）减少,MMP-9表达明显受到抑制（1.04±0.14, P<0.01）,MMP-9 mRNA表达下调（0.90±0.06, P<0.01）。结论: NF-κB信号转导途径是AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9的重要途径之一。     

NF-κB在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:使用一定剂量的抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物处理THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性;Western blot检测细胞NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达情况;进一步采用NF-κB抑制剂(PDTC)观察是否能干预抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应,并利用上游信号分子MAPKs的抑制剂观察抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对NF-κB p65磷酸化的影响。结果:抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)能够诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);能够增强细胞内NF-κB p65磷酸化(P<0.05 vs media),降低IκB-α水平(P<0.05 vs media);NF-κB抑制剂PDTC(20μmol/L)能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞表达TF及NF-κB磷酸化的效应;MAPKs抑制剂均能影响抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞NF-κB p65磷酸化。结论:在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,NF-κB被激活并发挥重要作用,MAPKs为NF-κB的关键上游分子。     

NF-κB抑制剂PDTC抗白血病细胞增殖的实验研究

目的： 观察核转录因子NF-κB活性特异性抑制剂PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)对急性白血病细胞系K562细胞增殖的影响,并探讨其机制。方法: 利用Trans AMTM NF-κB/p65活性测定试剂盒,检测PDTC作用K562细胞12 h、24 h后NF-κB亚基p65活性的变化;采用WST-1细胞增殖试验观察不同浓度PDTC作用24 h、48 h、72 h对细胞增殖的影响;用单细胞凝胶电泳(彗星检测)方法检测PDTC对K562细胞DNA损伤的影响;利用免疫印迹法(Western blotting)检测PDTC对K562细胞中pro-caspase-3和活化型caspase-3蛋白表达的影响。结果: 与对照组相比,经PDTC处理的实验组K562细胞NF-κB/P65的活性受到明显抑制(P＜0.01);且PDTC能以时间和剂量依赖方式抑制K562细胞的增殖(P＜0.05);单细胞凝胶电泳显示实验组细胞DNA受损,浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/LPDTC处理后,实验组细胞DNA总损伤细胞百分率分别为43.50％、84.00％、95.63％,明显高于对照组(9.75％),P＜0.05,且存在明显的剂量依赖关系;Western blotting结果显示经PDTC处理后的K562细胞胞质中可检测到pro-caspase-3和活化型caspase-3蛋白的表达。结论: NF-κB参与白血病细胞的增殖与凋亡调控,PDTC抗肿瘤机制可能与抑制NF-κB活性,上调caspase-3表达,从而诱导细胞凋亡有关。     

PDTC对PV-杀白细胞素(PVL)诱导THP-1巨噬细胞NF-κB活化及炎性因子表达的影响

目的 探讨二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对PV-杀白细胞素(panton-valentine Ieucocidin,PVL)诱导THP-1巨噬细胞NF-κB及炎性因子表达的影响.方法 实验分3组,PBS对照组、rPVL刺激组和PDTC处理组,在加入rPVL刺激前60 min,给予100 μmol/L PDTC预处理THP-1巨噬细胞.采用免疫组化检测NF-κB的移位,Western blot检测细胞胞质IκB蛋白和胞核NF-κB蛋白表达,ELISA法检测细胞上清IL-8和IL-6蛋白的表达,RT-PCR法检测IL-8和IL-6 mRNA水平表达.结果 PDTC处理组NF-κB阳性细胞明显减少,核蛋白表达降低,胞质IκB蛋白降解减少;IL-8和IL-6mRNA表达明显下调,蛋白分泌量分别由12.96 ng/ml和6.55 ng/ml降低到6.78 ng/ml和3.88ng/ml,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PDTC可能通过抑制NF-κB的活性,从而降低II-8和IL-6的表达,对PVL引起的炎性损伤具有一定的保护作用.     

醛肽类蛋白酶体抑制剂对LPS诱导小鼠巨噬细胞炎症介质表达的影响

目的： 探讨醛肽类蛋白酶体抑制剂MG132对脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7 核转录因子-κB（NF-κB)活化、炎性因子一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法： 利用报告基因检测法分析转染细胞（pNiFty-SEAP/HEK293）中NF-κB的活性;采用DAF-2DA荧光探针法检测Raw264.7细胞内NO的产生;蛋白免疫印迹法探讨细胞中iNOS和IκB-α蛋白表达情况;酶联免疫吸附法测定Raw264.7细胞上清中TNF-α的含量。结果： 预先加入MG132能够显著抑制LPS诱导的TNF-α分泌,其抑制率由5 μmol/L时的36.7%升高到10 μmol/L时的60.4%。反映NO含量的荧光强度值随着MG132给药浓度的增加而降低,其抑制率从2 μmol/L时的29.5%达到10 μmol/L的55.9%。预刺激后MG132可使胞浆中iNOS蛋白表达减少,IκB-α蛋白却明显增加,NF-κB的活性随着给药浓度的升高而不断降低。结论: MG132能够抑制LPS诱导的TNF-α和NO的产生,减少iNOS表达,具有抗炎作用。其作用机制可能与IκB降解受阻,导致NF-κB活性降低有关。     

核因子-κB 激活与一氧化氮合酶 mRNA 表达在重症急性胰腺炎肺损伤中的作用

目的:探讨重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺组织核因子-κB(NF-κB)活化及诱导型一氧化氮合酶 mRNA 表达与肺损伤的关系.方法:SD 大鼠随机分为对照组、SAP 组、二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预处理组.建立各组模型后取肺组织行病理学观察,免疫组织化学法观察 NF-κB 的表达,实时荧光定量 PCR 法检测 iNOS mRNA 表达.结果:对照组仅极少量NF-κB 活化,iNOS mRNA 呈低水平表达.SAP 组NF-κB 出表达明显增加,并呈动态变化,6 h达高峰,主要表达于中性粒细胞、单核/巨噬细胞、支气管黏膜七皮细胞、肺泡上皮细胞的胞质和胞核内,iNOS mRNA 表达明显上调.PDTC 预处理组NF-κB 表达明显减少,iNOS mRNA 表达亦下调,但仍高于对照组.结论:SAP 时肺组织NF-κB 活化并通过调控 iNOS mRNA 的表达参与肺损伤.PDTC 可能通过抑制 NF-κB 出活性进而下调 iNOS mRNA 的表达,减轻肺损伤.     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞凋亡及半胱天冬酶-3表达的影响

目的：观察同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞（VSMCs）凋亡以及半胱天冬酶-3（caspases-3）表达的影响。 方法： 采用组织贴块法体外培养人VSMCs，流式细胞术检测人VSMCs细胞凋亡，逆转录-聚合酶链反应法检测caspases-3 mRNA的表达。 结果： 体外培养的人VSMCs在终浓度为500 μmol/L Hcy的培养液中孵育0 h、6 h、12 h、24 h、48 h后的细胞凋亡率分别为2.39％±0.47％、2.45％±0.64％、7.58％±1.02％、13.37％±4.71％、17.69％±3.13％，caspases-3 mRNA与GAPDH扩增条带吸光度(A)比值分别为0.24±0.08、0.29±0.10、0.89±0.26、1.37±0.24、1.82±0.53，表明Hcy呈时间依赖性诱导人VSMCs细胞凋亡和 caspases-3 mRNA的表达上调；在终浓度为0、100、200、500、1 000 μmol/L Hcy的培养液中孵育24 h后的细胞凋亡率分别为2.68％±0.23％、2.79％±0.12％、8.45％±2.41％、13.37％±4.71％、23.75％±5.56％，表明Hcy呈浓度依赖性诱导人VSMCs细胞凋亡。 结论： Hcy诱导人VSMCs凋亡可能是由caspase-3参与的死亡信号通路介导的，诱导人VSMCs凋亡可能是Hcy致动脉粥样硬化作用的机制之一。     

PDTC和姜黄素对抗β_2GPI抗体诱导小鼠表达组织因子的影响

目的:本研究拟探讨PDTC和姜黄素对抗β_2GPI抗体诱导小鼠组织因子(Tissue factor,TF)表达的影响。方法:BALB/c小鼠先用PDTC[100 mg/(kg·d)]或/和姜黄素[50 mg/(kg·d)]预处理2 h,再进行腹腔注射anti-β_2GPI(500μg/只),取小鼠腹腔巨噬细胞、双侧颈动脉和胸主动脉,超声裂解,收集细胞总RNA和蛋白,实时定量PCR(Real-time q PCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性,Western blot方法检测NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、c-Jun和磷酸化pc-Jun的表达情况。结果:抗β_2GPI抗体能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞TF的表达及NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化,与对照相比差异有统计学意义(P0.05 vs NR-Ig G);PDTC和姜黄素均能抑制抗β_2GPI抗体诱导小鼠TF的表达以及NF-κB p65和cJun/AP-1的磷酸化效应(P0.05 vs anti-β_2GPI),但是二者没有协同作用。结论:PDTC和姜黄素均能影响抗β_2GPI抗体诱导小鼠TF的表达,表明其具有防治血栓形成的潜力。     

LPS诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖并增加NF-κB p65蛋白的表达

目的： 研究LPS-NF-κB信号通路在骨形成过程中的作用。方法: MC3T3-E1成骨细胞常规培养,待细胞融合率为80%时,分别加入100 μg/L和500 μg/L LPS处理6 h。流式细胞仪检测细胞周期,计算细胞DNA相对增殖指数;RT-PCR法检测LPS处理成骨细胞后NF-κB mRNA的表达;蛋白质印迹法（Western blotting）检测LPS处理成骨细胞后NF-κB p65蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测LPS处理成骨细胞后NF-κB p65的核易位情况;电泳迁移率变动分析（EMSA）LPS处理MC3T3-E1细胞后NF-κB活力的变化情况。结果: 100 μg/L和500 μg/L LPS可诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖;LPS处理成骨细胞后NF-κB mRNA的表达与正常组比较无显著变化（P>0.05）,而NF-κB p65蛋白的表达明显高于对照组（P<0.01）;LPS处理成骨细胞后免疫荧光法可明显观察到NF-κB p65从细胞质转移入细胞核,且EMSA结果显示LPS处理组细胞核内NF-κB结合活性增加。结论: 低浓度的LPS可促使成骨细胞增殖,此过程中并不影响NF-κB p65的基因表达水平,但能增加NF-κB p65蛋白的表达并提高细胞核内NF-κB的结合活性。     

八肽胆囊收缩素对TNF-α诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364 IL-6的作用及其可能的分子机制(英文)

目的: 观察硫酸化八肽胆囊收缩素（sCCK-8）对TNF-α诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364 IL-6 mRNA 表达及核因子NF-κB的影响及其可能的受体机制。方法: 大鼠滑膜细胞株RSC-364经TNF-α(10　μg/L)、sCCK-8(10^-8-10^-6 mol/L)、CCK受体拮抗剂丙谷胺（2 mg/L）及溶剂单独或联合孵育3 h，用RT-PCR检测细胞IL-6、CCK-AR及CCK-BR mRNA的表达，孵育1 h，用电泳迁移率检测NF-κB活性，孵育30 min，用Western blotting检测胞浆IκB蛋白表达。结果: RSC-364细胞固有表达CCK-A/B受体，sCCK-8（10^-8-10^-6 mol/L）使IL-6、CCK-AR和CCK-BR mRNA表达进一步增高，明显增加TNF-α诱导的NF-κB活性，降低胞浆中IκB蛋白水平，并可被丙谷胺所拮抗。结论: sCCK-8通过NF-κB途径上调TNF-α诱导的大鼠滑膜细胞IL-6 mRNA表达，此作用可能通过滑膜细胞上的CCK受体实现，提示CCK-8在类风湿性关节炎（RA）发病过程中可能具有调控作用。     

抗氧化剂和NF-κB对大肠癌细胞IL-8表达的作用及机制

目的：探讨NF-κB在大肠癌细胞IL-8诱导表达中的作用及抗氧化剂对大肠癌细胞IL-8诱导表达的影响及其机制。 方法： IL-8 mRNA表达采用逆转录/聚合酶链反应(RT/PCR)检测，培养上清IL-8蛋白含量用ELISA检测，EMSA法测定细胞核内NF-κB结合活性。 结果： 抗氧化剂可阻断大肠癌细胞培养体系TNF-α诱导的IL-8生成及IL-8 mRNA的表达, TNF-α可诱导大肠癌细胞NF-κB的激活并被抗氧化剂阻断。 结论： TNF-α诱导的大肠癌细胞IL-8基因和蛋白表达依赖于NF-κB的激活；抗氧化剂可通过抑制NF-κB的活化而阻断IL-8基因和蛋白的诱导表达。     

NF-κB活化在IL-1β诱导的小鼠肾小球系膜细胞表达IL-6中的作用

目的：研究NF-κB在rhIL-1β刺激引起的体外培养的鼠肾小球系膜细胞表达IL-6中的作用。方法： NF-κΒ活性检测采用电泳迁移率改变法(EMSA),IL-6 mRNA表达采用逆转录/聚合酶链反应(RT/PR)检测,培养上清IL-6蛋白含量采用ELISA检测。结果：rhIL-1β刺激肾小球系膜细胞时,在上调IL-6蛋白和基因表达的同时亦激活NF-κB,而且这种上调作用可被NF-κB特异性抑制剂PDTC所阻抑。结论： IL-1β诱导鼠肾小球系膜细胞表达IL-6是通过NF-κB调控,NF-κB可能参与肾小球肾炎的免疫炎症反应。     

Effects of antioxidant and NF-κB on the induction of iNOS gene in rat pulmonary microvascular endothelial cells in vitro

Effects of antioxidant and NF-κB on the induction of iNOS gene in rat pulmonary microvascular endothelial cells in vitro     

核因子-κB对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡及TGF-β1表达的影响

目的: 探讨核因子-κB(NF-κB)对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖、凋亡和转化生长因子β₁（TGF-β₁）表达的影响。方法: 体外培养ASMCs，以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及NF-κB特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)作为工具药,将ASMCs分为对照组、TNF-α组和TNF-α+PDTC组。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TGF-β₁ mRNA表达，Western blotting检测NF-κB、TGF-β₁的表达，免疫细胞化学染色法检测PCNA、Bcl-2蛋白表达及定位，四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法测定ASMCs增殖，Annexin V/PI双标记流式细胞仪分析法检测细胞凋亡。结果: （1）TNF-α组ASMCs的NF-κB活性显著高于对照组(P<0.01),TNF-α+PDTC组NF-κB活性显著低于TNF-α组 (P<0.01)。（2）TNF-α组ASMCs增殖显著高于对照组(P<0.01),TNF-α＋PDTC组的增殖反应显著低于TNF-α组(P<0.01)；TNF-α+PDTC组细胞凋亡率显著高于TNF-α组及对照组(P<0.01)。（3）TNF-α组ASMCs的PCNA、Bcl-2蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.01)，TNF-α+PDTC组的PCNA、Bcl-2蛋白表达量均显著低于TNF-α组(P<0.01)。（4）TNF-α组ASMCs的TGF-β₁的mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组及TNF-α＋PDTC组（P<0.01）。结论: NF-κB活化可能参与调控TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡及TGF-β₁的表达和分泌。     

RSUME促进小鼠垂体腺瘤细胞AtT-20凋亡

目的探讨小泛素化修饰增强子(RSUME)、核转录因子-κB抑制因子-α(IκB-α)及核转录因子-κB 1(NF-κB1)在小鼠垂体腺瘤中表达及其细胞凋亡的影响。方法用RSUME小干扰RNA(siRNA)转染At T-20细胞后,用蛋白印迹及实时荧光定量PCR检测RSUME、NF-κB1和IκB-α蛋白的表达及mRNA的表达,流式细胞计量术检测细胞凋亡。结果在蛋白水平,RSUME-siRNA转染后RSUME及IκB-α表达下调(P0.05),NF-κB1则上调(P0.05);在mRNA水平,转染后RSUME mRNA表达水平明显低于转染前(P0.05),而IκB-α及NF-κB1 mRNA水平无明显变化;转染后细胞凋亡率明显升高。结论 RSUME可以通过NF-κB1促进小鼠At T-20垂体腺瘤细胞的凋亡。     

Collagen gel protects L929 cells from TNFα-induced death by activating NF-κB

Purpose: Type I collagen is one of the most abundant components of extracellular matrix. We previously illustrated that murine fibrosarcoma L929 cells grew well on type I collagen gel and escaped from TNFα-induced cell death. In this study, we investigated the mechanism underlying the protective effect of collagen gel. Material and methods: We used western blot, confocal microscopy, MTT assay and flow cytometry by introducing fluorescence staining to determine the expression levels of nuclear factor kappa B (NF-κB), inhibitory ratio and autophagy. Results: L929 cells on collagen gel showed higher expression of NF-κB in the nucleus. Inhibition of NF-κB with pyrrolidine dithiocarbamate hydrochloride (PDTC) or knockdown by NF-κB-siRNA canceled the protective effect of collagen gel on L929 cells from TNFα-induced death, suggesting for the role of NF-κB in the protection from cell death. We found a new aspect of the effect of PDTC on L929 cells cultured on collagen gel. PDTC alone without TNFα induced apoptosis in the L929 cells cultured on collagen gel but not the cells on plastic dish. The apoptosis induction of the L929 cells cultured on collagen gel with PDTC was repressed by inhibiting autophagy with chloroquine, an autophagy inhibitor, suggesting that autophagy contributes to the death induced by the treatment with PDTC. Possible underlying mechanism of this finding is discussed. Conclusion: NF-κB played an important role in protecting the L929 cells cultured on collagen gel from TNFα-induced death.     

NF-κB通路对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中CX3CL1表达的影响

目的观察NF-κB通路对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)中CX3CL1表达的影响。方法用100μM NF-κB拮抗剂(PDTC)刺激体外培养的RA-FLS,用RT-PCR检测刺激不同时间后RA-FLS中CX3CL1 mRNA表达。结果 RA-FLS中表达CX3CL1;PDTC作用18h后,RA-FLS自身CX3CL1 mRNA表达量下降(P0.001)。结论 CX3CL1 mRNA的表达可能受到NF-κB通路的调节。     

急性肺损伤小鼠肺内热休克蛋白A12B的表达

目的:观察急性肺损伤(acute lung injury,ALI)小鼠肺内热休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)的表达改变,以及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对血管内皮细胞HSPA12B表达的影响.方法:采用气管注射LPS(5 mg/kg)复制小鼠ALI动物模型,6 h后取小鼠肺组织,采用real-time PCR和Western印迹检测肺组织内HSPA12B mRNA和蛋白表达.体外研究采用LPS(1μg/mL)诱导人脐静脉内皮细胞炎症反应,real-time PCR和Western印迹检测细胞HSPA12B mRNA和蛋白表达,采用NF-κB信号通路抑制剂PDTC观察LPS诱导HSPA12B表达的可能分子机制.结果:与正常组相比,LPS诱导的ALI小鼠肺组织HSPA12B mRNA和蛋白含量显著增加,同时LPS可时间依赖性地上调人脐静脉内皮细胞HSPA12B mRNA和蛋白表达,而PDTC预处理可部分逆转LPS诱导的HSPA12B mRNA和蛋白上调.结论:ALI小鼠肺内HSPA12B的表达增加,其机制可能与LPS激活NF-κB信号通路有关.     

ox-LDL对巨噬细胞内皮脂肪酶表达的影响

目的: 探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对鼠源RAW264.7巨噬细胞内皮脂肪酶(EL)表达的影响。方法: 用ox-LDL(0~100 mg/L)孵育RAW264.7细胞24 h使其活化,或者用PDTC (NF-κB抑制剂)预孵育RAW264.7细胞30 min再与ox-LDL(50 mg/L)共同孵育24 h;应用Western blotting 检测EL和NF-κB p65的表达。结果: ox-LDL孵育RAW264.7细胞明显增加EL表达(P<0.05);ox-LDL(50 mg/L)孵育RAW264.7细胞15~30 min可激活NF-κB,用NF-κB 抑制剂PDTC处理后则明显抑制ox-LDL诱导的EL表达增加(P<0.05)。结论: ox-LDL可明显增加RAW264.7细胞EL的表达,可能与NF-κB活化有关。