干扰素-α联合高三尖杉酯碱下调K562细胞端粒酶逆转录酶及端粒酶活性诱导细胞凋亡

目的：研究干扰素-α(IFN-α)联合高三尖杉酯碱(HHT)对K562细胞端粒酶逆转录酶及端粒酶的作用，并探讨其与细胞凋亡的关系。方法:IFN-α、HHT以及两药联合作用K562细胞后用MTT法检测细胞增殖，吉姆萨-瑞氏染色观察细胞形态，PI-Annexin VFITC双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡,Krupp改良的荧光素标记的端粒重复扩增方法(TRAP)检测K562细胞端粒酶活性，RT-PCR方法检测hTERT mRNA表达变化。结果:5×106U·L-1 IFN-α分别联合5-40 μg·L-1 HHT诱导K562细胞凋亡从而抑制其生长，单用HHT时IC50为27.35 μg·L-1，联用5×106 U·L-1 IFN-α后IC50降为18.72 μg·L-1；IFN-α与HHT联用明显下调hTERT mRNA表达并抑制K562细胞的端粒酶活性。结论：IFN-α联合HHT可以诱导细胞凋亡，这可能与下调细胞hTERT mRNA的表达水平，抑制端粒酶活性有关。两药联合作用强于单独用药，提示临床IFN-α联合HHT治疗慢性髓细胞白血病（CML）可能比单用HHT效果更好。     

抑制白血病K562细胞FoxM1表达可增强细胞对高三尖杉酯碱的敏感性

目的:探讨抑制白血病K562细胞叉头框蛋白M1(Fox M1)是否增强细胞对高三尖杉酯碱(HHT)的敏感性。方法:HHT以不同浓度(0、0.015、0.030和0.045μmol/L)和最低起效浓度不同时间(0.015μmol/L,0、24、48和72 h)作用于K562细胞,real-time PCR和Western blot检测Fox M1 mRNA和蛋白表达;以0.015μmol/L HHT作用K562细胞后转染Fox M1 siRNA,观察沉默K562细胞Fox M1后细胞对HHT的敏感性、细胞增殖和凋亡效应以及Fox M1相关靶分子c-Myc和Sp1表达状况。结果:随着HHT浓度增加和时间延长Fox M1表达逐渐降低,说明HHT抑制K562细胞Fox M1表达;HHT处理K562细胞后转染Fox M1 siRNA,细胞生长和克隆形成显著下降,细胞凋亡增加,因此抑制Fox M1可增加K562细胞对HHT的敏感性;Fox M1 siRNA组c-Myc和Sp1表达显著降低,表明Fox M1可正性调控c-Myc和Sp1表达。结论:HHT可以抑制白血病K562细胞Fox M1表达,干扰Fox M1可增强细胞对HHT的敏感性。     

人红白血病转基因多药耐药细胞K562／MDR耐药性的逆转及机制的研究

本实验旨在研究川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)与环孢菌素(cyclosporinA，CsA联合逆转通过基因转移技术获得的仅具有经典MDR表型的人红白血病多药耐药细胞K562／MDR的多药耐药性，并进一步探讨其耐药逆转机制。通过基因转移方法获得仅有Pgp高表达、具经典MDR表型的K562／MDR细胞，作为本研究模型来研究白血病细胞MDR的逆转机制。     

高三尖杉酯碱联合IFNα-2b可促进白血病源性树突状细胞成熟

目的： 研究高三尖杉酯碱（HHT）、干扰素α-2b（IFNα-2b）和两者联合（HHT+IFNα-2b）对白血病源性树突状细胞（DCs）的促成熟作用。方法: 在白血病多药耐药细胞K562/A02中加入细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4,7 d后Wright-Gimsa染色观察细胞形态的变化,流式细胞术检测细胞免疫表型的变化,同种混合淋巴细胞反应、CTL杀伤效应、细胞因子IL-12的分泌来评价此白血病源性DC的成熟程度,然后在上述白血病源性DC中分别加入HHT、IFNα-2b和HHT+ IFNα-2b,3 d后以上述同样方法检测它们对此白血病源性DC的促成熟作用。结果: K562/A02细胞在rhGM-CSF和rhIL-4作用7 d后,CD83、HLA-DR和CD86分子的表达分别为（65.50±8.40）％、（32.00±4.32）％和（18.65±3.20）％,经HHT作用后这3种分子的表达升高到（85.36±8.42）％、（39.58±7.68）％和（35.53±4.35）％;经IFNα-2b作用后升高到（87.15±7.59）％、（40.53±6.30）％和（38.45±6.42）％;经HHT+ IFNα-2b联合作用后升高到（94.38±6.59）％、（52.75±8.51）％和（42.98±9.87）％,与作用前相比差异均显著。经HHT、IFNα-2b和HHT+ IFNα-2b作用后具有典型DC形态的细胞增多。经HHT和 IFNα-2b作用的DC均可刺激T细胞产生较强的增殖效应,诱导产生的CTL对靶细胞K562/A02的杀伤率明显增强且当效靶比为20∶1时杀伤效率最强,IL-12分泌明显增高。结论: HHT和IFNα-2b对白血病源性DC有促成熟作用,且两者联用时作用最强。     

端粒酶在高三尖杉酯碱诱导HL-60细胞凋亡中的作用

目的 研究高三尖杉酯碱（homoharringtonine,HHT)对HL－60细胞端粒酶活性的影响及诱导凋亡作用。方法 采用端粒重复序列扩增法－酶联免疫吸附试验检测了HL－60细胞的端粒酶活性变化；用细胞形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳和DNA片段原位末端标记法检测了细胞凋亡现象。结果 0.005-0.50μg/ml HHT处理HL－60细胞0－48小时，HL－60细胞端粒酶活性呈剂量依赖性和时间依赖性下降。同时，HL－60细胞发生了凋亡。结论 HHT有效抑制HL－60细胞的端粒酶活性，诱导细胞凋亡。     

川芎嗪与环孢菌素A联合应用对转基因多药耐药细胞K562/MDR的逆转作用

目的研究中药川芎嗪(TMP)与环孢菌素A(CsA)联合应用对转基因多药耐药细胞K562/MDR的耐药性逆转作用及可能机制。方法应用非细胞毒性剂量的TMP和CsA单独及联合作用于K562/S和K562/MDR细胞,MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)的药敏性,计算耐药倍数及逆转倍数。利用罗丹明123(Rh123)进行蓄积与排出试验,免疫组化检测P-gp的表达,RT-PCR方法检测MDR1基因的表达。结果与K562/S细胞相比,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA可显著降低ADM对K562/MDR细胞的IC50(P0.01),逆转倍数分别为4.9倍及9.2倍,两者联合应用,逆转倍数为15.4倍。TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显低于单独应用(P0.01);TMP和CsA单独及联合应用,MDR1基因表达均有不同程度的下调。结论 TMP和CsA联合逆转K562/MDR细胞的多药耐药性具有协同作用,其机制可能与下调MDR1基因表达和降低P-gp水平有关     

柴胡皂苷在体外对人白血病细胞株K562/ADM多药耐药性的逆转作用

目的: 研究柴胡皂苷(SS)对白血病细胞株K562/ADM 多药耐药性(MDR)的逆转作用,并进一步探讨其耐药逆转机制。方法: 分别以不同浓度(1~100 mg/L)的SS作用于体外培养的K562和K562/ADM 细胞48 h,采用MTT 法检测细胞增殖抑制率,确定SS的非毒性剂量;采用非毒性剂量SS 1.25、2.5和5.0 mg/L,分别与不同浓度(0.05~100 mg/L)阿霉素(ADM)联合作用,检测各组细胞生长抑制50%的ADM浓度(IC₅₀),计算逆转指数和两药相互作用系数(CDI),观察SS协同ADM作用后的细胞形态;利用流式细胞术检测SS联合ADM作用后K562/ ADM细胞内ADM的蓄积程度、细胞凋亡和细胞周期变化。结果: 随着SS浓度的增加,细胞增殖抑制率也相应增加,呈剂量-效应关系;SS的非细胞毒性剂量为5.0 mg/L,逆转倍数为21.5倍;SS协同ADM作用后形态学方法显示肿瘤细胞数量减少,并出现了大量凋亡细胞,呈剂量-效应关系;SS可明显提高ADM在K562/ADM细胞内的蓄积,与未加SS对照组比较差异显著(P<0.05);SS可增强ADM对K562/ADM细胞的凋亡诱导作用,与未加SS对照组比较差异显著(P<0.05);K562/ADM细胞被阻滞在G₀/G₁期,与未加SS对照组比较差异显著(P<0.05)。结论: SS对白血病耐药细胞株K562/ADM有增殖抑制和逆转多药耐药性的作用,其部分逆转机制可能是通过增加细胞内化疗药物蓄积,诱导细胞凋亡和使细胞阻滞在G₀/G₁期而实现的。     

高三尖杉酯碱通过激活Caspase-3诱导鼻咽癌细胞凋亡

目的　了解高三尖杉酯碱 (HHT)是否可通过激活Caspase 3诱导鼻咽癌细胞CNE 2Z凋亡。方法　将细胞分为 4组 :对照组、1mg/LHHT处理组 (HHT组 ) ,以及分别用Caspase抑制剂 (z VAD fmk)和Caspase 3抑制剂 (DEVD fmk)预处理 2h后 ,再用 1mg/LHHT处理的z VAD fmk +HHT组和DEVD fmk +HHT组。采用流式细胞术及荧光染色法 ,检测 4组细胞的凋亡率 ,以比色法检测它们中Caspase 3的相对活性。结果　流式细胞术和荧光染色均发现 ,HHT组的凋亡率明显高于其它各组 (P <0 .0 1) ;Caspase 3的活性于 2h开始升高 ,8h达高峰 ,明显高于其它各组 (P <0 .0 1) ,2 4h时同其它各组的差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　HHT可通过激活Cas pase 3诱导CNE 2Z细胞凋亡 ,Caspase 3的活性升高具有时间依赖性     

白血病多药耐药逆转研究进展

多药耐药(multidrugresistance, MDR)是肿瘤细胞接触一种抗肿瘤药物后, 不仅对该药可产生耐药性, 对其他结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物也可产生交叉抗药性。白血病细胞的MDR是化疗失败和疾病复发的主要原因之一。目前认为MDR产生的机制有: .药物外排介导的耐药, 主要有P 糖蛋白 (permeability glycoprotein, P gp, P 170 )、多药耐药相关蛋白 (multidrugresistance associatedprotein, MRP)、乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceprotein, BCRP)和肺耐药相关蛋白(lungresistance relatedprotein, LRP)介导的耐药; 谷胱…     

苦参碱逆转白血病多药耐药细胞系K562/A02对柔红霉素耐药性的研究

目的：以白血病多药耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２为对象，验证苦参碱能否逆转其对柔红霉素的耐药性。方法和结果：经ＭＴＴ法发现苦参碱５０ｍｇ／Ｌ能增加Ｋ５６２／Ａ０２对柔红霉素的敏感性，使柔红霉素半数抑制浓度（ＩＣ５０）由１４９２ｍｇ／Ｌ降至８２９ｍｇ／Ｌ，部分逆转了Ｋ５６２／Ａ０２对柔红霉素耐药性，逆转倍数为１８０倍。经流式细胞仪，免疫组化、逆转录—多酶链式反应证明苦参碱逆转Ｋ５６２／Ａ０２耐药性机制主要为：苦参碱降低多药耐药基因ｍｄｒ－１的ｍＲＮＡ表达，使细胞膜上Ｐ－１７０糖蛋白量减少，从而降低经Ｐ－１７０糖蛋白介导的细胞内柔红霉素外排能力，细胞内柔红霉素浓度升高，增强了Ｋ５６２／Ａ０２对柔红霉素敏感性。而苦参碱对Ｋ５６２／ｓ敏感细胞系无上述作用     

地西他滨对K562/A02细胞阿霉素耐药性的影响

 目的: 观察地西他滨(DAC)对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02阿霉素(ADR)耐药性的影响,探讨其作用的可能机制。方法: 分别或联合应用不同浓度ADR和DAC作用于K562/A02细胞和其亲本细胞株K562,采用CCK-8法检测药物细胞毒性,Sequenom MassARRAY系统结合比色法评价DNA甲基化程度,流式细胞术检测K562/A02细胞细胞周期分布和细胞凋亡率。结果: K562/A02细胞较K562细胞具有显著ADR耐药性,前者ADR作用24 h的IC₅₀约为后者的50倍。而对DAC,在0.5~8 μmol/L作用浓度范围内,K562/A02细胞则较K562细胞更敏感。在相同ADR作用浓度(4.31和17.24 μmol/L)下,联合1 μmol/L DAC处理24 h能显著提高K562/A02细胞对ADR的敏感性,细胞存活率下降(P<0.05)。DAC和ADR均能影响K562/A02细胞的细胞周期进程和细胞凋亡率。1 μmol/L DAC的影响与作用时间相关,在作用24 h时以S期阻滞与细胞早期凋亡率升高为主,48 h时以G₂/M期阻滞与细胞晚期凋亡和坏死率升高为主。ADR则主要表现为浓度依赖性G₂/M期阻滞并诱导细胞晚期凋亡和坏死。两者联用使ADR对细胞周期分布的作用进一步加强,即表现为G₂/M期阻滞更加明显,但对细胞凋亡率的影响并无显著差异。而在基因组甲基化程度上,2种细胞没有显著差异,DAC作用前后也没有显著改变。结论: DAC能增强K562/A02细胞对ADR的敏感性,具有逆转耐药作用,其机制可能与调节K562/A02细胞细胞周期进程、促进细胞凋亡和坏死有关。     

Sirt1增强人慢性粒系白血病K562细胞耐药性

 目的 研究Ⅲ类去乙酰化酶Sirt1对人慢性粒系白血病K562细胞耐药性的影响及其机制。方法 分别将酶活性缺失突变型Sirt1（H363Y）和Sirt1 shRNA的表达质粒转染K562细胞后,用G418筛选出稳定表达酶活性缺失突变型Sirt1或 Sirt1 shRNA的K562细胞。用H2O2和 etoposide处理筛选出来的稳定细胞株,Western Blot检测凋亡标志物caspase3的剪切及Bax的表达,同时检测DNA损伤的标志物H2A.X磷酸化;在MCF-7和293A中过表达野生型Sirt1,检测H2O2和 etoposide处理后H2A.X的磷酸化。结果 在K562细胞中,酶活性缺失突变型Sirt1（H363Y）的表达和Sirt1的干扰均能促进H2O2和 etoposide诱导的caspase3的剪切及Bax的表达并同时显著抑制H2O2和 etoposide诱导的H2A.X磷酸化;在MCF-7和293A细胞中,野生型Sirt1的过表达能明显增强H2O2和 etoposide诱导的H2A.X的磷酸化。结论 Sirt1能保护K562细胞对抗DNA损伤药物诱导的凋亡,增强DNA损伤修复的信号。     

人质膜型唾液酸酶与人红白血病细胞多药耐药相关

目的探讨人质膜型唾液酸酶(Neu3)与人红白血病细胞多药耐药的关系。方法分别或联合柔红霉素(DNR)与唾液酸酶特异性抑制剂(NeuAC2en)处理K562和K562/ADM细胞,MTT法检测细胞生存率;RT-PCR检测多药耐药基因(MDR)、多药耐药相关蛋白(MRP)、06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、BCL-xl、BAX和BCL-2mRNA表达;Western blot法检测MDR基因蛋白产物P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达;TBA法检测唾液酸酶活性。结果与K562细胞相比,K562/ADM细胞对DNR具有一定的抵抗性,NeuAC2en与DNR有协同作用(P<0.01);应用NeuAC2en或DNR后K562和K562/ADM细胞Neu3活性均明显下降,两种药物联合应用Neu3活性下降最明显(P<0.01);相同处理条件下,与K562细胞相比,K562/ADM细胞中Neu3、MDR1、BCL-xl和BCL-2表达增加,BAX无明显变化;应用DNR后,MDR1、Neu3、BCL-xl、BCL-2表达均下降,而DNR与NeuAC2en联合应用,以上基因表达水平下调最明显。...     

细胞因子对K562／ADM耐药细胞株耐药性的逆转作用

目的 探讨细胞因子和抗Pgp单抗（mAb）对K562／ADM耐药细胞株耐药性的逆转作用。方法 利用K562细胞的耐阿霉素细胞株K562／ADM,采用免疫细胞化学染色法和流式细胞术,分别检测mAbMRK－16及rhGM－CSF、rhM－CSF或TNF－α对其Pgp表达的影响。结果 将TNF－α（100kU／L）、rhGM－CSF（10μg/L)或rhM－CSF（10g/L)分别单独与K562／ADM细胞孵育48h,Pgp表达细胞的阳性率分别为72．19％、80．04％和70．30％,与未经任何作用的K562／ADM细胞Pgp表达的阳性率（77．02％）相比较,无明显差异（P＞0．05）。mAbMRK－16（10mg/L）以及mAbMRK－16分别与TNF－α或rhGM－CSF共同作用于K562／ADM细胞后,Pgp表达的阳性率分别为67．49％、67．14％和70．56％,与K562／ADM细胞的表达率（77．02％）相比较,Pgp的表达率虽有率,但差异不明显（P＞0．05）;只有rhM－CSF与mAbMRK－16共同作用（Pgp表达的阳性率为64．29％）,可明显抑制K562／ADM细胞上Pgp的表达（P＜0．05）。结论 rhM－CSF加mAbMRK－16联合应用,具有逆转K562／ADM细胞MDR的作用。     

三氧化二砷耐药白血病细胞株K562/AS2的建立及其与多药耐药的关系

目的:建立三氧化二砷(As₂O₃)耐药白血病细胞株,用于研究其耐药机制。初步探讨该细胞系与多药耐药的关系。方法:As₂O₃耐药白血病细胞株的建立通过逐步增加药物浓度方法。细胞毒实验采用MTT法,细胞周期测定采用碘化丙啶荧光染色法,细胞表面P-糖蛋白(P-gp)、细胞内柔红霉素(DNR)浓度、以及细胞免疫表型测定采用流式细胞术测定。结果:As₂O₃耐药白血病细胞株K562/AS2的细胞倍增时间和细胞周期与敏感细胞株K562相似。K562/AS2对As₂O₃、DNR、足叶乙甙(VP16)和阿糖胞苷(Ara-C)的耐药倍数分别为(7.4、2.9、3.8和1.1倍)。多药耐药细胞K562/A02对As₂O₃、DNR、VP16和Ara-C的耐药倍数分别为(0.8、94、2.5和0.9倍)。K562细胞与K562/AS2细胞之间的表面P-gp和细胞内DNR荧光强度无明显差异。结论:建立一株对临床可获得药物浓度(2μmol/L)的As₂O₃产生耐药的白血病细胞K562/AS2。K562/AS2对As₂O₃的耐药倍数是敏感株K562的7.4倍。K562/AS2对DNR和VP16部分耐药,其机制与多药耐药基因1(mdr1)表达产物P-gp作用无关。     

血管内皮生长因子基因反义核酸的设计及其对K562细胞增殖的影响

目的:试图用计算机设计并筛选出血管内皮生长因子(VEGF)的高效反义核酸;用实验方法研究VEGF反义核酸对K562细胞增殖的影响。方法:用RNAstructure(version3.7)软件,选择总自由能(overall△G₃₇)相对低的反义核酸,共计7条,长度18-20核苷酸,全硫代修饰;细胞培养72h,采用台盼蓝拒染法观察存活细胞,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白水平,分析反义核酸对K562细胞的作用。结果:筛选出6条反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,均优于阳性对照组(X2)。与随机对照组(X1)相比,最优序列X7组细胞生长抑制率达31.9%、培养液中VEGF蛋白表达抑制率达51.4%,overall△G₃₇与反义药物活性密切相关(r=0.887,P<0.01)。结论:计算机辅助设计有助于获得更好反义药物,VEGF反义药物可抑制K562细胞生长及VEGF蛋白表达,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。