紫杉醇影响TGF⁃β1诱导的原代人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化

目的：研究紫杉醇（paclitaxel,PTX）对重组人转化生长因子?β1（recombinant human transform growth factor?β1,rhTGF?β1）诱导人肺成纤维细胞（human lung fibroblasts,HLFs）向肌成纤维细胞转化的影响及其相关机制。方法：培养HLFs,药物处理分为对照组、TGF?β1组（5 ng/mL）、TGF?β1+PTX（0.01 nmol/L）组、TGF?β1+ PTX（0.1 nmol/L）组、TGF?β1+ PTX（1 nmol/L）组、PTX组（1 nmol/L）。采用CCK8法测定细胞活性;显微镜下观察并分析细胞形态学变化;Transwell实验检测细胞迁移能力;免疫荧光观察细胞内α?平滑肌肌动蛋白（α?SMA）表达及分布情况;real?time PCR和Western blot检测各组α?SMA、纤连蛋白（fibronectin）、Ⅰ型胶原蛋白（collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（collagen Ⅲ）mRNA水平及蛋白含量;Western blot检测各组细胞内p?Smad3、Smad3、p?p38和p38蛋白含量。结果：CCK8结果显示,1 nmol/L PTX对细胞无毒性作用,0.01 nmol/L PTX不能抑制TGF?β1诱导的HLFs活性增加,0.1和1.0 nmol/L PTX可以抑制TGF?β1诱导的HLFs活性增加;细胞形态学结果显示,0.01 nmol/L PTX不能抑制TGF?β1诱导的HLFs胞体宽度增加,0.1、1.0 nmol/L PTX可以抑制TGF?β1诱导的HLFs胞体宽度增加;Transwell实验结果显示,0.01 nmol/L PTX不能抑制TGF?β1诱导的HLFs迁移,0.1、1.0 nmol/L PTX可以抑制TGF?β1诱导的HLFs迁移;免疫荧光结果显示,0.01 nmol/L PTX不能降低TGF?β1诱导的HLFs内α?SMA荧光强度,0.1、1.0 nmol/L PTX可以降低TGF?β1诱导的HLFs内α?SMA荧光强度;real?time PCR和Western blot结果显示,0.01 nmol/L PTX不能降低TGF?β1诱导的HLFs表型转化标志物α?SMA、fibronectin、collagenⅠ、collagenⅢ含量及p38的磷酸化水平,0.1、1.0 nmol/L PTX可以降低TGF?β1诱导的HLFs表型转化标志物α?SMA、fibronectin、collagenⅠ、collagen Ⅲ含量以及Smad3和p38的磷酸化水平。结论：紫杉醇可以抑制TGF?β1诱导原代HLFs向肌成纤维细胞表型转化,这种作用可能与抑制TGF?β/Smad/MAPK信号通路激活有关。     

人支气管上皮细胞表达的斯钙素⁃1在上皮间充质转化中的作用研究

目的：明确斯钙素?1（stanniocalcin?1,STC1）对支气管上皮间充质转化（epithelial?mesenchymal transition,EMT）的影响,以及香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract,CSE）对支气管上皮细胞STC1表达调控的效应,探讨STC1在慢性阻塞性肺疾病气道EMT中的可能作用。方法：采用转化生长因子β（transforming growth factor β,TGF?β）处理人支气管上皮（16HBE）细胞72 h诱导EMT模型：外源加入STC1重组蛋白（rhSTC1）,Western blot及免疫荧光法检测EMT标志物E?钙黏蛋白（E?cadherin）和α?平滑肌动蛋白（α?SMA）表达。采用CSE刺激16HBE细胞24 h：实时定量PCR及Western blot检测STC1 mRNA和蛋白表达差异,外源加入NF?κB抑制剂JSH23,Western blot检测STC1表达差异。结果：TGF?β可诱导16HBE细胞由典型的多边铺路石样变为长梭形,上皮细胞标志物E?cadherin表达下降,间质细胞标志物α?SMA表达增加,rhSTC1可逆转上述改变。CSE可刺激16HBE细胞STC1表达增高,且呈浓度依赖性增加,外源加入NF?κB抑制剂JSH23可抑制上述效应。结论：STC1在慢性阻塞性肺疾病形成过程中,是抑制气道EMT的保护性因素。CSE局部刺激支气管上皮细胞,通过NF?κB信号导致STC1反应性增加可能是其主要来源之一。     

丙泊酚对高糖诱导的肾小球系膜细胞转化生长因子－β和核转录因子－κB 表达的影响

目的：观察丙泊酚对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子－β（TGF －β）和核转录因－κB （NF －κB）表达的影响。方法在体外培养的系膜细胞上进行研究。设立正常葡萄糖对照组（糖浓度为5．6 mmol／L）、高糖组（30 mmol ／L）以及 PDTC 干预组（100μmol／L）和分别含丙泊酚12．5、50、100μmol／L 的干预组。用 ELISA法检测培养细胞上清中 TGF －β蛋白,以实时荧光定量 PCR 检测 TGF －βmRNA 的表达,Western blot 方法检测系膜细胞内磷酸化 NF －κBp65（p －NF －κBp65）蛋白的表达。结果高糖诱导系膜细胞24 h 后,TGF －β蛋白分泌明显增强（P ＜0．01）,丙泊酚（12．5、50、100μmol ／L）对高糖诱导的系膜细胞分泌的 TGF －β的抑制作用随浓度的变化而变化;系膜细胞在低浓度葡萄糖水平下可低水平表达 TGF －βmRNA,高糖作用24 h 后,TGF －βmRNA 表达明显增强（P ＜0．01）,丙泊酚可明显下调高糖诱导的 TGF －βmRNA 的表达（P ＜0．01）;在高糖作用1 h 后,系膜细胞内的 p －NF －κBp65蛋白表达增强（P ＜0．05）,丙泊酚能够部分抑制高糖诱导的系膜细胞 p －NF －κBp65蛋白增多（P ＜0．05）。结论在体外含高糖培养条件下,丙泊酚可以抑制 TGF －βmRNA 及蛋白在系膜细胞的表达,部分逆转高糖诱导的系膜细胞 NF －κB 的活化,提示丙泊酚对糖尿病肾病可能有抗炎、抗纤维化作用。     

丹红注射液对脂多糖诱导THP-1巨噬细胞促炎因子分泌的影响及机制

目的观察丹红注射液对脂多糖（LPS）诱导的THP-1巨噬细胞促炎因子分泌的影响,并探讨其机制。方法160nmol／L佛波酯孵育THP-1巨噬细胞24h后分为对照组、脂多糖组、丹红组和脂多糖＋丹红组,酶联免疫吸附法检测培养液中促炎因子的含量,Western blot检测核因子κB（NF—κB）、p65和rroll样受体4（TLR4）的蛋白表达水平。结果丹红注射液明显抑制LPS诱导的巨噬细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素1β（IL-1β）释放,下调核因子NF—κB和TLR4的表达。结论丹红注射液抑制脂多糖诱导的炎症反应,可能与其抑制TLR4和NF—κB的表达有关。     

肾癌组织中NF—κB信号分子的表达及As2O3对人肾癌786—0细胞中NF—κB信号通路影响的研究

目的：探讨NF—κB信号通路与肾癌发生和发展的关系以及三氧化二砷（As2O3）对人肾癌细胞系786—0的NF—κB信号转导的影响。方法：采用ICC、ISH、Westernblot和EMSA技术检测15例肾癌组织和10例正常肾组织中NF—κB信号分子IKKα／β、IκBα、p65和ICAM-1的表达和NF—KBDNA结合活性；As2O3处理肾癌786—0细胞后NF—κB信号分子蛋白表达、p65mRNA表达和NF—κBDNA结合活性的改变。结果：肾癌组织中NF—κB DNA结合活性及p65、IKKα／B和ICAM-1蛋白表达量升高（R〈0．01），但IKB仅蛋白明显降低（P〈0．01）；经2μmol／L浓度As2O3处理786-0细胞72h后，p65mRNA含量、NF—κBDNA结合活性及p65、IKKα/β、IκBα和ICAM-1蛋白的表达量均降低（P〈0．01）。结论：NF—κBDNA结合活性及p65、IKKα/β和ICAM-1蛋白增加可能与肾癌的发生和进展有关；2μmol／L以上浓度As2O3可以全面抑制786—0细胞中p65、IKKα/β、IκBα和ICAM-1蛋白和p65mRNA的表达，抑制NF—κBDNA结合活性，可能是As2O3抑制786—0细胞增殖的另一种机制，NF-κB有可能成为抗肾癌治疗的靶点之一。     

肝纤维化中丹参素对TGFβ1/Smads/ERK信号通路的影响及其相互关系

目的探讨肝纤维化过程中转化生长因子β1(transforming growth factorβ,TGFβ1)/Smads/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路的相互作用。方法体外分离培养大鼠肝星状细胞(hepatic stellatecell,HSC),MTT法筛选丹参素最适浓度;以最适浓度丹参素及ERK阻断剂(PD98059)作用于经TGFβ1处理的HSC,CCK-8法检测各组HSC增殖;免疫细胞化学染色法检测各组HSC内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle sctin,α-SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;RT-PCR检测各组HSC的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达量;Western blot法检测各组Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化及Smad7蛋白水平。结果 0.062 5～0.25 mmol/L的丹参素可有效抑制HSC增殖,作为最适处理浓度;PD98059(100μmol/L)可抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,丹参素剂量依赖性抑制TGFβ1诱导的HSC增殖(P<0.01);TGFβ1促进细胞内α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,PD98059及丹参素降低TGFβ1诱导的α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原水平;PD98059可拮抗TGFβ1诱导的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01),丹参素下调Smad2、Smad3 mRNA水平,但上调Smad7 mRNA水平(P<0.01);PD98059及丹参素抑制TGFβ1诱导的Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.01),但对TGFβ1诱导的Smad7蛋白表达上调有不同效应(P<0.01)。结论 TGFβ1上调Smad2、Smad3 mRNA表达及蛋白磷酸化,进而诱导HSC增殖、活化及胶原合成,ERK通路可能参与HSC中TGFβ1诱导Smad基因表达及蛋白磷酸化过程。丹参素对TGFβ1/Smad/ERK信号通路具有抑制效应。     

青藤碱对PKC⁃α/NF⁃κB⁃p65通路的抑制作用及机制

目的：探讨过表达蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）对HEK?293T细胞中核因子?κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）磷酸化水平的影响,并检查青藤碱（sinomenine,SIN）对PKC?α/NF?κB?p65信号通路的抑制作用。方法：采用PCR技术扩增大鼠PKC?α基因蛋白质编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到pIRES2?EGFP空载质粒中,构建野生型（wide type,WT）PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?WT,PKC?αWT）;在PKC?αWT质粒的基础上,将PKC?α第25位丙氨酸（A）与368位赖氨酸（K）分别突变为谷氨酸（E）和精氨酸（R）,即构建持续活化（constitutively active,CA）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?A25E,PKC?αCA）和显性负性（dominant negative,DN）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?K368R,PKC?αDN）。本课题组前期构建的大鼠野生型NF?κB?p65过表达质粒（pIRES2?NF?κB?p65,p65WT）分别与上述各PKC?α过表达质粒共同转染HEK?293T细胞,免疫印迹法检测PKC?α、NF?κB?p65的表达及磷酸化水平。再将上述不同质粒转染HEK?293T细胞,46 h后予50 ng/mL SIN处理细胞2 h,再行免疫印迹实验分析SIN对PKC?α、NF?κB?p65磷酸化的影响。结果：菌液PCR及测序证实,上述PKC?α过表达质粒构建成功。在HEK?293T中过表达PKC?αWT或PKC?αCA可促进NF?κB?p65的磷酸化,且过表达PKC?αCA时尤为显著,而过表达PKC?αDN后NF?κB?p65的磷酸化无明显变化。SIN处理可抑制PKC?αWT、PKC?αCA和PKC?αDN转染组HEK?293T细胞中PKC?α的磷酸化,同时也能抑制过表达PKC?αWT上调的NF?κB?p65磷酸化修饰,但不影响过表达PKC?αCA和PKC?αDN对NF?κB?p65的磷酸化作用。结论：过表达PKC?α可促进HEK?293T细胞中NF?κB?p65的磷酸化,SIN处理HEK?293T细胞后可通过抑制PKC?α的磷酸化下调NF?κB?p65的磷酸化修饰。     

抑制巨噬细胞产生促炎性因子对异位内膜孕酮反应的影响

目的：探讨抑制巨噬细胞产生促炎性细胞因子对子宫内膜异位症孕酮拮抗的影响。方法：原代培养15例异位子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells,ESCs）,趋化实验检测异位ESCs表达的趋化因子配体12（CXCL12）对巨噬细胞的趋化能力。脂质体法介导核因子（nuclear factor,NF）?κB诱捕寡核苷酸（oligonucleotide,ODNs）转染巨噬细胞后再用100 ng/mL脂多糖刺激培养巨噬细胞,电泳迁移率分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）法检测脂多糖刺激条件下巨噬细胞中NF?κB的活化水平,ELISA检测巨噬细胞白介素?1β（interleukin?1β,IL?1β）和肿瘤坏死因子?α（tumor necrosis factor α,TNF?α）表达水平的变化。建立异位ESCs和巨噬细胞的共培养系统,检测通过NF?κB诱捕ODNs抑制巨噬细胞表达促炎性细胞因子对异位ESCs蜕膜化的影响。结果：异位ESCs分泌的CXCL12对巨噬细胞具有趋化作用。NF?κB诱捕ODNs能显著抑制脂多糖诱导的巨噬细胞表达促炎性细胞因子。在巨噬细胞和异位ESCs的共培养系统中,NF?κB诱捕ODNs能通过抑制巨噬细胞产生促炎性因子提高异位ESCs对孕酮的反应。结论：通过NF?κB诱捕ODNs抑制巨噬细胞产生促炎性细胞因子有可能是减轻内异症炎症反应和改善孕酮抵抗的一种方法。     

丹参素对转化生长因子β1刺激肝星状细胞信号传导的影响

目的:探讨丹参素对转化生长因子β1(Transformation growth factor,TGFβ1)刺激大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)信号传导通路的影响.方法:体外分离、培养大鼠肝HSC,检测丹参素(O.062 5～0.2500 mmol/L)对TGFβ1促进HSC活化、HSC表达α-SMA和HSC表达Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的影响.结果:丹参素(0.062 5-0.250 0 mmol/L)对TGFβ1引起的HSC增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性(P相似文献   

结缔组织生长因子通过活化Erk-1/2信号通路促成肌纤维细胞生成

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)协同转化生长因子β1(TGFβ1)促进成肌纤维细胞生成分子机制。方法用TGFβ1预处理大鼠肾间质成纤维细胞(NRK49F),使部分细胞转化为成肌纤维细胞,然后将预处理后的细胞分为对照组,CTGF刺激组,TGFβ1刺激组和PD98059干预组。通过免疫细胞化学双染技术分别检测成肌纤维细胞标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和掺入的细胞增殖标志物5溴2'脱氧尿嘧啶(BrdU);并以Western免疫印迹法检测αSMA水平。结果TGFβ1预处理的各组细胞都有胞浆内αSMA染色阳性,CTGF刺激组αSMA蛋白表达均明显高于对照组(P<0.05);但CTGF组部分αSMA阳性细胞核内BrdU阳性率明显高于对照组和TGFβ1组。进一步实验显示CTGF刺激细胞30min能明显诱导细胞内Erk1/2磷酸化,TGFβ1组无此反应。用PD98059阻断Erk1/2磷酸化可以明显抑制CTGF引起的细胞核内BrdU阳性表达和αSMA蛋白表达(P<0.05)。结论CTGF通过Erk1/2信号通路促进TGFβ1诱导的成肌纤维细胞增殖。     

β-淀粉样蛋白对小胶质细胞合成一氧化氮的影响

目的探讨β-淀粉样蛋白（amyloid beta-peptide,Aβ）诱导小胶质细胞活化后κ轻链核因子（nuclear factor-kappa B,NF-κB）的表达及一氧化氮（NO）水平的变化。方法Aβ干预纯化培养的小胶质细胞,观察其形态学变化,采用镉还原法测定NO水平,免疫细胞化学方法研究NF-κB的表达。结果500 nmol/L及1000 nmol/L Aβ干预组细胞形态呈“阿米巴样”,细胞核内NF-κB的表达增加（P〈0.05）,培养基中NO浓度升高（P〈0.05）。结论Aβ激活小胶质细胞NF-κB途径大量合成NO,可能参与阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease,AD）的致病过程。     

RREB1对TGF⁃β1诱导系膜细胞增殖的影响

目的：探讨ras反应元件结合蛋白1（ras responsive element binding protein 1, RREB1）对转化生长因子?β1（transforming growth factor?β1,TGF?β1）诱导大鼠系膜细胞增殖的影响。方法：用TGF?β1及RREB1?siRNA转染干预系膜细胞,CCK?8法检测系膜细胞增殖活力,RT?PCR法检测细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、平滑肌肌动蛋白α（α?smooth muscle actin,α?SMA）及RREB1 mRNA水平,Western blot法检测PCNA、α?SMA及RREB1蛋白的表达,流式细胞术检测系膜细胞周期。结果：与对照组相比较,TGF?β1干预后CCK?8法检测系膜细胞增殖活力增加（P < 0.01）,PCNA、α?SMA及RREB1 mRNA和蛋白水平增加（P < 0.01）,细胞周期检测提示S期细胞百分率增多,G1期细胞百分率减少（P < 0.01）;与TGF?β1组相比较,RREB1?siRNA转染+TGF?β1干预后的系膜细胞增殖活力下降（P < 0.01）,PCNA、α?SMA及RREB1 mRNA和蛋白水平下降（P < 0.01）,细胞周期提示S期细胞百分率降低,G1期细胞百分率升高（P < 0.01）。结论：TGF?β1通过上调RREB1的表达诱导系膜细胞增殖。     

凋亡抑制蛋白c⁃FLIP（L）调控肺纤维化过程的机制

目的：明确凋亡抑制蛋白c?FLIP（L）在肺纤维化过程中的作用,探究其异常表达参与肺纤维化发病的分子机制。方法：构建博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型,对正常鼠与模型鼠的肺组织切片进行HE和Masson染色观察病理变化,并采用免疫组化分析c?FLIP（L）及上皮?间质转化（epithelial?mesenchymal transition,EMT）标志分子E?cadherin的表达。构建表达c?FLIP（L）的稳定细胞株,qRT?PCR检测EMT标志分子E?cadherin、N?cadherin及Vimentin的mRNA表达。采用转化生长因子（transforming growth factor,TGF）?β1诱导细胞发生EMT,通过Smad报告基因检测和Western blot分析c?FLIP对TGF?β1诱导EMT发生的影响。结果：c?FLIP（L）表达水平在肺纤维化组织中明显升高,与E?cadherin表达呈负相关性。C?FLIP（L）能促进肺上皮细胞的EMT表型,并促进TGF?β1诱导的Smad信号通路激活,而敲减c?FLIP（L）表达能阻滞TGF?β1诱导的EMT进程。结论：c?FLIP（L）在肺纤维化过程中高表达能促进EMT发生,是肺纤维化病程发展的促进因素之一。     

白藜芦醇对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO和炎性因子生成的调控

目的探讨白藜芦醇（Res）对内毒素（LPS）诱导小鼠腹腔巨噬细胞核因子-κB（NF—κB）活化及炎性细胞因子（TNF—α、IL—1β、IL-6）基因表达的调节，为Res的临床运用提供理论依据。方法分别用LPS或Res＋LPS处理体外培养的小鼠巨噬细胞，采用电子顺磁共振（EPR）自旋捕集技术直接检测巨噬细胞产生的NO，电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测细胞中NF—κB活性，逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中TNF—α、IL—1β、IL-6 mRNA和蛋白的表达。结果表明LPS组NO含量、NF—κB活性和TNF—α、IL-1β、IL-6含量在刺激后2—12h明显高于正常对照组（P〈0．01），而Res＋LPS组NO含量、NF—κB活性和TNF—α、IL-1β、IL-6含量均显著低于LPS组（P〈0．01）。结论提示LPS可诱导巨噬细胞NF—KB活化，导致TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达增强，而Res能抑制NF—κB活化而调节TNF—α、IL-1β、IL-6基因的表达。     

消退素RvD1抑制LPS诱导的大鼠胰腺腺泡细胞炎性反应的实验研究

目的 探讨消退素RvD1对脂多糖 (LPS)诱导的胰腺腺泡细胞（AR42J）炎性效应的干预作用,并分析其机制。方法 将AR42J细胞分为6组:RvD1（100 nmol/L)组,LPS组, RvD1 （1、10、100 nmol/L）+LPS组和生理盐水对照组。其中LPS组和RvD1+LPS组以100 mg/L LPS刺激AR42J细胞,构建急性胰腺炎的体外模型,RvD1+LPS组在建模前先用不同浓度 （1、10、100 nmol/L）RvD1对AR42J细胞预处理30 min。实时荧光定量PCR检测各组AR42J细胞TNF-α、IL-6、及NF-κB活性亚基p65的mRNA表达;ELISA检测培养液上清中TNF-α、IL-6蛋白浓度的改变;流式细胞术检测AR42J细胞的NF-κB激活率。结果 RvD1可以抑制LPS诱导的AR42J炎症细胞因子TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白的表达, 且呈剂量依赖方式。RvD1同样以剂量依赖方式抑制LPS诱导的AR42J细胞p65 mRNA表达及NF-κB激活率。结论 RvD1可以呈剂量依赖方式抑制LPS诱导的腺泡细胞NF-κB激活,进一步抑制TNF-α、IL-6等细胞因子的分泌,从而抑制胰腺腺泡细胞的炎性反应。     

NF-κB/IκB信号通路介导血管紧张素Ⅱ诱导的系膜细胞促炎性细胞因子表达

目的：探讨核因子—κB(NF—κB)／IκB信号通路在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小球系膜细胞促炎性细胞因子表达中的作用。方法：应用核酸酶保护法检测系膜细胞肿瘤坏死因子α(TNF—α)、IL-1α和IL-1β mRNA表达；应用凝胶电泳迁移率和Western blot检测肾小球系膜细胞中NF—κB活化、p65亚基核转位以及IκBα和IκBβ的降解。结果：正常培养状态下，系膜细胞可组成型表达TNF—α和IL—1β，而不表达IL-1αmRNA，AngⅡ刺激后促炎性细胞因子表达显著上调，NF—κB特异性抑制剂2-硫代氨基甲酸吡咯烷显著抑制AngⅡ诱导的促炎性细胞因子基因表达；AngⅡ诱导系膜细胞NF—κB活化，p65核转位及胞质内IκBα和IκBα的降解。结论：AngⅡ诱导肾小球系膜细胞中促炎性细胞因子表达可能通过NF—κB／IκB信号转导通路来实现。     

和厚朴酚抑制内毒素诱导的人肾小球系膜细胞炎症因子表达的研究

目的：观察和厚朴酚（HNK）对内毒素（LPS）诱导人肾小球系膜细胞（HRMCs）炎症反应的抑制作用及其分子机制研究。方法：以MTS法检测和厚朴酚（0～160μmol/L）对人肾小球系膜细胞的毒性作用,确定合适的药物实验浓度。将系膜细胞与LPS（1μg/ml）及不同浓度的和厚朴酚（0～20μmol/L）共同培养24h后收集培养上清液和细胞,并提取细胞蛋白。ELISA法检测各组培养上清液中IL-1β、TNF-α、IL-18及TGF-β1的表达水平,免疫印迹Western blot法检测细胞NF-κB p65,IKK-α/β及IKB-α磷酸化、非磷酸化蛋白表达水平,探讨和厚朴酚的抗炎作用机制。结果：20μmol/L及以下的和厚朴酚浓度对系膜细胞无明显毒性作用,但40μmol/L及以上的浓度明显降低系膜细胞的增殖活力。LPS刺激可显著诱导系膜细胞炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-18及TGF-β1的产生。和厚朴酚（0～20μmol/L）剂量依赖性地抑制LPS诱导的炎症因子的表达。免疫印迹结果显示,和厚朴酚可显著抑制LPS诱导的系膜细胞NF-κB p65,IKK-α/β及IKB-α等信号分子蛋白磷酸化水平。结论：和厚朴酚能有效抑制LPS诱导的人肾小球系膜细胞炎性细胞因子的表达,其机制部分通过抑制细胞NF-κB p65、IKK-α/β及IKB-α等信号分子的磷酸化水平。     

慢病毒介导Smad7基因对角膜基质细胞增殖与纤维增生的抑制作用

【摘要】 目的 探讨慢病毒介导的Smad7基因转导能否抑制角膜基质细胞的增殖和纤维增生反应。方法 培养SD大鼠的角膜基质细胞,慢病毒载体介导转染Smad7基因或空质粒基因,分别建立Smad7阳性细胞克隆及空质粒阳性细胞克隆。角膜基质细胞进行分组：①正常细胞组：正常基质细胞,不加TGFβ2;②TGFβ2对照组：正常基质细胞加TGFβ2共孵育;③空质粒组：感染空质粒慢病毒的阳性细胞,加TGFβ2共孵育;④Smad7组：感染Smad7慢病毒的阳性细胞,加TGFβ2共孵育。TGFβ2的终浓度为10ng/ml。在TGFβ2刺激2h后Western blot检测TGFβ/Smad信号传导因子Smad2蛋白的磷酸化蛋白（phosphorylated Smad2,p-Smad2）。TGFβ2刺激48h后Western blot和real-time PCR检测α-SMA（α-smooth muscle actin）、Ki67、Ⅲ型胶原蛋白（Type Ⅲ collagen, ColⅢ）mRNA和蛋白的表达。MTT法检测基质细胞生长活性。结果 Smad7基因转导抑制了Smad2蛋白的磷酸化,减少了Ki67、α-SMA和胶原III mRNA和蛋白的表达,角膜基质细胞的生长活性也下降。结论 Smad7基因转导可阻断大鼠角膜基质细胞TGFβ信号传导通路,减少Smad2的磷酸化,阻止基质细胞的活化增殖,阻断基质细胞向肌纤维母细胞的转化,并且减少胶原蛋白III的合成,从而抑制角膜基质细胞增殖和纤维增生。     

蛇床子素对Aβ_(25-35)诱导的星形胶质细胞NF-κB活化机制的影响

【目的】探讨蛇床子素（Osthole,Ost）拮抗β淀粉样蛋白25—35（Ap25-35）毒性损伤、保护神经细胞的作用及其与核因子-κB（NF—κB）活化机制的关系。【方法】以原代培养的大鼠星形胶质细胞（astrocytes,AS）为靶标建立阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease,AD）细胞模型。采用CCK-8（cell counting kit-8）法检测细胞活力,进行AB25-35造模浓度、时间以及Ost预处理最适宜浓度的选择。经Aβ25-35和Ost干预后,采用激光共聚焦显微镜检测分析异硫氰酸荧光素／碘化丙啶（FITC／PI）双重标记的NF—κB与其抑制蛋白（IKBot）在细胞内的激活程度,结合形态学观察分析Ost对星形胶质细胞的保护作用。【结果】Ost可拮抗Aβ25-35的神经毒性作用,尤其以低浓度（0．01-1μmol／L）为佳,随着浓度的升高,对细胞的保护作用呈减弱趋势。40μmol／L的Aβ25-35作用于As24h可过度活化NF—κB的表达（P〈0．01）,激活IκBα发生磷酸化及降解（P〈0．01）。低浓度的Ost可显著抑制NF—κB的过度活化（P〈0．01）,上调细胞核内IκBα的表达（P〈0．01）。【结论】Ost抑制Aβ25-35的神经毒性作用,延缓AD发生发展的作用机理可能与NF—κB活化机制有关。