放疗对宫颈鳞癌细胞凋亡及FHIT基因表达的影响

目的: 探讨放疗对宫颈癌FHIT蛋白表达、细胞凋亡的影响及FHIT蛋白与细胞凋亡的关系.方法:采用免疫组织化学和TUNNEL标记法检测50例ⅡB-ⅢB期宫颈癌患者在放疗前、放疗中(Dt 10、30 Gy)和放疗结束后,宫颈癌组织中FHIT蛋白表达水平的改变与细胞凋亡情况.结果:50例患者在放疗Dt 10、30Gy和放疗结束时FHIT蛋白表达的阳性率分别为56%、68%和84%,与放疗前的36%相比,表达率明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞凋亡阳性率分别为52%、64%和78%,与放疗前的28%相比,亦明显升高(P＜0.05);随着放疗进展,细胞凋亡阳性率与FHIT蛋白表达的阳性率呈正相关(P＜0.05).结论:放疗能增强FHIT蛋白表达,同时诱导细胞凋亡;FHIT蛋白在放射线诱导的细胞凋亡过程中可能起调控作用.     

中晚期宫颈鳞癌同步放化疗治疗模式探讨

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一,近年发病率持续上升,发病年龄有所降低.由于防癌健康体检的普遍实施,早期宫颈癌可以及时发现和治疗,但仍有相当一部分患者就诊时已错过手术时机.     

子宫颈癌同步放化疗的疗效与副反应

目的研究同步放化疗治疗子宫颈癌的疗效及副反应。方法158例Ⅰb2～Ⅳ期子宫颈癌患者接受同步放化疗。盆腔体外放射治疗DT 45 Gy/25f,腔内后装放疗7～9次,宫颈黏膜下0.5 cm,大块肿瘤消除量为10～30 Gy,A点(42±7)Gy。同步化疗用药为5-氟尿嘧啶(5-Fu) 2400 mg、m2,96 h持续泵入,第1天和第29天;顺铂(DDP)60 mg/m2,分1～4 d静脉滴入,第1～4天和第29～32天。结果全组总5年生存率为66.3%。宫颈局部未控率为4.4%(7/158),盆腔复发率为3.2%(5/158),远处转移率为17.1%(27/158)。毒副反应中,Ⅲ、Ⅳ级白细胞下降为12.7%(20/158),血小板下降为1.3%(3/158),中、重度贫血为3.2%(5/158),胃肠道反应腹泻为17.8%(28/158),心脏毒性为10.1%(16/158),放射性直肠炎为13.3%(21/158),放射性膀胱炎为0.6%(1/158)。结论采用含5-Fu和DDP的药物同步放化疗治疗子宫颈癌,总治疗时间没有延长,5年生存率亦未见提高。治疗中,相关毒副反应增加,但可以接受。     

沉默dnmt1基因对胃癌细胞株AGS细胞周期、增殖及凋亡的影响

背景与目的:DNA甲基转移酶1(DNAmethyltransferase1,dnmt1)基因在多种肿瘤细胞中表达量相当高,而在正常成人细胞中则低表达,因此dnmt1基因的高表达与肿瘤的发生有密切的关系。本研究观察以dnmt1基因为靶基因的重组质粒对胃癌细胞株AGS细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法:设计短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的寡核苷酸片段,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体pshRNA-dnmt1,转染胃癌细胞株AGS。实验分为空白对照组(仅予脂质体)、pTZU6 1组(予空质粒pTZU6 1)和pshRNA-dnmt1组(予以重组质粒pshRNA-dnmt1)3组。Westernblot检测dnmt1蛋白水平变化;RT-PCR法评估mRNA水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT法检测细胞生长情况;吖啶橙/溴乙锭双染色(AO/EB)法、电镜和TUNEL观察细胞凋亡情况。结果:成功构建重组质粒pshRNA-dnmt1,并经序列分析得到确认。pshRNA-dnmt1转染AGS细胞后24h出现dnmt1蛋白表达量减少,24、48、72h抑制率分别为28.24%、68.54%、81.47%。转染pshRNA-dnmt1后24、48、72h对AGS细胞中dnmt1mRNA的抑制率分别为21.63%、52.97%、72.06%。转染后72hS期细胞由空白对照组的(36.58±1.76)%降至pshRNA-dnmt1组的(18.54±6.59)%;G2/M期细胞由空白对照组的(6.18±0.32)%升至pshRNA-dnmt1组的(18.53±1.42)%,均有显著性差异(P<0.05)。转染后24、48、72h细胞存活率分别为79.49%、51.63%和39.16%。AO/EB法、电镜和TUNEL均可见大量典型的凋亡和坏死细胞。结论:重组质粒pshRNA-dnmt1能特异有效地抑制AGS细胞内dnmt1的表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供依据。     

苦参碱对人类肝癌细胞HepG2增殖、细胞周期及凋亡的影响

 目的　探讨苦参碱（MT）对人类肝癌细胞株HepG2增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法　用不同质量浓度的MT（0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g／L）对培养的HepG2细胞作用不同时间（24、48、72 h）,用四氮噻唑蓝（MTT） 比色法检测MT对细胞增殖的影响;流式细胞术（FCM）检测MT对HepG2细胞周期及凋亡的影响。结果　质量浓度≥0.1 g／L的MT有抑制HepG2细胞增殖的作用,且作用随药物质量浓度的增加及时间的延长而加强（P＜0.01）。FCM检测分析显示,0.8 g／L MT作用48 h能将HepG2细胞阻滞在G1期[（75.3±6.5）%对（64.1±6.3）%]（P＜0.05）,1.6 g／L MT作用48 h能将HepG2细胞阻滞在G2期[（29.1±9.1）%对（11.6±2.1）%]（P＜0.01）。0.4、0.8、1.6 g／L MT作用12、24、48 h对HepG2细胞都有诱导凋亡作用,且作用随药物质量浓度的增加及作用时间的延长而加强（P＜0.01）。结论　MT能够抑制HepG2细胞的增殖、诱导其凋亡并影响其细胞周期,呈时间和剂量依赖性。MT抗肝癌的机制可能与影响肝癌细胞周期、抑制细胞增殖及诱导凋亡有关。     

LiCl对脐血有核细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 研究LiCl对体外培养的脐血有核细胞(CBNC)增殖、凋亡以及细胞周期的作用,同时与GM—CSF、GM—CSF合用G—CSF,GM—CSF合用G—CSF和IL—3的作用做比较。方法 采用~3H—TdR掺入法测定LiCl及其它三种处理因素对CBNC的增殖作用。用流式细胞计数仪检测,Mcycl软件对CBNC的凋亡及细胞周期进行分析。结果 LiCl能刺激CBNC增殖,其作用相似于单独使用GM—CSF及GM—CSF合用G—CSF。同时,LiCl和GM—CSF、G—CSF一样,都能抑制CBNC凋亡的发生。而对CBNC周期的影响则与其它几种因素有所不同,主要表现在LiCl作用后CBNC中的S G_2 M期细胞比例较低。结论 LiCl能刺激CBNC增殖,抑制其凋亡,并影响其细胞周期。     

ⅡB-ⅢB期宫颈鳞癌同步放化疗与新辅助化疗后同步放化疗疗效比较

目的 比较ⅡB-ⅢB期宫颈鳞癌单纯同步放化疗与新辅助化疗后同步放化疗的远期疗效。方法 收集2005-2011年云南省肿瘤医院收治的随访资料完整的171例ⅡB-ⅢB期宫颈鳞癌患者进行回顾分析,单纯同步放化疗113例(同步组),新辅助化疗后同步放化疗(新辅助组)58例。Kaplan-Meier法计算OS并Logrank检验和单因素分析,Cox模型多因素分析。结果 中位随访时间66个月,同步组与新辅助组3、5年OS率分别为81.4%、75.9%与74.3%、67.2%(P=0.469);亚组分析显示无论有无淋巴结转移生存率均相近(P=0.310、0.151)。单因素及多因素分析均显示肿块长径、淋巴结转移、同步化疗方式是宫颈癌预后影响因素(P=0.003、0.024、0.037及P=0.001、0.048、0.022)。有淋巴结转移患者盆腔局部复发率较高(P=0.047),而死亡率、远处转移、远期不良反应相近(P=0.215、0.245);无淋巴结转移者3-4级骨髓抑制更多(P=0.016),而死亡率、局部复发、远处转移、远期不良反应均相近(P=0.328、0.114、0.330)。结论 ⅡB-ⅢB期宫颈鳞癌患者无论有无淋巴结转移,同步组与新辅助组疗效相当;肿块长径、淋巴结转移、同步化疗方式是预后影响因素;新辅助化疗增加同步放化疗期间3-4级骨髓抑制发生风险,导致放疗时间延长,局部复发发生风险增加。     

鼻咽癌相关基因NAG7对鼻咽癌细胞周期及凋亡的影响

背景与目的NAG7基因是我室克隆的鼻咽癌相关的肿瘤抑制候选基因,其功能与作用机制目前尚不清楚.研究鼻咽癌相关的潜在抑瘤基因NAG7对鼻咽癌细胞系(HNE1)细胞周期和细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法采用脂质体转染技术将NAG7基因导入HNE1细胞,建立稳定表达NAG7的细胞株,Northernblot分析转染细胞NAG7基因的表达,并采用流式细胞技术检测细胞周期、细胞周期素及细胞凋亡的改变,并用westernblot验证.结果NAG7基因重表达的HNE1细胞与空载体转染的HNE1和HNE1细胞相比G0/G1期细胞数增加(P<0.05),S期细胞数减少;细胞凋亡数目增加(P<0.05);细胞周期素A、D1、E表达明显降低(P<0.05),细胞周期素B1表达降低,Westernblot检测亦证实cyclinD1和cyclinE表达明显下调.结论NAG7的重表达导致细胞周期素表达下调,从而延缓细胞经G1期进入S周期及诱导细胞凋亡增加进而抑制NPC细胞的过度增殖.     

介入化疗对宫颈鳞状细胞癌细胞凋亡和增殖的影响

目的:探讨介入化疗对宫颈鳞癌的细胞凋亡和增殖的影响.方法:选取宫颈鳞癌患者30例,介入化疗前后子宫组织,采用DNA缺口原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,用凋亡指数(AI)表示;免疫组化染色SP法检测Ki67指数表达增殖变化,用LI表示;计算凋亡/增殖比例(AI/LI),并取30例正常宫颈上皮组织作为对照.结果:1)介入化疗后AI明显高于介入化疗前(P＜0.05).2)介入化疗后LI明显低于介入化疗前(P＜0.05).3)介入化疗前AI/LI(0.1293±0.079)低于对照组(0.2033±0.055),介入化疗后AI/LI(0.995 6±0.976)高于对照组,介入化疗后AI/LI明显高于介入化疗前,均有统计学意义(P＜0.05).结论:介入化疗能诱导宫颈癌细胞的凋亡,抑制宫颈癌细胞的增殖;AI/LI能表示细胞凋亡和增殖之间平衡.     

单纯放疗与同步放化疗治疗宫颈癌患者的临床疗效

目的 探讨单纯放疗、同步放化疗治疗宫颈癌患者的疗效及不良反应.方法 研究对象为2010年5月-2012年5月在内蒙古医科大学附属医院接受治疗的127例宫颈癌患者.根据治疗方案分为两组:单纯放疗组65例,同步化放疗组62例.观察两组患者的疗效、不良反应和生存情况.结果 全组患者均顺利完成治疗,中位随访时间为42个月.单纯放疗组完全缓解率为80.00％(52/65),同步化放疗组完全缓解率为82.26％(51/62),差异无统计学意义(x2=1.22,P=0.352).单纯放疗组和同步放化疗组患者的1年总生存率分别为95.38％、95.16％,差异无统计学意义(x2=0.32,P=0.533);3年总生存率分别为81.54％、90.32％,5年总生存率分别为72.31％、83.87％,差异均具有统计学意义(x2 =5.09,P =0.015;x2=3.87,P=0.039).46例年龄≥60岁的患者单纯放疗组和同步放化疗组1年总生存率分别为94.62％、93.91％,3年总生存率分别为85.02％、87.25％,5年总生存率分别为70.06％、73.58％,差异均无统计学意义(x2=0.06,P=0.753;x2=1.16,P=0.279;x2=0.48,P=0.511).单纯放疗组和同步放化疗组不良反应主要以1—2级为主,其中白细胞减少(56.10％∶72.20％)、血小板减少(58.82％∶76.80％)、恶心呕吐(34.04％∶56.90％)发生率的差异均有统计学意义(x2=11.23,P=0.003;x2=11.82,P=0.002;x2=12.77,P=0.000).结论 同步放化疗治疗宫颈癌的疗效优于单纯放疗,可以提高3年和5年总生存率,但同时也应注意到同步放化疗可能引起的不良反应增加,对于年龄≥60岁的宫颈癌患者同步放化疗并未取得更大的生存获益.     

子宫颈癌的综合治疗

当前,对以手术为主的早期子宫颈癌综合治疗方法 和以放疗为主的中晚期子宫颈癌综合治疗方法 比较被肯定,同步放化疗目前研究较多,放疗与热疗联合的疗效也有较多的应用,国外已把同步放化疗作为常规治疗方法同时热疗技术的完善使其在临床应用更多.减少、减轻治疗后并发症,提高疗效是治疗子宫颈癌的最终目的 .     

奈达铂联合甲地孕酮同步放化疗治疗中晚期宫颈癌的近期疗效分析

目的 探讨奈达铂联合甲地孕酮同步放化疗治疗中晚期宫颈癌的近期疗效.方法 42例中晚期(Ⅱb～Ⅳa期)宫颈癌患者随机分为单纯放疗组(RT组,21例),奈达铂联合甲地孕酮同步放疗组(RT+C组,21例),两组放疗方法相同.RT+C组在放疗开始后,每周1次奈达铂30 mg/m2,静脉滴注,第1天,共4～5周,并常规给予止吐药物及适当水化,患者从治疗开始均每天服用甲地孕酮160mg至治疗结束.结果 RT+C组患者中,完全缓解(CR)17例(81.0%),部分缓解(PR)4例(19.0%),有效率为100%;RT组患者中,CR 8例(38.1%),PR 9例(42.9%),有效率81.0%.RT+C组的CR及有效率均高于RT组,差异有统计学意义.RT+C组患者的1年生存率为100%(21/21),RT组患者的1年生存率为81.0%(17/21),差异有统计学意义(x2=4.42,P＜0.05).结论 奈达铂联合甲地孕酮同步放化疗可提高中晚期宫颈癌的近期疗效,虽毒性反应有所增加,但患者可以耐受.

Abstract：

Objective To investigate the early efficacy of nedaplatin combined with megestrol in concurrent chemoradiotherapy for advanced cervical cancer. Methods Forty-two cases of cervical cancer (FIGO Ⅱb to Ⅳa) were divided randomly into two groups: radiotherapy alone (21 cases) and radiation plus chemotherapy (Nedaplatin) group. The same radiotherapy was given to the two groups. Patients of the RT + C group received nedaplatin 30 mg/m2 in intravenous drip infusion once weekly on day 1, for 4 to 5 weeks, and megestrol 160 mg orally every day during the radiation therapy. Results The early outcome:the complete remission rate was 81.0% and partial remission rate was 19.0% in the RT + C group,significantly better than the CR (38.1%) and PR (42.9%) in the RT group. The 1-year survival rates in the two groups were 100% (21/21) and 81.0% ( 17/21 ), respectively, with a significant difference between the two groups ( P ＜ 0.05 ). Conclusions The combination of nedaplatin and megestrol with concurrent chemoradiotherapy can improve the early outcome of advanced cervical cancer, with somewhat increased but tolerable adverse effects.     

顺铂与奈达铂同步放化疗治疗中晚期宫颈癌的临床对比研究

目的:探讨顺铂同步放化疗与奈达铂同步放化疗治疗中晚期宫颈癌的疗效和不良反应。方法:64例中晚期宫颈癌患者随机分为顺铂同步放化疗组(32例)和奈达铂同步放化疗组(32例),观察2组的近期和远期疗效以及不良反应。结果:顺铂同步放化疗组与奈达铂同步放化疗组的近期有效率分别为96.9%和100.0%(P>0.05)。顺铂同步放化疗组的3年生存率(71.88%)、局部复发率(12.50%)和远处转移率(6.25%)与奈达铂同步放化疗组(分别为70.97%、12.90%和6.45%)相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。顺铂同步放化疗组的胃肠毒性和肾毒性发生率高于奈达铂同步放化疗组(P<0.05),而奈达铂同步放化疗组的血小板减少发生率高于顺铂同步放化疗组(P<0.05)。结论:顺铂单药同步放化疗与奈达铂单药同步放化疗均能明显提高中晚期宫颈癌患者的近期和远期疗效,并降低局部复发率和远处转移率。不良反应可以耐受。     

基于临床及影像学参数预测宫颈癌患者同步放化疗后生存

目的探讨基于临床参数、表观弥散系数(ADC)及影像组学的列线图模型在预测局部晚期宫颈癌(LACC)同步放化疗(CCRT)后生存中的价值。方法回顾性分析2014年3月至2020年3月于安徽医科大学附属省立医院接受CCRT并持续随访的ⅠB-ⅣA期宫颈癌患者资料423例, 所有患者采用简单随机分组法按2∶1分为训练组和验证组。测量所有患者疗前原发灶的最小、平均、最大ADC值及弥散加权成像(DWI)、T2WI、T2WI压脂序列的3D纹理参数。采用最小绝对收缩和选择算子(LASSO)算法和logistic回归分析筛选纹理特征、计算影像组学评分(Rad-score)。采用Cox回归分析构建预测宫颈癌CCRT后总生存(OS)期及肿瘤特异性生存(CS)期的列线图模型, 并对模型进行内部、外部验证。结果鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)、外照射剂量、ADCmin和Rad-score是LACC患者CCRT后OS、CS的独立预后因素, 并构成列线图模型。两个模型预测1年、3年、5年OS和CS的曲线下面积(AUC)分别为0.906、0.917、0.916和0.911、0.918、0.920, 内部验证一致性指数(...     

同步放化疗和单纯放疗治疗ⅡB～ⅢB期宫颈癌的疗效比较

背景与目的:同步放化疗已成为局部晚期宫颈癌的标准治疗模式,但对于放疗联合何种方案的化疗效果最佳,目前尚无一致意见.本研究中我们比较同步放化疗与单纯放疗,以及同步放化疗不同化疗方案的疗效及毒副反应.方法:2003年1月至2004年12月江西省妇幼保健院收治的符合人组标准的ⅡB～ⅢB期宫颈癌患者285例,按住院序号随机分为单纯放疗组142例,同步放化疗组143例.同步放化疗组又按化疗方案不同分为:BP(博来霉素 顺铂)方案同步放化疗51例,TP(紫杉醇 卡铂)方案同步放化疗47例,FP(氟尿嘧啶 顺铂)方案同步放化疗45例.比较单纯放疗组与同步放化疗组患者的3年生存率和不良反应,同时对同步放化疗三种不同化疗方案组的3年生存率及不良反应进行比较.结果:全组中位随访时间为42个月,单纯放疗组与同步放化疗组的3年生存率分别为65%和75%,两组比较差异有统计学意义(P=0.042).单纯放疗组Ⅲ～Ⅳ度急性毒副反应低于同步放化疗组(P<0.001),迟发性毒副反应两组差异无统计学意义(P=0.613).同步放化疗组BP方案、TP方案、FP方案的3年生存率分别为74%、80%和71%,三组间比较差异无统计学意义(P=0.792).三组Ⅲ～Ⅳ度急性及迟发性毒副反应发生率相似.结论:与单纯放疗相比,同步放化疗可明显提高ⅡB～ⅢB期宫颈癌患者的疗效.在同步放化疗三种不同的化疗方案中,紫杉醇联合卡铂方案组患者3年生存率略高于其他两种化疗方案,毒副反应可耐受,值得进一步研究.     

Combined-modality treatment for advanced oral tongue squamous cell carcinoma

PURPOSE: The aim of this study was to investigate prognostic factors in advanced-stage oral tongue cancer treated with postoperative adjuvant therapy and to identify indications for adjuvant concomitant chemoradiotherapy (CCRT). METHODS AND MATERIALS: We retrospectively reviewed the records of 201 patients with advanced squamous cell carcinoma of the oral tongue managed between January 1995 and November 2002. All had undergone wide excision and neck dissection plus adjuvant radiotherapy or CCRT. Based on postoperative staging, 123 (61.2%) patients had Stage IV and 78 (38.8%) had Stage III disease. All patients were followed for at least 18 months after completion of radiotherapy or until death. The median follow-up was 40.4 months for surviving patients. The median dose of radiotherapy was 64.8 Gy (range, 58.8-72.8 Gy). Cisplatin-based regimens were used for chemotherapy. RESULTS: The 3-year overall survival (OS) and recurrence-free survival (RFS) rates were 48% and 50.8%, respectively. Stage, multiple nodal metastases, differentiation, and extracapsular spread (ECS) significantly affected disease-specific survival on univariate analysis. On multivariate analysis, multiple nodal metastases, differentiation, ECS, and CCRT were independent prognostic factors. If ECS was present, only CCRT significantly improved survival (3-year RFS with ECS and with CCRT = 48.2% vs. without CCRT = 15%, p = 0.038). In the presence of other poor prognostic factors, results of the two treatment strategies did not significantly differ. CONCLUSIONS: Based on this study, ECS appears to be an absolute indication for adjuvant CCRT. CCRT can not be shown to be statistically better than radiotherapy alone in this retrospective series when ECS is not present.     

MRDWI联合CEA及SCC在子宫颈鳞癌同步放化疗疗效评估中的应用研究

目的 探索MRDWI中ADC值联合SCC、CEA值在宫颈癌同步放化疗疗效监测、预后评估中的应用价值。方法 选取2013—2016年经组织学或细胞学证实的宫颈鳞状细胞癌的初治患者 80例,FIGO分期Ⅱ_B期39例、Ⅲ_A期7例、Ⅲ_B期26例、Ⅳ_A期8例。入组后常规进行MRDWI检查及SCC、CEA检测,根据具体状况采取盆腔外放疗45~50 Gy+同步含铂化疗+后装治疗20~25 Gy,治疗结束后均进行MRDWI、SCC和CEA检查,比较治疗前后ADC值、SCC和CEA检查结果,其中40例于治疗中期予以ADC值、SCC和CEA检查。采用配对t检验或单因素方差分析。结果 80例入组患者经同步放化疗后整体有效率为100%,至治疗结束无患者出现疾病进展且总生存期均在6个月以上。疗后血清中SCC、CEA值较疗前降低(P=0.000、0.000),疗后ADC值较疗前升高(P=0.000)。疗后与疗前相比SCC、CEA值越低ADC值越高(P=0.000、0.000),预示宫颈癌同步放化疗疗效越好。结论 MRDWI联合SCC、CEA对宫颈癌同步放化疗疗效监测、预后评估具有较高的可靠性。     

中晚期子宫颈癌同步放化疗的临床疗效观察

目的 探讨同步放化疗治疗中晚期子宫颈癌的临床疗效.方法 选取中晚期子宫颈癌病例168例.将病理确诊为Ⅱ～Ⅳ期的84例作为放化组(A组),化疗用顺铂(DDP)每周40mg/m2,静脉滴注,同时配合止吐、水化等治疗,共3～4个周期.同时行根治性放疗:60Co-γ线体外照射,总剂量为50 Gy.腔内后装采用,'192>Ir后装机,A点7Gy/周,总剂量为42 Gy.以同期收治、条件相同行单纯放疗的中晚期子宫颈癌患者84例为对照组(B组),根治性放疗方法同A组.观察两近期疗效、2年生存率及放化疗并发症.结果 放疗3个月后,A组的有效率为92.85%(78/84);B组的有效率为79.76%(67/84),两组差异有统计学意义(χ2=6.10,P<0.05).A组2年生存率(83.95%)明显高于B组(60.98%)(χ2=9.4,P<0.005).A组局部复发率、远处转移率明显低于B组.A组虽有较明显的骨髓抑制、消化道反应,但均可耐受.结论 同步放化疗能明显提高中晚期子宫颈癌的生存率,应用DDP安全可行,不良反应患者可耐受,但远期疗效需进一步观察.