Beclin1进化保守区-SA融合蛋白偶联生物素-A10适配子制备PSMA靶向系统及其对前列腺癌细胞的抑制

目的:构建链霉亲和素(streptavidin,SA)与Beclin1进化保守区(evolutionary conserved district,ECD)融合蛋白原核表达载体,将融合蛋白与生物素-前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)特异性适配子A10偶联制备PSMA靶向系统,鉴定其促进PSMA+前列腺癌细胞凋亡及自噬的功能.方法:采用基因合成技术获得融合基因SA-ECD,克隆至PUC57载体鉴定无误后,再将其定向插入原核表达载体PET30a,IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blotting鉴定.按照生物素-A10∶ SA-ECD摩尔比为4∶1的比例制备PSMA特异性的偶联物即靶向系统,凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证SA-ECD与生物素的结合,流式细胞术、Western blotting、锥虫蓝染色分别检测靶向系统对前列腺癌细胞凋亡、自噬相关蛋白表达和细胞活力的影响.结果:双酶切及基因测序证实重组质粒PET30a-SA-ECD构建成功,IPTG诱导SA-ECD融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并经亲和凝胶层析成功纯化.EMSA实验证明SA-ECD能有效结合生物素-A10.靶向系统可促进PSMA+前列腺癌细胞凋亡和自噬,同时抑制癌细胞活力.结论:成功表达并纯化融合蛋白SA-ECD,构建的生物素-A10∶ SA-ECD靶向系统能够杀伤PSMA+前列腺癌细胞.     

骨肉瘤MG-63细胞中Polo样激酶2的表达和定位

目的：构建真核表达载体＊3 Flag-hPlk2并检测其在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法：以GST-hPlk2为模板,利用PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其克隆至含有＊3 Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察＊3 Flag-hPlk2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀法纯化hPlk2蛋白。结果：hPlk2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体＊3 Flag中,Western blot检测到＊3 Flag-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为80kDa。＊3 Flag-hPlk2在骨肉瘤MG-63细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hPlk2蛋白。结论：成功构建了＊3 Flag-hPlk2真核表达质粒,同时鉴定了＊3 Flag-hPlk2融合蛋白的表达,并纯化hPlk2蛋白。＊3 Flag-hPlk2蛋白主要定位在细胞质和核周。     

新基因NBEAL1的克隆、表达、纯化及其与胶质瘤病理分级的相关性

目的：构建新基因neurobeachin like 1（NBEAL1）的表达载体,研究NBEAL1 的表达与胶质瘤病理分级的相关性。方法：提取人脑胶质瘤细胞U251的总RNA,构建pGEX-KG/NBEAL1表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导NBEAL1重组蛋白的表达,GST亲和纯化,Western blotting鉴定重组蛋白的纯度;以免疫组化法用纯化蛋白制备的单克隆抗体分析NBEAL1表达与胶质瘤病理分级的相关性。结果：NBEAL1基因片段被成功地克隆入pGEXKG表达载体,测序证实克隆片段序列正确。NBEAL1融合蛋白在大肠杆菌BL21包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度95%以上。Western blotting证明所纯化的蛋白含有GST标签与NBEAL1肽段。免疫组化法检测显示NBEAL1蛋白的表达在正常脑组织中较低,而在低级别的脑胶质瘤组织中表达明显上调,但随着恶性程度增加NBEAL1的表达程度降低,两者呈负相关。结论：成功地克隆、表达及纯化NBEAL1蛋白,NBEAL1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达与其恶性程度呈负相关。     

3*Flag-hSesn1重组质粒的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

目的:构建3*Flag-hSesn1真核表达载体并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以GST-hSesn1为模板,利用聚合酶链反应扩增hSesn1基因cDNA全长,并将其克隆至3*Flag标签的真核表达载体中.将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到MG-63骨肉瘤细胞中,提取总蛋白进行Western blot检测.进一步利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hSesn1在MG-63细胞中的定位,使用免疫沉淀的方法纯化人源Sesn1蛋白.结果:hSesn1基因的cDNA全长成功构建到3*Flag标签的真核表达载体中,Western blot检测到了含有Flag标签的人源Sesn1融合蛋白表达,且在MG-63骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化人源Sesn1蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hSesn1真核表达质粒,同时鉴定了其融合蛋白的表达,并纯化人源Sesn1蛋白.3*Flag-hSesn1蛋白主要定位在细胞质,部分定位于细胞核周.     

骨肉瘤细胞中Sestrin2的表达和定位

目的:构建新型人源真核表达载体3*Flag-hSesn2并同时检测其在骨肉瘤细胞中的表达及定位.方法:以GST-hSesn2作为模板,利用聚合酶链反应扩增目的基因hSesn2的cDNA全长,并将其克隆到含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组质粒酶切并测序分析鉴定,转染至MG-63骨肉瘤细胞中,提取细胞总蛋白后进行Western blot检测重组蛋白表达.此外利用荧光共聚焦激光扫描显微镜检测3*Flag-hSesn2在MG-63细胞系中的定位,并最终利用免疫沉淀方法纯化人源Sesn2蛋白.结果:hSesn2基因cDNA全长成功构建于含有3*Flag标签的真核表达载体中,利用Western blot检测3*Flag-hSesn2融合蛋白表达,分子量约为55kDa.3*Flag-hSesn2在MG-63骨肉瘤细胞系中主要定位于细胞质及核周,进一步成功纯化了hSesn2蛋白.结论:成功的构建了含有3*Flag标签的人源Sesn2真核表达质粒,同时鉴定3*Flag-hSesn2融合蛋白的表达,最终成功纯化hSesn2蛋白.其中3*Flag-hSesn2蛋白主要定位在细胞质和核周.     

骨肉瘤细胞中Polo样激酶3的表达和定位

目的:构建新型人源真核表达载体3* Flag-hPlk3并同时检测其在骨肉瘤细胞U2OS中的表达及定位.方法:以GST-hPlk3作为模板,利用聚合酶链反应扩增人源Plk3目的基因eDNA全长,并将其克隆到含有3* Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序分析鉴定,并转染至U2OS骨肉瘤细胞系中,提取细胞总蛋白进行Western blot检测.同时利用荧光共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPlk3在U2OS细胞系中的定位,进一步利用免疫沉淀方法纯化人源Plk3蛋白.结果:hPlk3基因cDNA全长成功构建于含有3* Flag标签的真核表达载体中,Western blot检测3*Flag-hPlk3融合蛋白表达,分子量约为74kDa.3 * Flag-hPlk3在骨肉瘤细胞系U2OS中主要定位于细胞质及核周,并成功纯化了hPlk3蛋白.结论:成功的构建了含有3* Flag标签的人源Plk3真核表达质粒,同时鉴定3*Flag-hPlk3融合蛋白的表达,最终成功纯化hPlk3蛋白.3*Flag-hPlk3蛋白主要定位在细胞质和核周.     

3*Flag-hPlk4真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达和定位

目的:构建3*Flag-hPlk4真核表达载体,并证实重组表达载体在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法:以pGEX-4T-2-hPlk4为模板,利用聚合酶链反应扩增hPlk4基因cDNA全长,并将其克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到U2OS骨肉瘤细胞中,Western blot检测重组蛋白的表达.同时利用共聚焦激光显微镜观察3*Flag-hPlk4表达载体在U2OS细胞中的定位,进一步利用免疫沉淀的方法纯化人源Plk4蛋白.结果:hPlk4基因cDNA全长成功构建到3*Flag真核表达载体中,Western blot检测到含有3*Flag的人源Plk4融合蛋白表达,进一步在U2OS骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和细胞核周,并成功纯化hPlk4蛋白.结论:成功构建了3*Flag-hPlk4真核表达质粒,同时鉴定了融合蛋白的表达,并成功纯化人源Plk4蛋白.3*Flag-hPlk4蛋白主要定位在细胞质和细胞核周.     

乳腺癌特异性多肽介导的HSV-TK/GCV系统的构建及其靶向杀伤效应

目的:研究乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统对乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外靶向杀伤作用。方法:以PCR从质粒pORF-HSV-TK中扩增目的基因PI-TK,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-PI-TK载体,转化宿主菌,经IPTG诱导表达PI-TK融合蛋白,利用His-Tag对其进行纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白。将不同质量浓度的PI-TK融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,联合更昔洛韦(ganci-clovier,GCV)作用后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,CCK-8法检测MDA-MB-231细胞的增殖。结果:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-PI-TK,获得纯化的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE及Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白表达正确。单独PI-TK融合蛋白不影响MDA-MB-231细胞的形态和增殖,但PI-TK融合蛋白联合GCV能剂量依赖性靶向抑制MDA-MB-231细胞的增殖,200μg/ml PI-TK+10 mg/LGCV作用的抑制率达(68.9±7.57)%;PI-TK联合GCV抑制MDA-MB-231细胞的IC50值为152.64μg/ml。上述各作用对MDA-MB-435细胞均无影响(P<0.05)。结论:乳腺癌特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统可靶向杀伤MDA-MB-231细胞。     

VEGFR-3 siRNA对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的抑制作用

目的:探讨VEGFR-3对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的影响.方法:构建携靶向 VEGFR-3基因siRNA(small interfering RNA)表达载体,转染人结肠癌LoVo细胞, 半定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后LoVo细胞VEGFR-3 mRNA和蛋白表达的变化,基质-黏附实验检测细胞转染后的黏附能力,细胞侵袭实验检测转染后肿瘤细胞侵袭性的改变.结果: 携靶向VEGFR-3基因siRNA的表达载体成功构建,RT-PCR检测转染siRNA后LoVo细胞VEGFR-3 mRNA表达水平降低;Western blotting检测转染siRNA后72 h LoVo细胞VEGFR-3蛋白表达下降,其表达相对值由(1.26±0.19)降至(0.39±0.12)(P<0.05).转染siRNA 72 h后LoVo细胞的黏附能力显著下降[(0.626±0.047)vs (0.407±0.029), P＜0.05];LoVo细胞穿膜细胞数(6.38±3.25)明显低于空白对照组(24.82±3.44)、非特异性对照组(23.58±3.73) (P＜0.05).结论:siRNA能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应,下调VEGFR-3基因的表达,进而抑制LoVo细胞的黏附能力和侵袭性.     

hSesn3基因真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的蛋白表达和定位

目的:通过构建人Sesn3真核表达载体同时证实融合蛋白在细胞中的表达及定位.方法:提取Hela工具细胞的mRNA,反转录至cDNA.进一步通过PCR来扩增人Sesn3基因的cDNA全长片段,并将其亚克隆于pEGFP-C1真核表达载体中,进而将构建的重组质粒进行酶切及测序鉴定,转染到MG-63骨肉瘤细胞中,获取细胞总蛋白,通过Western blot方法检测表达.进一步利用激光共聚焦扫描显微镜方法观察MG-63细胞内pEGFP-hSesn3的定位,最后利用免疫沉淀方法纯化人源hSesn3蛋白.结果:hSesn3基因cDNA全长片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1 410 bp,并成功测序.Western blot检测到了GFP-hSesn3融合蛋白表达,分子量约为79 kDa.在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3主要定位于细胞质,进一步成功纯化了hSesn3蛋白.结论:成功构建了hSesn3基因cDNA全长的真核表达载体,在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3蛋白主要定位于细胞质,最终成功纯化了hSesn3蛋白.     

人黑色素瘤抗原MAGE-3 肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A *0201 转基因小鼠CTL活性的观察

 目的 通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗，并观察其对HLA-A＊0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法 用RT-PCR的方法，从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段，分别将其插入到pcDNA3．1／v5-His真核扣pET32a原核表达载体。将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达；将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况。并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。然后，采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HL-A＊0201转基因小鼠，LDH方法检测CTL活性。结果 酶切结果证实，成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体，并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达，原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体。用DNA疫苗进行初次免疫，镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后，可成功地诱导HL-A＊0201转基因小鼠CTL活性。结论 成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原，为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础。     

重组天花粉蛋白的原核表达、纯化及其对 宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

 目的克隆天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的cDNA, 构建原核表达TCS的质粒,从表达菌中分离纯化重组天花粉蛋白（rTCS）后,分析rTCS和nTCS（天然天花粉蛋白）对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法RT-PCR技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCS cDNA,测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+) 并转化入BL21(DE3)细胞。IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化rTCS蛋白, MTT法分别检测rTCS 和nTCS处理24、48和72h对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。结果1. 成功克隆获得TCS的cDNA并构建 pET-28a (+)-TCS原核表达质粒;该cDNA的碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源;2.在BL21(DE3)菌中,IPTG可诱导重组TCS蛋白表达,且表达的TCS主要以包含体的形式存在。在一定的时间范围内（0～8h）;rTCS的表达水平与诱导时间正相关;3.用Ni-NTA树脂亲和层析法,从诱导表达菌中获得了高纯度的重组TCS蛋白;4. MTT法分析表明,rTCS和nTCS均对HeLa宫颈癌细胞的生长具有抑制作用。在0～100μg/ml的浓度范围内,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长抑制率逐渐增大,且各组之间差异有统计学意义（P﹤0.05）;rTCS的IC₅₀小于nTCS。结论本实验克隆了TCS的cDNA,构建了表达载体pET-28a (+)-TCS,并成功地在E.coli中原核表达和纯化出重组TCS蛋白,发现纯化的rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长都有明显抑制作用,并且rTCS的细胞毒性小于nTCS。     

Preparation and preliminary characterization of rabbit monoclonal antibodies against human midkine

We prepared rabbit monoclonal antibodies that target human midkine (MK). The MK gene was amplified by PCR from the plasmid pEGFP-MK and subcloned into the prokaryotic expression vector pGEX-1λT to generate an N-terminally glutathione S-transferase (GST)-tagged fusion protein construct. Expression of the GST-MK fusion protein was achieved by IPTG induction in Escherichia coli cells. The expressed protein was purified using the GST system. After verifying purification, the fusion protein was used to immunize rabbits to prepare monoclonal antibodies against human MK by the rabbit hybridoma technique. The hybridomas generated were screened by an enzyme-link immunoassay (ELISA) for specificity, which was further characterized by Western blotting and ELISA. SDS-PAGE analysis showed that the purified protein corresponds to the calculated molecular weight. The GST-MK fusion protein was prepared. At least one hybridoma cell line secreting anti-MK MAb was obtained. Western blotting analysis confirmed the identity of the MAb. The titer of the MAbs measured by an indirect ELISA was 1:64,000. The affinity constant, which was measured by a non-competitive ELISA, was found to be 3.0?×?10(9) M(-1). Western blotting and immunohistochemistry analysis showed that the produced MAbs bind to the MK protein in cancerous tissues. The GST-MK fusion protein was successfully expressed and purified. The MAbs against MK were subsequently prepared, which should further aid research and the application of MK MAbs in clinical settings.     

人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用.本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a( )中.进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性.结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a( )载体中,经酶切与测序鉴定完全正确.此重组质粒转化人大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr 70 000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%.经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%.结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达:蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡.     

Expression, antibody generation, and biological analysis of chicken interleukin-18

The gene encoding mature chicken interleukin-18 (ChIL-18) was cloned into prokaryotic expression vector pET-30a(+), resulting in a recombinant plasmid pET-30a-ChIL-18. After pET-30a-ChIL-18 was transformed into Escherichia coli Rosseta, the expression of ChIL-18 induced by 1 mM IPTG at 37°C was analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The expressed fusion protein of 26 kDa was purified with a Ni-NTA affinity column and used to generate a hyperimmune antiserum in a rabbit. The specificity and titer of anti-ChIL-18 serum were analyzed by the enzyme-linked immunosorbent assay. Western blot and immunofluorescence assays indicated that the anti-ChIL-18 antibody specifically reacted with the ChIL-18 expressed from E. coli or ChIL-18-transfected eukaryotic cells. Moreover, the renatured ChIL-18 stimulated the production of nitric oxide (NO) from macrophages via eliciting the secreting of IFN-γ from lymphocytes.     

GST-hDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定

 目的　构建GST hDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GST hDaxx融合蛋白 ,并研究其与 p5 3的结合能力。方法　构建GST hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX 4T/hDaxx ,在大肠杆菌 (E .col i)中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后 ,Westernblot鉴定表达产物与纯化物。通过共免疫沉淀反应与Westernblot观察hDaxx与p5 3的结合反应。结果　在原核细胞中成功表达了GST hDaxx融合蛋白 ,hDaxx与 p5 3可发生共免疫沉淀反应。 结论　 1.GST hDaxx融合蛋白成功表达 ;2 .hDaxx和 p5 3的相互结合提示它们可能与肿瘤的发生有关。     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

细胞凋亡相关新基因Apr-3的一个转录剪接体的克隆、初步表达及纯化

目的克隆Apr-3基因的一个转录剪接体,进行原核表达,并进行初步纯化。方法培养HL-60细胞,提取HL-60细胞总RNA,应用RT-PCR获取Apr-3编码区cDNA序列的前366bp,将该cDNA与质粒pcDNA3.0连接,构建克隆载体,将其转化E.coliDH5α,进行测序,与GenBank中登录序列比对,结果正确后将该cDNA与质粒pET28a连接,构建原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达获得Apr-3蛋白。结果对测序结果进行序列分析,与GenBank中登录的Apr-3编码区完全一致。Apr-3融合蛋白主要以包涵体形式存在。结论成功构建了Apr-3的原核表达载体,获得了较纯的Apr-3融合蛋白。