淋球菌gyrA和parC基因突变与氟喹诺酮类药物关系的研究

目的：探讨淋球菌gyrA和parC基因突变与淋球菌耐氟喹诺酮类药物之间的关系。方法：①纸片扩散法检测58株淋球菌对5种氟喹诺酮类药物的敏感性。②E测定法定量检测环丙沙星的最小抑菌浓度（MIC）。③PCR技术扩增gyrA和parC基因的喹诺酮耐药决定区（QRDR）相关序列并作测序分析。结果：①对环丙沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、洛美沙星、依诺沙星同为敏感、中介、耐药者分别为2株、4株和39株。②环丙沙星MIC为敏感、中介、耐药分别为2株、17株和39株。③环丙沙星MIC为0．004－0．016μg/mL的2株淋球菌gyrA和parC基因均未发生突变；MIC为0．064－0．094μg/mL的菌株仅发生gyrA单位点突变；而MIC≥0.25μg/mL的菌株均发生gyrA双位点突变。MIC≤0．25μg/mL的菌株无parC基因突变，而MIC≥1.0μg/mL的菌株除出现gyrA双位点突变外均同时发生parC单位点突变。④在发生突变的16株菌中，Ser91(TCC)→Phe(TTC）突变为15株。结论：①gyrA基因突变介导淋球菌对氟喹诺酮类药物低和中水平耐药，而对氟喹诺酮类药物高水平耐药需要parC基因突变的共同参与。②gyrA基因Ser91→Phe的突变是导致淋球菌对氟喹诺酮类药物耐药的关键突变。     

淋球菌rpsE基因突变与大观霉素耐药性的研究

目的 探讨淋球菌rpsE基因突变与淋球菌大观霉素耐药的相关性。 方法 对临床分离的4株大观霉素耐药的淋球菌株（MIC128 μg/ml、256 μg/ml）的rpsE基因进行PCR扩增测序分析,寻找可能的突变位点,通过DNA转化技术将含有突变基因的细菌基因组DNA转化入敏感的淋球菌株,检测转化成功的淋球菌的MIC并进行PCR扩增测序,分析发现的突变位点与淋球菌大观霉素耐药的相关性。 结果 4株大观霉素耐药的菌株均发现rpsE基因A70C（Thr24Pro）突变,而16S rRNA大观霉素耐药决定区（SRDR）未发现任何突变;大观霉素敏感菌株的16S rRNA和rpsE基因均未发现突变。转化后获得的大观霉素耐药淋球菌中亦发现了同样的rpsE基因突变。 结论 rpsE基因单点突变与淋球菌对大观霉素耐药相关。     

应用PCR技术快速检测淋球菌

自淋球菌４．２Ｋｂ质粒ｐＪＤｌ基因序列选择一对引物序列合成引物，ＰＣＲ扩增产物为２３０ｂｐ片段。经３０次循环后，最低可检出１０ＣＦＵ。特异性试验结果表明，这对引物与白念珠菌有部分同源性，ＰＣＲ扩增产物小于７５ｂｐ。与脑膜炎奈瑟菌及其他１３种常见的细菌、４种念珠菌、沙眼衣原体、解脲支原体、正常女性宫颈分泌物中的细菌均无同源性。临床标本检测结果表明，与涂片法和培养法相比较，阳性检出率可达１００％。试验表明，应用本方法可直接快速检测分泌物中的淋球菌。     

DNA芯片检测泌尿生殖道病原体及耐药的研究

目的 研制一种DNA芯片,结合多重PCR方法快速检测泌尿生殖道炎症3种病原体及其耐药类型。方法 根据泌尿生殖道病原体淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体的基因保守序列设计引物和探针,分别检测3种病原体;根据淋球菌gyrA、parC和16srRNA基因序列突变位点设计引物和探针,分别检测淋球菌对喹诺酮类药物和大观霉素的耐药性;根据淋球菌和解脲脲原体的共同tetM基因序列设计引物和探针,检测对四环素的耐药性。制备芯片,对152份泌尿生殖道拭子提取DNA进行7重PCR扩增,并且Cy5荧光标记包含上述基因序列的目的DNA片段,与固定在芯片上的探针杂交,芯片信号分析系统Scanarray 4000在635nm处扫描并分析结果,并与临床检查结果比较。结果 DNA芯片敏感性是0.01fg质粒DNA。152份泌尿生殖道炎症拭子其病原体种类及其耐药类型全部可用DNA芯片检测出来,与目前临床检查结果有较好的一致性(K>0.8)。结论 研制的DNA芯片结合7重PCR方法快速检测泌尿生殖道淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体3种病原体及其对喹诺酮类药物、大观霉素和四环素的耐药类型,具有快速、高特异性和高灵敏度,可以应用于临床检测。     

淋球菌多抗原序列分型方法研究进展

淋球菌分型研究包括表型分型和基因分型研究.淋球菌多抗原序列分型方法是一种基于测序的、应用前景广阔的基因分型方法,其检测标本不仅可以是茵培养物,还可以直接用于拭子标本的分型研究.PCR分别扩增两个编码淋球菌外膜蛋白基因(por和tbpB)的高变区,PCR扩增产物测序后与淋球菌多抗原序列分型方法网站比对以获取菌株的基因型.淋球菌多抗原序列分型方法具有操作简单、结果客观、国内外实验室间结果可比性等优势,该方法已经在预测淋球菌耐药性、分析性网络、鉴定特殊菌株爆发和流行等方面广泛应用.     

淋球菌对头孢菌素类药物敏感性的检测

目的评估药敏纸片琼脂扩散法（K-B法）检测淋球菌对三代口服头孢菌素类药物敏感性的符合率。方法中国医学科学院皮肤病研究所性病科门诊收集的100株淋球菌临床分离菌株。采用K-B法检测淋球菌对头孢克肟、头孢泊肟、头孢布坦3种药物的敏感性;Etest法检测淋球菌对头孢克肟、头孢泊肟的敏感性;最低抑菌浓度琼脂稀释法（MIC法）检测淋球菌对头孢布坦的敏感性。结果K-B法和Etest法对头孢克肟敏感菌株的检测率分别为92．0％和100％;K-B法和Etest法对头孢泊肟敏感菌株的检测率分别为94．9％和100％;K-B法和MIC法对头孢布坦敏感菌株的检测率分别为93．0％和95．3％。结论K-B法对3种药物敏感菌株的检测率与Etest或MIC法检测结果差异无统计学意义。     

耐药淋球菌差异DNA消减文库的构建及初步筛选

目的 克隆和研究耐药性淋球菌相关基因。方法 从耐药淋球菌株RSM292C4和淋球菌标准参考菌株WHO-A细胞中提取DNA,经RsaⅠ酶切后,应用抑制性消减杂交技术构建耐药性淋球菌差异DNA消减文库并进行初步筛选。结果 耐药淋球菌差异DNA消减文库经扩增获得约2500个白色克隆,随机挑取96个白色克隆,进行PCR扩增鉴定,发现克隆中插有100~600bp大小的片段。分别以RsaI酶切样本和参照DNA为探针,与随机挑取的96个白色菌落质粒作点杂交,有5个克隆仅能与样本DNA探针杂交,而不能与参照DNA探针杂交,表明它们为RSM292C4基因组DNA所特有,可能代表某些淋球菌新基因。对这5个克隆插入的DNA片段进行测序,经送基因库和淋球菌基因组部分测序基因库检索分析,发现5个片段均为未知新序列。结论 淋球菌耐药菌株DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆淋球菌耐药的新基因奠定了基础。     

淋球菌染色体mtrR基因突变对淋球菌多重耐药性的影响

目的 对淋球菌的染色体耐药机理进行了一定的探索。方法 聚合酶链反应及Sanger双脱氧链终止法,测定淋球菌mtrR基因的碱基序列,并做相应淋球菌的药敏试验。结果 具有青霉素耐药性的淋球菌毫无例外都有mtrR基因的单碱基突变,而耐壮观霉素的淋球菌在mtrR基因上有两个位点突变。结论 淋球菌染色体上mtrR基因的突变会引起淋球菌多重耐药性的产生,增加淋球菌对脂溶性细胞毒因子如脂溶性抗生素、去污剂类脂肪酸的抗性。     

淋球菌对大观霉素耐药基因的初步检测

【摘要】 目的 检测导致大观霉素耐药的淋球菌16S rRNA基因中的突变位点。 方法 对6株大观霉素耐药淋球菌［最小抑菌浓度（MIC） ≥ 128 mg/L］、20株大观霉素敏感菌株（MIC 32 mg/L和16 mg/L各10株）的16S rRNA基因进行DNA扩增和序列测定,分析16S rRNA基因突变情况。 结果 6株大观霉素耐药淋球菌的16S rRNA基因均发生了突变,其中2株（MIC > 256 mg/L）为C1192T突变,1株（MIC 256 mg/L）为C1344T和T1345A突变,1株（MIC 256 mg/L）为T990G和T991C突变,1株（MIC 128 mg/L）为T990G、G1343C和C1344T突变,1株（MIC 128 mg/L）为T991C突变。20株大观霉素敏感菌株均未发生突变。 结论 淋球菌16S rRNA基因不同位点突变可能与大观霉素不同程度的耐药相关,C1192T突变可能导致高度耐药,其他单一位点或多位点突变与不同程度的耐药相关。 【关键词】 奈瑟球菌,淋病; 壮观霉素; 点突变; RNA,核糖体,16S; 抗药性,细菌     

基因芯片技术检测生殖器溃疡性性病病原体

目的建立检测引起生殖器溃疡性性病病原体的基因芯片技术。方法设计并合成各病原体特异性探针，用点样仪将合成的特异探针点于玻片介质上，并经过点样后处理制备成基因芯片；荧光标记各病原体标准株及临床标本的特异靶基因，进行基因芯片杂交、扫描并分析结果。结果各病原体均可见特异的基因芯片荧光杂交信号：单一病原体出现一种特异荧光信号；混合病原体的不同组合出现相应组合的特异荧光信号。对40例生殖器溃疡临床标本进行芯片杂交检测，并与暗视野显微镜 聚合酶链反应(PCR)及HSV培养 PCR结果比较，具有较好的一致性(K值分别为0．882和0．947)。另外发现混合感染2例。结论本研究初步建立的基因芯片技术具有准确、特异及同时检测多重感染的特点。     

营养分型法对淋球菌流行菌株的监测

对１９９３～１９９４年南京地区分离的淋球菌菌株进行营养分型研究，发现Ｐｒｏ－和Ｐｒｏｔｏ占绝大多数，达９５％以上。营养型的构成与１９８９～１９９０年分离的菌株是一致的。这表明当前本地流行株的特点与几年前相同。     

检测泌尿生殖道感染常见性病病原体基因芯片的构建

目的 建立检测泌尿生殖道性传播感染常见病原体的基因芯片技术。方法 首先将9种目的病原体分为病毒、细菌及低级真核生物三类,分别设计1对荧光标记的通用引物,利用多重PCR技术使3对引物置于同一反应体系进行扩增,再将特异性探针点样于玻片上制备成基因芯片,与扩增产物进行杂交、扫描并分析结果。结果 单重PCR和多重PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳均可见相应的阳性条带。扩增产物与基因芯片杂交后扫描,各病原体均可见荧光信号,与所对应的特异性探针位置相吻合。结论 本研究初步构建的基因芯片技术具有特异、灵敏、快速及能一次性同时检测多种病原体的特点。     

脉冲场凝胶电泳及随机扩增多态性DNA对淋球菌的基因分型

目的　评价脉冲场凝胶电泳限制性内切酶分析 (PFGE REA)及随机扩增多态性DNA (RAPD )分析对淋球菌分离株进行基因分型的能力。方法　 3 6株淋球菌分离株基因组DNA以SpeⅠ酶切及脉冲场凝胶电泳。并以随机引物OPA 0 3对 3 6株菌进行RAPD分析。结果　PFGE REA在 3 6株菌中产生 1 2～ 1 9个DNA片段 ( 5～ 6 0 0kb) ,区分出 2 0种PFGE型。以OPA 0 3扩增淋球菌DNA ,获得 1 5个不同的DNA片段( 2 80～ 1 90 0bp)。每株菌有 3～ 9个片段。 3 6株菌呈现 1 8种RAPD型。研究表明 ,PFGE REA与RAPD可区分属相同营养型及抗生素谱的菌株 ,二种方法分型结果总的趋向一致。不同地区的分离株甚至同一地区的某些分离株存在相当大的DNA多态性。具相同或十分相似基因型的菌株为某一特定地区所特有。认为PFGE REA及RAPD是鉴别淋球菌临床分离株有用而敏感的分子技术 ,有助于了解菌株来源、菌株间的克隆相关性及抗生素耐药性的传播。与PFGE REA相比 ,RAPD分析相对快速、简便和经济     

淋球菌mtrR调控区突变片段的体外重组和鉴定

目的:体外重组一段突变DNA片段,用其转染临床淋球菌株,产生特异位点-mtrR调控区突变的转染株。方法:采用基因剪接的技术,通过两步PCR反应完成DNA片段的体外定点突变,突变的EF片段用于后续淋球菌转染实验。结果:经重组的EF分子与淋球菌基因组DNA的相应片段并不完全匹配,测序结果显示,对应mtrR起始密码子上游第45位到第54位碱基之间有9 bp大小的片段缺失。结论:证实EF分子即为预期设计的突变DNA片段。     

淋病奈瑟菌mtrR基因启动子区的IR区碱基缺失与其耐药性关系的研究

目的探索淋病奈瑟菌(NG,简称淋球菌)多传递耐药系统R基因(m trR)启动子区反向重复序列(IR)区基因缺失与淋病奈瑟菌染色体所介导的耐药性的关系。方法以琼脂稀释法做药物敏感试验,选择临床敏感株采用自身配对法以次抑菌浓度法诱导筛选出对不同抗生素耐药的淋球菌株,以聚合酶链反应(PCR)扩增包含IR区在内的目的基因后,对扩增产物测序,并将其IR区基因突变与临床分离自然耐药株比较。结果8株敏感株及24株单独耐1种药物菌株及1株诱导的多重耐药株无IR区基因突变,7株诱导多重耐药菌株IR区有碱基A/T缺失,与自然多重耐药株两者相比较碱基缺失无差异。结论淋球菌染色体IR区基因缺失与单独耐一种药物菌株产生无关,IR区基因缺失参与了淋球菌多重耐药株的产生,人工诱导的多重耐药株与自然多重耐药株IR区碱基突变无差异。     

DNA芯片技术在诊断恶性黑素瘤中的应用

人类基因组序列的研究成功,为基因组功能分析奠定基础.而DNA芯片技术允许同时检测上千个基因,成为基因组功能分析的方法之一.从正常的黑素细胞、非典型痣、原位黑素瘤到侵袭性黑素瘤的发展过程,使恶性黑素瘤成为使用DNA芯片技术研究肿瘤发病机制的模型.使用DNA芯片技术根据恶性黑素瘤基因表达谱的不同,对恶性黑素瘤进行新的分型,发现恶性黑素瘤形成过程中的基因表达异常、染色体变异及与恶性黑素瘤转移相关的基因等.