小干扰RNA特异性沉默CD44基因对羧甲基壳聚糖保护大鼠软骨细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默大鼠软骨细胞的CD44基因后对细胞CD44基因表达的抑制作用及对软骨细胞在羧甲基壳聚糖(CMCS)作用下细胞生物学特性变化及其作用机制.方法 构建针对CD44基因特异性的siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),LipofectamineTM 2000转染软骨细胞.通过免疫荧光鉴定CD44基因特异性siRNA(CD44-siRNA)的转染情况,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法检测CD44-siRNA转染细胞中CD44基因及蛋白的表达情况;通过硝普钠诱导软骨细胞凋亡并通过流式细胞技术检测CMCS对硝普钠诱导正常及经CD44-siRNA转染软骨细胞凋亡的影响.采用单因素方差分析及SNK-q检验对结果进行统计学分析.结果 免疫荧光检测发现CD44-siRNA成功转染进入软骨细胞,转染率在60％左右.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA-1后的24、48及72 h,与空白对照组(0.429±0.053,0.501±0.037,0.341±0.009)相比,CD44的mRNA表达明显减弱(分别为0.198±0.007,0.211±0.016,0.153±0.005;q=5.93,7.01,11.23; P＜0.01).蛋白印迹法检测表明转染siRNA-1后24 h,与空白对照组相比,CD44的蛋白表达明显减弱(0.231±0.064与0.675±0.113,q=13.09,P＜0.01).流式细胞检测结果表明3 mmol/L硝普钠可以成功诱导软骨细胞发生早期凋亡[(70±6)％];50、100、200μg/ml CMCS对硝普钠诱导的凋亡有一定的抑制作用[凋亡率分别为(51±7)％,(30±4)％,(15±4)％;q=5.08,6.97,9.73;P＜0.01];但CMCS对硝普钠诱导的CD44-siRNA-1转染的软骨细胞的凋亡抑制作用比未转染组明显减弱[凋亡率分别为(34±6)％和(15±4)％,q=6.95,P＜0.01 ].结论 CD44特异性siRNA-1转染体外培养的大鼠软骨细胞能显著下调CD44基因的表达;CD44基因在CMCS保护硝普钠诱导软骨细胞凋亡中发挥重要的作用.     

经门静脉骨髓基质细胞移植治疗肝纤维化

目的: 探讨移植骨髓基质细胞(BMSCs)减轻小鼠肝纤维化的作用.方法: BALB/c小鼠BMscs分离培养及经门静脉移植到BALB/c小鼠肝脏,二乙基亚硝胺诱导肝纤维化.60只小鼠随机分为对照组.模型组及治疗组.3 mo后测定ALT、AST、透明质酸酶(HA)和层黏连蛋白(LN)浓度,及肝脏羟基脯氨酸(Hyp)含量.免疫组化检测肝脏a.平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,及荧光原位杂交鉴定移植的BMSCs向肝细胞的分化.结果: BMsCs在添加肝细胞生长因子(HGF)的培养基中体外培养能分化为肝细胞样细胞.与模型组相比.移植BMscs能显著降低血清ALT、AST、HA和LN的水平以及肝脏Hyp含量和α-SMA的表达(208±44 U/L 341±66 U/L,372±84 U/L vs 506±81 U/L,289±74μg/L vs 362±83 μg/L,178±48 μg/L vs 232±63 ug/L,900±141 mg/g liver vs1255±205mg/g liver,,均p<0.01).荧光原位杂交显示DEN诱导的损伤肝脏中有骨髓来源的肝细胞,3 mo后10%的肝细胞来源于BMSCs.结论: 在肝纤维化模型中,经门静脉移植的BMscs能分化为肝细胞,有效地恢复肝功能和减轻肝纤维化.     

内生多肽Elafin对气道黏蛋白5AC表达的影响

目的 探讨内生多肽Elafin调节气道黏液高分泌的分子机制.方法 构建人 Elafin 重组质粒,原代培养正常人支气管上皮细胞 HBE16,分为对照组、香烟抽提物(CSE)刺激组、CSE 刺激+转染重组质粒、CSE 刺激+空质粒组、单纯转染重组质粒以及空质粒组6组.四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞活力,Western blot法检测p-JNK、p-ERK、p-P38和IκBα蛋白含量,荧光素酶报告基因系统测定激活蛋白-1(AP-1)及核转录因子-κB(NF-κB)活性,RT-PCR检测各组黏蛋白(MUC)5AC mRNA 表达水平,ELISA 法分析各组细胞 MUC5AC 蛋白的相对含量.结果 CSE刺激组的p-JNK、p-ERK、p-c-Jun、IκBα、AP-1、NF-κB、MUC5AC和MUC5AC mRNA 含量分别为(0.55±0.03)μg/mg、(0.64±0.06)μg/mg、(0.60±0.07)μg/mg、(0.27±0.03)μg/mg、7.49±0.31、4.42±0.22、(0.71±0.04)mg/L和0.81±0.04,与对照组的(0.26±0.02)μg/mg、(0.30±0.05)μg/mg、(0.19±0.04)μg/mg(0.61±0.04)μg/mg、2.54±0.22、2.37±0.16、(0.23±0.02)mg/L和0.32±0.03比较差异有统计学意义(均P＜0.05).转染重组Elafin后再给予CSE刺激,p-JNK、p-ERK、p-c-Jun、IκBα、AP-1、NF-κB、MUC5AC和MUC5AC mRNA含量分别为(0.38±0.04)μg/mg、(0.31±0.04)μg/mg、(0.14±0.03)μg/mg、(0.54±0.03)μg/mg、2.60±0.19、2.55±0.21、(0.28±0.03)mg/L、0.35±0.05,与CSE组相比差异有统计学意义(均P＜0.05);p-P38蛋白含量在CSE刺激及转染Elafin前后无明显变化.结论 内生多肽Elafin可降低JNK和ERK磷酸化水平并抑制IκBα蛋白降解,从而降低转录激活蛋白-1和核因子-κB的活性,下调黏蛋白5AC的高表达,而p38MAPK在其中的作用并不明显.     

应用转染BMP7基因组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损观察

目的 构建转染骨形态发生蛋白-7(BMP7)基因组织工程软骨,观察对家兔膝关节软骨缺损的修复作用.方法 将转染BMP7基因的软骨细胞(5×109个/L)接种于胶原-纤维蛋白凝胶的支架中,培养14 d后移植于家兔膝关节软骨表面,直径为5.0 mm,深达软骨下骨板的全层软骨缺损部位.移植后4、8、12周处死家兔,通过创面形态观察、组织形态的光镜观察、BMP7基因在移植部位的表达,评价转染BMP7基因组织工程软骨对兔膝关节软骨缺损的修复作用.结果 转染BMP7和未转染BMP7基因组织工程软骨培养物的体积分别为9 mm × 9 mm×2 mm和8 mm×8 mm×2 mm.转染BMP7基因组移植于家兔膝关节软骨后4、8、12周,均有软骨缺损修复作用,且移植部位有红褐色BMP7 mRNA和棕红色BMP7蛋白表达.移植后12周修复效果佳.优于未转染BMP7基因组.结论 转染BMP7和未转染BMP7基因组织工程软骨对兔膝关节软骨缺损均有修复作用,但转染BMP7基因组织工程软骨修复作用更强.     

白细胞介素10基因修饰的骨髓间充质干细胞抑制大鼠肝纤维化形成的实验研究

目的 观察pcDNA3.0-白细胞介素10 (IL-10)真核表达质粒电穿孔转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)对肝纤维化的治疗效果. 方法 分离纯化大鼠BMSCs,并进行4,6-二脒基-2-苯基吲哚标记;将60只雄性Wistar大鼠随机分为A、B、C三组,每组20只.采用皮下注射四氯化碳(CCl4)方法建立肝纤维化模型.A组、B组大鼠在造模的同时分别尾静脉注射pcDNA3.0-IL-10-BMSCs和BMSCs细胞悬液1ml,其细胞密度为1×10个／ml,每周2次,共8周;C组大鼠尾静脉注射1ml磷酸盐缓冲液.8周后处死大鼠,取肝组织:冰冻切片,观察标记细胞;Masson染色观察纤维化情况;Westem blot检测IL-10表达量;ELISA法检测肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量;碱水解法检测羟脯氨酸(HYP)含量.使用SPSS13.0统计软件包进行方差检验,各实验组间两两比较采用q检验.结果 CCl4诱导8周后,Masson染色显示模型鼠大部分形成中度以上肝纤维化;标记的细胞在A组、B组肝组织中均被观察到;纤维化评分和HYP含量:C组分别为(3.15±0.96) μg/mg和(1.89±1.03)μg／mg、A组分别为(1.01±0.35) μg/mg和(0.73±0.29) μg/mg、B组分别为(1.34±0.65)μg/mg和(1.21±0.78) μg/mg,大鼠的肝纤维化程度A组和B组比C组明显减轻,A组比B组程度轻,q值分别为-10.02、-5.01、8.21、4.82和-4.73,尸值均＜0.01,差异有统计学意义;TNF-α含量在A组为(275.21±86.35) pg/mg、B组为(321.76±98.49) pg/mg、C组为(476.23±126.43)pg／mg,A组和B组均低于C组,A组低于B组,q值分别为-12.86、-8.96和-7.43,P值均＜0.01,差异有统计学意义.结论 应用pcDNA3.0-IL-10-BMSCs能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维.     

微小RNA-320在缺氧诱导的大鼠神经细胞中的表达和功能研究

目的研究微小RNA-320(microRNA-320,miR-320)在缺氧诱导的大鼠PC12细胞的表达特征,并探讨其对PC12细胞增殖和凋亡的影响。方法采用荧光定量PCR检测常氧组和缺氧诱导组PC12细胞中miR-320表达情况;转染miR-320 mimics(实验组)和mimics control(对照组)至缺氧诱导的PC12细胞,采用细胞增殖实验和ELISA法观察细胞增殖和凋亡情况。结果缺氧诱导组PC12细胞中miR-320表达显著低于常氧组(0.27±0.14vs 1.01±0.21,P0.05)。实验组细胞内源性miR-320表达显著高于对照组(6.57±0.92 vs 1.54±0.21,P0.05)。对照组PC12细胞24、48和72h增殖率分别为(11.57±3.21)%、(14.39±3.57)%和(17.28±4.49)%,实验组分别为(19.15±4.02)%、(24.20±5.12)%和(29.36±5.78)%。对照组PC12细胞中Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达量分别为(1.67±0.52)μg/L、(2.15±0.24)μg/L和(4.66±0.79)μg/L,实验组分别为(3.01±0.77)μg/L、(0.33±0.04)μg/L和(1.59±0.46)μg/L,2组比较有显著差异(P0.05)。结论 miR-320在缺氧诱导大鼠PC12细胞呈现低表达,体外升高其表达具有促进缺氧诱导PC12细胞增殖并抑制凋亡的功能。     

透明质酸对体外培养大骨节病软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的 通过观察透明质酸(HA)对体外培养的大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)软骨细胞增殖、凋亡的影响,为临床上HA治疗KBD提供实验依据.方法 依据<大骨节病诊断标准>(GB 16003-1995)收集KBD患者和遭遇意外事故的病人(对照组)关节软骨,分离、体外培养关节软骨细胞.选用第2代细胞进行实验.两组软骨细胞分别给予不同剂量的HA,按HA剂量分为0、100、500 mg/L组.通过二苯甲唑溴盐(MTT)实验,测定第2、4、6天HA对KBD组、对照组软骨细胞增殖的影响.并通过流式细胞检测观察HA对软骨细胞凋亡的影响.结果 对照组在第4天时,500 mg/L组(0.140 ±0.049)促软骨细胞增殖作用大于0 mg/L组(0.116±0.021);KBD组在第6天时,500 mg/L组(0.179±0.081)与0 mg/L组(0.128 ±0.017)比较,显示了明显的促增殖作用(P<0.05).KBD组细胞凋亡率100、500 mg/L组(10.458±1.143、7.877±1.346)均较0 mg/L组(12.860±2.159)下降(P<0.05);对照组500 ms/L组(4.045±1.204)较0 mg/L组(7.128±1.244)细胞凋亡率下降(P<0.05).结论 HA对KBD软骨细胞具有促进增殖和抑制软骨细胞凋亡的作用,其中500 mg/L的HA改善KBD软骨细胞代谢的作用较100 mg/L明显.     

不同浓度转化生长因子β1体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的:研究不同浓度转化生长因子-β1(TGF-β1)在体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的能力。方法:取SD大鼠四肢骨骨髓,密度梯度离心法分离大鼠BMSCs,以TGF-β1 5μg/L(低剂量组)、10μg/L(高剂量组)对第3代BMSCs进行体外诱导,未诱导的骨髓间充质干细胞做对照。相差显微镜观察细胞形态,MTS试剂盒检测细胞活性。分化14天后,流式细胞仪分析三组细胞DNA周期;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin,c Tn I)、心肌平滑肌肌动蛋白(aactin)和心肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)的表达率。结果:三组细胞均呈对数生长趋势,诱导组细胞数量增长较对照组缓慢(P0.05),诱导组之间比较,细胞增长无明显差异。分析细胞DNA周期显示:诱导14天后,对照组增殖指数明显高于诱导组(P0.05),不同浓度诱导组之间比较,细胞增殖指数无明显差异。免疫荧光法检测结果显示:诱导14天后,诱导组细胞均部分表达c Tn I、α-actin及MHC,TGF-β1高剂量组细胞转化率高于低剂量组;对照组均不表达c Tn I、α-actin及MHC。结论:10μg/L TGF-β1与5μg/L TGF-β1比较,更有效促进BMSCs体外向心肌样细胞分化,且对细胞增殖活性无明显影响。     

腺病毒介导的受体活性修饰蛋白-1基因对兔心肌梗死后炎症因子及心肌纤维化的影响

目的 观察腺病毒介导的受体活性修饰蛋白-1 (RAMP1)基因对心肌梗死后心肌纤维化的影响及其作用机制. 方法 建立兔心肌梗死模型,随机分为RAMP1转染组、空载病毒载体组(空载病毒组)和PBS组;模型建立后40 min经局部注射带绿色荧光蛋白报告基因的RAMP1重组腺病毒载体(pAd2-EGFP-RAMP1)和空病毒载体及PBS到心肌梗死交界区,病毒注射后7d、14 d和28 d处死动物取心脏标本,应用Western blot检测心肌组织局部NF-κB表达,Masson染色检测心肌梗死边缘区胶原含量.应用ELISA法测定心肌梗死模型建立前及病毒注射后血清TNF-a浓度,心脏超声心动图检测病毒注射后28 d心功能. 结果 病毒注射后7d,RAMP1转染组局部心肌组织RAMP1表达量为(67.33±3.97)％,较空载病毒组(20.59±3.26)％和PBS组(23.80±5.08)％明显增加(P＜0.05).病毒注射后7d,与空载病毒组(62.60±6.18)％和PBS组(62.95±5.17)％比较,RAMP1转染组心肌局部NF-κB表达下降(26.54±5.13)％(P＜0.05).与空载病毒组和PBS组比较,RAMP1转染组不同时间点血清TNF-a表达减少[7d:(136.74±5.42)μg/L比(196.97±14.17)μg/L,(203.67±13.90)μg/L;14 d:(154.51±13.61) μg/L比(112.22±6.74)μg/L,(160.46±14.27)μg/L;28 d:(51.10±5.62)μg/L比(95.55±9.94)μg/L,(98.96±12.68)μg/L,均P＜0.05].梗死边缘交界区心肌胶原纤维含量,与空载病毒组和PBS组比较,RAMP1转染组14 d和28 d心肌胶原纤维含量降低[14 d:(7.10±0.98)％比(19.52±2.32)％,(17.91±0.96)％;28 d:(17.04±2.44)比(34.10±5.59)％,(33.98±4.33)％,均P＜0.01].梗死后28d RAMP1转染组梗死面积(26.54±5.13)％较EGFP组(32.20±3.73)％和C组(35.58±2.65)％缩小(P＜0.01),心功能改善也优于空载病毒组和PBS组(P＜0.01). 结论 外源性RAMP1基因转染可能通过抑制局部NF-κB活性,下调炎性细胞因子TNF-a等表达,部分阻断了梗死后促纤维化发生的环节,从而在一定程度上减轻梗死交界区胶原纤维过度沉积,改善梗死后心功能.     

不同数量骨髓间充质干细胞静脉移植治疗老年糖尿病大鼠的疗效

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)静脉移植治疗糖尿病的最适数量。方法体外分离、培养、扩增BMSCs,流式细胞仪鉴定其表面标志CD44和CD34。体外用bFGF、B27以及肝细胞生长因子诱导其向胰岛样细胞分化,双硫踪染色鉴定胰岛样细胞团,倒置显微镜和透射电镜观察细胞。细胞移植组经球后静脉分别注入2×104、2×105、2×106个BMSCs于注射链脲佐菌素(STZ)制备的老年糖尿病大鼠体内,移植10 d后,检测尿糖和血糖,观察疗效。结果培养、扩增的BMSCs诱导分化后,倒置显微镜和电镜下观察类似胰岛细胞,双硫踪染色鉴定为胰岛样细胞团。BMSCs细胞移植后2×106组疗效最好,血糖值由(22.35±2.13)mmol/L下降为(14.54±0.97)mmol/L,尿糖值由(21.23±1.61)g/L下降为(12.41±1.09)g/L,显著低于2×104、2×105移植组。结论一定数量的BMSCs静脉移植可治疗糖尿病。     

碱性成纤维细胞生长因子及相关细胞因子转染对人骨关节炎软骨细胞的作用

目的 探讨腺病毒介导的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单独及与白细胞介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)和(或)胰岛素样生长因子(IGF)-1共同转染人骨关节炎(OA)软骨细胞后对软骨细胞的影响.方法 采用单独编码人bFGF的重组腺病毒载体或多重组合的重组腺病毒载体转染单层培养的人OA软骨细胞.6 d后分别检测培养上清液中目的 基因表达和糖胺聚糖(GAG)含量.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及流式细胞术分析软骨细胞的增殖及凋亡.甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察软骨细胞基质的合成.免疫印迹法检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶(MMP)-3及其抑制剂-1(TIMP-1)的表达.采用单因素方差分析,并进行组间两两比较.结果 各基因转染后,细胞上清液日的基因表达与OA对照组相比明显增高(P<0.05 ). bFGF单独转染可促进软骨细胞增殖,增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成(P<0.05).与bFGF单独转染相比,联合IL-1Ra和(或)IGF-1共同转染后,可降低软骨细胞的凋亡率[分别为:(26.1±1.6)%、(19.4±1.0)%、(18.4±1.1)%、(13.9±1.8)%,P<0.05],进一步增加了软骨基质的生物合成(P<0.05).同时,抑制了MMP-3的表达,增加了TIMP-1的表达.结论 腺病毒介导的bFGF转染入OA软骨细胞可促进细胞增殖,增加基质的合成.与IL-1Ra和IGF-1共转染后可发挥协同作用,进一步增加基质合成;同时,抑制了基质的降解.     

蒙药额力根II号对肝纤维化大鼠的保护作用研究

目的 观察蒙药额力根II号对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠的保护作用。方法 随机将58只SD大鼠分为对照组、模型组、蒙药额力根II号小、中、大剂量干预组,制备CCl₄肝纤维化模型,并给予蒙药干预。观察肝组织病理学变化,并采用免疫组化法检测肝组织α-SMA、I型胶原和III型胶原的表达。结果 与模型组比,中剂量药物处理组动物血清ALT、AST和透明质酸(HA)水平显著降低(P＜0.05),大剂量药物处理组血清ALT、AST、TBIL、HA、III型前胶原(PIIINP)和IV型胶原(CIV)水平降低更显著(P＜0.05);对照组、中和大剂量药物干预组肝组织α-平滑肌肌动蛋白表达水平分别为(0.0±0.0)、(4.9±1.0)、(3.4±0.9),显著低于模型组【(6.1±1.2),P＜0.05】,III型胶原蛋白分别为(2.4±1.3)、(5.0±2.4)和(3.7±1.8),显著低于模型组【(6.4±2.4),P＜0.05】;对照组和大剂量干预组肝组织I型胶原蛋白分别为(2.1±0.2)和(3.3±1.0),显著低于模型组【(6.0±2.5),P＜0.05】;与模型组比,中和大剂量药物处理组大鼠肝组织纤维化程度显著改善。结论 蒙药额力根II号对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠具有保护作用,其机制可能与抑制了肝星状细胞活化,减少了细胞外基质的合成有关。     

丰宫并殖吸虫感染大鼠后诱导肺组织细胞自噬的初探

目的通过检测蛋白激酶B (Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路相关因子的表达,探讨丰宫并殖吸虫感染大鼠是否可导致肺组织细胞发生自噬。方法 40只SD大鼠随机分为健康对照组,感染后3、 7、 14 d组,每组10只,感染组每鼠腹壁皮下注射6条丰宫并殖吸虫后尾蚴,分别在感染后3、 7、14 d取各组大鼠血清和肺组织,ELISA检测血清中IL-1、 IL-6水平。取肺组织用于透射电镜观察自噬体,HE染色观察肺组织病理学改变,蛋白质免疫印迹(Western blotting)和免疫组化检测Akt、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、程序性死亡受体-1 (Beclin 1)及微管相关蛋白轻链3 (LC3Ⅱ)相关因子的蛋白表达。采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。结果ELISA检测结果显示,感染后3、 7、 14 d组血清中IL-1水平分别为(1 558.0±123.6)、(1 511.0±213.1)和(1 448.0±176.8) pg/ml,均高于对照组的(1 222.0±112.8) pg/ml (P <0.05);感染后3、 7 d组IL-6水平分别为(1 481.0±197.9)、(1 423.0±210.0) pg/ml,均高于对照组的(1 221.0±138.9) pg/ml (P <0.05)。透射电镜观察在不同的感染阶段,肺组织中线粒体均出现自噬现象。大鼠组织肺病理学检测结果显示,各感染组细胞排列紊乱,肺泡结构遭到不同程度的破坏。各感染组Akt蛋白表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P> 0.05);感染后3、 7 d组磷酸化蛋白激酶B (p-Aktser473)蛋白表达水平为(1.288±0.109)、(1.619±0.132),均高于对照组(0.733±0.135)(P <0.01);感染后3、 7、 14 d组磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-m TORser2448)蛋白表达水平分别为(1.574±0.278)、(2.384±0.125)和(1.808±0.121),均高于对照组(1.260±0.087)(P <0.05);感染后3 d组mTOR、 Beclin 1蛋白表达水平分别为(1.714±0.217)和(2.736±0.333),均高于对照组(1.345±0.067)和(1.974±0.225)(P <0.01);感染后14 d组LC3Ⅱ蛋白表达(1.938±0.191)高于对照组(1.401±0.200)(P <0.01)。免疫组化分析结果显示,对照组肺组织细胞呈蓝色,阳性呈棕黄色,各因子阳性定位于细胞膜和细胞浆。各感染组Akt、 mTOR与对照组相比,肺组织细胞中棕黄色显色不明显,A450值与对照组比较差异无统计学意义(P> 0.05);感染后3、 7、 14 d组p-Aktser473、 p-mTORser2448及Beclin 1与对照组相比,棕黄色显色加深明显,A450值分别为(0.104±0.010)、(0.143±0.022)、(0.088±0.013),(0.100±0.007)、(0.151±0.006)、(0.120±0.012)和(0.129±0.005)、(0.047±0.004)、(0.050±0.005),均高于相应对照组(0.032±0.001)、(0.065±0.002)和(0.031±0.001)(P <0.05);感染后3、 14 d组LC3Ⅱ与对照组比较棕黄色明显加深,A450值分别为(0.056±0.006)、(0.120±0.007),均高于对照组(0.042±0.004)(P <0.05)。结论丰宫并殖吸虫感染大鼠所致的肺损伤,炎症反应可诱导肺组织细胞发生自噬,该自噬作用可通过检测Akt/mTOR信号通路相关因子的表达来初步实现。     

人受体活性修饰蛋白1基因修饰间充质干细胞对兔心肌梗死后心室重构的作用

目的探讨腺病毒介导人受体活性修饰蛋白1(hRAMP1)基因转染间充质干细胞(MSC)移植对心肌梗死后心肌纤维化和心室重构的影响及可能机制。方法建立心肌梗死再灌注兔模型,随机分为hRAMP1组(高表达hRAMP1基因的MSC移植,n=10)、MSC组(无基因修饰的单纯MSC移植,n=10)和对照组(生理盐水注射,n=10)。Western blot检测心肌梗死后1、3、7和28d心肌梗死局部基质金属蛋白酶9(MMP-9)和hRAMP1蛋白表达水平;同时行2,3,5三苯基氯化四氮唑染色检测心肌梗死面积,心肌组织Masson染色评价心肌梗死后胶原沉积和纤维化程度;超声心动图评价28d时左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室射血分数(LVEF)及短轴缩短率(FS)。结果细胞移植后,与对照和MSC组相比,hRAMP1组的LVEF[(57.2±6.3)%比(36.2±2.2)%、(45.3±5.4)%]和FS[(29.2±2.4)%比(13.5±1.4)%、(19.4±2.4)%]均升高(均P<0.05),而LVESD[(7.9±0.8)比(12.7±0.9)、(10.4±0.9)mm]和LVEDD[(12.7±1.2)比(17.3±2.4)、(16.3±1.1)mm]、心肌梗死面积、胶原容积分数均明显降低,胶原沉积减少。免疫印迹结果显示,hRAMP1组MMP-9蛋白表达较对照、MSC组明显增高。结论 hRAMP1移植通过促进梗死区心肌组织MMP-9表达,降低梗死区胶原沉积,抑制心肌纤维化,进而改善心室重构,提高心功能。     

骨形态发生蛋白2在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用

目的：观察骨形态发生蛋白2（BMP2）在骨髓间充质干细胞（BMSCs）向肝细胞分化中的作用。方法采用贴壁法分离培养大鼠股骨BMSCs ,将体外扩增的第3代BMSCs制作细胞爬片,并行肝细胞定向诱导。根据诱导因子不同分为：肝细胞生长因子（ HGF）组、HGF＋BMP2组、BMP2组及空白对照组。培养10 d左右收集细胞,观察各组细胞形态的变化,并采用ELISA法检测培养液上清中肝细胞特异性标志物甲胎蛋白（ AFP）、白蛋白（ ALB）,免疫细胞化学法检测诱导分化后细胞CK-18的表达。结果 HGF组和HGF＋BMP2组可检测到ALB、AFP及CK-18,且HGF＋BMP2组ALB、AFP及CK-18明显高于HGF组（P均＜0．05）。结论 BMP2不能单独诱导BMSCs向肝细胞分化,但能增强HGF诱导BMSCs向肝细胞分化的作用。     

Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor β1

Objective

Human embryonic stem cells (ESCs) provide an unlimited supply of pluripotent cells for articular cartilage tissue engineering and regenerative medicine applications. Articular cartilage is an avascular tissue with precise polarity and organization comprising 3 distinct functional zones: surface, middle, and deep. To date, attempts at differentiating human ESCs into articular chondrocytes have been unsuccessful. The majority of studies have focused on chondrogenic (but not specifically articular cartilage) differentiation. Furthermore, previous investigations of induction of chondrogenesis by human ESCs required embryoid body formation; however, embryoid body formation often results in heterogeneous differentiation. The present study was undertaken to determine the in vitro chondrogenic potential of bone morphogenetic protein 7 (BMP‐7) and transforming growth factor β1 (TGFβ1)–induced human ESC differentiation toward the articular cartilage phenotype.

Methods

Dissociated single human ESCs were cultured and passaged on a gelatin‐coated flask. The human ESCs were cultured as an aggregate in a pellet culture system for 14 days in basal chondrogenic medium (CM), CM with TGFβ1, CM with BMP‐7, or CM with both TGFβ1 and BMP‐7.

Results

The size and wet weight of the cartilage pellets and glycosaminoglycan levels increased, with the smallest, intermediate, and greatest increases, respectively, observed with CM plus TGFβ1 treatment, CM plus BMP‐7 treatment, and CM plus TGFβ1 and BMP‐7 treatment (compared with CM treatment alone). The largest size and highest weight of the pellet was in the group in which TGFβ1 and BMP‐7 were added to the medium. However, expression of the genes for cartilage‐specific aggrecan and type II collagen II, as assessed by determination of messenger RNA levels, was highest in the BMP‐7–treated group. Superficial zone protein (SZP)/lubricin, a marker of the superficial zone articular chondrocyte, was not detectable under identical culture conditions.

Conclusion

These results demonstrate an efficient and reproducible model system of human ESC‐induced chondrogenesis, using a novel direct plating method in which intervening embryoid body formation does not occur. Further work is needed for optimization of conditions to obtain the articular cartilage phenotype that includes the superficial zone marker as demonstrated by SZP/lubricin synthesis.

     

血管紧张素Ⅱ对人肝细胞白蛋白和胶原合成的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人正常肝细胞白蛋白表达及Ⅰ型胶原合成的影响.方法 常规培养人正常肝细胞系HL-7702细胞并分为对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ十依贝沙坦组(共刺激组).采用免疫荧光法和Western印迹法检测各组肝细胞中白蛋白及胶原改变;免疫荧光法观察各组肝细胞中是否有胶原合成;实时定量PCR法定量检测各组肝细胞中Ⅰ型胶原mR-NA表达水平的变化.结果 与对照组相比,经AngⅡ(10-7mol/L)处理72 h后,AngⅡ刺激组肝细胞中白蛋白表达减少(1.41±0.23比0.85±0.11,P=0.000),Ⅰ型胶原mRNA的表达明显升高(1.00±0.08比3.72±0.19,P=0.000),Ⅰ型胶原蛋白合成增加,而经依贝沙坦预处理后,共刺激组肝细胞白蛋白表达较AngⅡ刺激组明显增多(0.85±0.11比1.38±0.32,P=0.000),肝细胞Ⅰ型胶原mRNA表达较AngⅡ刺激组显著下降(3.72±0.19比2.86±0.13,P=0.000),Ⅰ型胶原蛋白合成减少.结论 AngⅡ经Ⅰ型受体诱导人肝细胞表达白蛋白减少,胶原合成增加.     

Blockage of transforming growth factor β receptors prevents progression of pig serum-induced rat liver fibrosis

AIM: To test the hypothesis that introduction of antisense TβR Ⅰ and TβR Ⅱ eukaryotic expressing plasmids into a rat model of immunologically induced liver fibrosis might block the action of TGF-β1 and halt the progression of liver fibrosis.METHODS: RT-Nest-PCR and gene recombination techniques were used to construct rat antisense TβR Ⅰ and TβR Ⅱ recombinant plasmids which could be expressed in eukaryotic cells. The recombinant plasmids and empty vector (pcDNA3) were encapsulated by glycosyl-poly-Llysine and then transducted into rats of pig serum-induced liver fibrosis model. Expression of exogenously transfected gene was assessed by Northern blot, and hepatic expressions of TβR Ⅰ and TβR Ⅱ were evaluated by RTPCR and Western blot. We also performed ELISA for serum TGF-β1, hydroxyproline of hepatic tissues, immunohistochemistry for collagen types Ⅰ and Ⅲ, and VG staining for pathological study of the liver tissues.RESULTS: The exogenous antisense TβR Ⅰ and TβR Ⅱ plasmids could be well expressed in vivo, and block mRNA and protein expression of TβR Ⅰ and TβR Ⅱ in the fibrotic liver at the level of mRNA respectively. These exogenous plasmid expressions reduced the level of TGF-β1(antisense TβR Ⅰ group 23.998±3.045 ng/mL, antisense TβR Ⅱ group 23.156±3.131 ng/mL, disease control group 32.960±3.789 ng/mL; F=38.19, 36.73, P＜0.01). Compared with disease control group, the contents of hepatic hydroxyproline (antisense TβR Ⅰ group 0.169±0.015 mg/g liver, antisense TβR Ⅱ group 0.167±0.009 mg/g liver,disease control group 0.296±0.026 mg/g liver; F=14.39,15.48, P＜0.01) and the deposition of collagen types Ⅰ and Ⅲ decreased in the two antisense treatment groups (antisense TβR Ⅰ group, collagen type Ⅰ 669.90±50.67,collagen type Ⅲ 657.29±49.48; antisense TβR Ⅱ group,collagen type Ⅰ 650.26±51.51, collagen type Ⅲ 661.58±55.28;disease control group, collagen type Ⅰ 1209.44±116.60,collagen type Ⅲ 1175.14±121.44; F=15.48 to 74.89, P＜0.01).Their expression also improved the pathologic classification of liver fibrosis models (compared with disease control group, x2=17.14, 17.24, P＜0.01). No difference was found in the level of TGF-β1, the contents of hepatic hydroxyproline and collagen types Ⅰ and Ⅲ and pathologic grade between pcDNA3 control group and disease control group or between the two antisense treatment groups (F =0.11 to 1.06, x2=0.13 to 0.16, P＞0.05).CONCLUSION: Antisense TβR Ⅰ and TβR Ⅱ recombinant plasmids have certain reverse effects on liver fibrosis and can be used as possible candidates for gene therapy.