米诺环素对缺氧猴脉络膜视网膜血管内皮细胞表达血管内皮生长因子受体的影响

目的 观察缺氧状态下猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）血管内皮生长因子受体（VEGFR）-1和VEGFR-2的表达情况及米诺环素的干预效果。方法 培养RF/6A并将细胞分为正常对照组、缺氧对照组、米诺环素低剂量组(0.5 μmol/L）、米诺环素中剂量组（5.0 μmol/L）、米诺环素高剂量组（50.0 μmol/L）。实时定量聚合酶链反应（PCR）和免疫组织化学染色检测VEGFR-1、VEGFR 2的mRNA表达和蛋白表达。结果 实时定量PCR检测结果显示,各组细胞中VEGFR-1 mRNA的表达水平在24（F=0.17）、48（F=1.53）、72 h（F=2.04）各时间点未发生显著变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。72 h后,米诺环素低(t=469)、中(t=20.16)、高(t=17.12)剂量组VEGFR 2 mRNA表达水平与缺氧对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.001）。免疫组织化学检测结果显示,各组均可见表达VEGFR-1、VEGFR-2蛋白的阳性细胞。VEGFR-1蛋白表达水平偏低,染色浅或中度棕色,主要位于内皮细胞胞膜和细胞质中,各组细胞中VEGFR-1蛋白的表达水平在各时间点比较,差异无统计学意义（F _{24 h}=0.251,F _{48 h}=0.340,F_{72 h}=0.589;P＞0.05）;VEGFR-2蛋白表达水平较高,各组内皮细胞胞膜上均可见棕黄色染色物质,细胞质中也见少量表达,缺氧对照组染色强度明显比正常对照组强,并且与米诺环素处理各组间VEGFR-2蛋白表达比较,差异有统计学意义（F_{24 h}=19.147, F_{48 h}=14.893,F _{72 h}=11.984;P＜0.05）。结论 缺氧RF/6A VEGFR-2表达上调,米诺环素对其有一定抑制作用。     

兆科降纤酶和抗αvβ3整合素抗体对牛视网膜血管内皮细胞粘附、移行的影响

目的探讨蛇毒制剂兆科降纤酶和抗αvβ3整合素抗体23C6对血管内皮细胞粘附移行的影响. 方法以玻璃粘连蛋白 (Vn)、胶原包被培养皿,牛视网膜血管内皮细胞中加入不同浓度的兆科降纤酶和抗αvβ3整合素抗体,孵育60 min 后进行细胞粘附分析和移行分析.应用透射电子显微镜,对兆科降纤酶和抗αvβ3整合素抗体干预后的牛视网膜血管内皮细胞进行凋亡检测. 结果兆科降纤酶和抗αvβ3整合素抗体均呈剂量依赖性抑制牛视网膜血管内皮细胞对Vn、胶原的粘附和移行.兆科降纤酶半数抑制浓度(IC50)小于0.05 μmol/L,而抗αvβ3整合素抗体的IC50高于2.5 μmol/L. 0.1 μmol/L的兆科降纤酶即可抑制81.8%的内皮细胞对Vn的粘附,10 μmol/L抗αvβ3整合素抗体则可抑制76.3%.经两者干预后的牛视网膜血管内皮细胞内均可见典型的凋亡小体. 结论兆科降纤酶和抗αvβ3整合素抗体能显著抑制牛视网膜血管内皮细胞对细胞外基质的粘附和移行,其机理可能在于诱导牛视网膜血管内皮细胞凋亡.     

视网膜微血管内皮细胞培养及血管二维模型的建立

目的 培养人视网膜微血管内皮细胞，建立人视网膜血管体外二维模型。 方法 人视网膜血管内皮细胞在纤维连接蛋白包被的细胞培养池内，以无血清人内皮细胞培养基培养，形成二维血管模型。用辣根过氧化酶检测其通透性。部分血管模型加入5 ng/ml的血管内皮生长因子培养，与无血管内皮生长因子培养形成的血管模型比较通透性的变化，观察血管内皮生长因子对血管通透性的影响。 结果2～4 d左右内皮细胞亚融合形成网状血管样结构，6 d左右形成较完整的二维血管模型。血管内皮生长因子可增大血管的通透性，促进血管生成。 结论 用人内皮细胞培养基可成功培养人视网膜血管内皮细胞；利用细胞培养池和无血清人内皮细胞培养基培养，可建立标准的体外视网膜二维血管模型。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 110-112)     

牛视网膜微血管内皮细胞的体外分离培养

目的探讨一种方便可靠的牛视网膜微血管内皮细胞(borein retinal microvas cular endothelial cell,BREC)体外培养方法.方法采用机械剪碎牛视网膜血管,用含牛血清、肝素、血管内皮生长因子(Vascularendothelial growthfactor,VEGF)的条件化培养基培养牛视网膜血管内皮细胞,观察细胞生长状况,制作生长曲线.应用Von Willebrand因子抗体免疫鉴定BREC,并通过透射电镜观察BREC的超微结构.结果添加了VEGF的条件化培养基对BREC有很好的选择刺激作用,初期细胞呈鲤鱼样聚集在微血管碎片周围,对数生长期细胞似铺路石样大片单层生长,存在接触抑制.Von Willebrand因子抗体染色阳性,获得BREC纯度在95％以上,能够连续传代.培养的细胞电镜下符合内皮细胞的特征.结论含VEGF培养基的应用可以获得高纯度、具有良好生长特性的BREC,是一种简便、效果稳定可靠的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法.     

CCR7和VEGF在缺氧时视网膜血管内皮细胞中的表达及意义

目的：探讨CC族趋化因子受体7（ CC chemokine receptor7, CCR7）和血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor,VEGF）在缺氧状态下视网膜血管内皮细胞（ retinal endothelial cell,REC）中的表达及意义。
　　方法：恒河猴脉络膜－视网膜内皮细胞（ RF／6A）分别在常氧和低氧环境中培养,分为正常对照组、低氧对照组和治疗组。低氧对照组和治疗组分别采用脂质体LipofectamineTM 2000（ LF2000）介导转染空载体质粒和CCR7siRNA表达质粒。 CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot和RT－PCR法检测三组RF／6A内CCR7、VEGF蛋白及mRNA的表达情况。结果：低氧对照组较正常对照组比较及治疗组较正常对照组和低氧对照组比较细胞生长速度明显减慢,增殖能力减弱,细胞凋亡率显著增加（均为P＜0．05）;低氧对照组与正常对照组比较, RF／6 A内CCR7、VEGF蛋白及mRNA表达显著增高,均有统计学意义（ tCCR7蛋白＝3．38,tVEGF蛋白＝4．75,tCCR7mRNA＝4．27,tVEGFmRNA＝5．34,均为P＜0．05）,且二者表达呈正相关（ r蛋白＝0．71, rmRNA ＝0．83,均为 P＜0．05）。治疗组CCR7和VEGF的蛋白及mRNA表达较正常对照组和低氧对照组明显下降（均为P＜0．05）。
　　结论：缺氧时REC中CCR7可上调VEGF的表达,CCR7－VEGF信号途径在视网膜新生血管（ retinal neovascularization, RNV）形成的过程中可能具有潜在功能,CCR7siRNA有望成为防治RNV的一种有效方法。     

牛视网膜微血管内皮细胞和周细胞的体外培养

目的 探讨牛视网膜微血管内皮细胞（ bovine retinal endothelial cells, BREC ）和周细胞（bovine retinal pericytes, BRP）的体外选择性培养方法。 方法 结合视网膜微血管的消化分离，采用含10％人血清、100 μg/ml 肝素（Heparin）的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium, DMEM)和含20％胎牛血清的DMEM培养基分别选择性培养BREC和BRP。通过荧光显微镜观察乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein, Dil-Ac-LDL)吞噬情况并应用Von Willebrand因子抗体通过免疫组织化学方法鉴定BREC；以及α-平滑肌肌动蛋白抗体免疫组织化学鉴定BRP。 结果 通过选择性培养获得的BREC和BRP的纯度达到98％以上，并能连续传代。BREC早期似小鲤鱼状聚集在微血管碎片周围，呈片状鹅卵石样单层生长，存在接触性抑制；周细胞多散布在距血管碎片稍远处，形状不规则，呈无接触性抑制的生长。BREC可吞噬Dil-Ac-LDL，细胞浆内有荧光表达 ；消化传代后BREC中Von Willebrand因子表达阳性，而α-平滑肌肌动蛋白表达阴性；BRP的α-平滑肌肌动蛋白表达阳性，而Von Willebrand因子表达阴性。 结论 选择性培养基的应用和培养皿的处理，可分别获得较高纯度的BREC和BRP，简单且具有良好的重复性，无需额外步骤来去除BREC中混杂的BRP。 （中华眼底病杂志，2004，20：23-26）     

血管内皮细胞生长因子受体嵌合蛋白抑制视网膜新生血管化的实验研究

目的观察血管内皮细胞生长因子受体嵌合蛋白对缺血性视网膜病变小鼠模型的视网膜新生血管化的抑制作用。方法以高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立视网膜缺血性病变动物模型,应用不同浓度VEGF受体嵌合蛋白进行玻璃体腔内注射,在组织切片上计数和比较正常和实验条件下以及不同浓度药物注射后视网膜新生血管芽细胞核数。结果视网膜新生血管芽细胞核数:正常对照组(1.06±2.08)个;高氧对照组(128·69±46.07)个,flt-1小剂量治疗组(85.31±35.46)个,flt-1大剂量治疗组(63.13±24.40)个,flk-1小剂量治疗组(90·50±38.03)个,flk-1大剂量治疗组(67.13±23.13)个,flt-1 flk-1治疗组(42.69±17.75)个。各用药组与高氧对照组间均有显著性差异,P<0.05。结论血管内皮细胞生长因子受体嵌合蛋白能有效抑制视网膜新生血管的增生。     

内皮抑素对视网膜新生血管中血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的:观察内皮抑素(endostatin,ES)对视网膜新生血管中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:通过缺氧的方法建立小鼠视网膜新生血管模型36只,随机分为高氧组及ES治疗组。ES治疗组小鼠在出氧箱后12,36h,玻璃体腔内注射ES1μL。另将生活在正常氧环境中的18只同龄小鼠作为正常对照。提取3组小鼠视网膜总RNA,通过RT-PCR方法定量检测VEGF在3组小鼠视网膜中的表达。结果:氧致视网膜病变视网膜中VEGF的表达升高,与正常对照组比较有统计学意义(高氧组与正常对照组比较P<0.05);ES作用后VEGF的表达减少,与给氧组比较有统计学意义(ES治疗组与高氧组比较P<0.05)。结论:ES作用机制可能是通过抑制VEGF mRNA基因的表达来抑制视网膜新生血管的形成。     

胰岛素对正常糖和高糖浓度下牛视网膜微血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨胰岛素、糖浓度及其两者的联合作用对牛视网膜微血管内皮(BRE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 对照实验研究.采用选择性培养方法,培养BRE细胞,传代后分别在正常糖(5 mmol/L)或高糖(30 mmol/L)浓度下培养3 d,甘露醇平衡渗透压,血清饥饿12 h,给予或不给予100 nmol/L胰岛素作用24 h.实时荧光定量检测VEGF mRNA表达水平;人脐静脉血管内皮细胞增殖法、免疫荧光检测法、免疫印迹法检测VEGF蛋白表达水平.采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行分析,胰岛素、糖浓度及其交互作用对BRE细胞的VEGF mRNA和VEGF蛋白表达水平的影响,采用2×2析因设计定量资料方差分析,以P<0.05作为差异有统计学意义.结果 胰岛素或高糖浓度可以显著提高BRE细胞的VEGFmRNA(F=5.67,9.04;均P<0.05)和VEGF蛋白(F=5.50,5.57;均P<0.05)表达水平,但胰岛素联合高糖浓度的作用较其单独作用减弱.结论 高糖浓度下可以降低胰岛素诱导的VEGF表达水平,因此,VEGF可能不是胰岛素治疗导致的糖尿病视网膜病变短期恶化的主要因素.     

肝细胞生长因子对牛视网膜血管内皮细胞的促增生移行效应

目的 体外培养牛视网膜血管内皮细胞（BREC），观察肝细胞生长因子（HGF）对其促增生和移行效应。方法通过FⅧr-Ab免疫组织化学法鉴定培养的BREC；向BREC中加入不同质量浓度的HGF，4d后用MTT法测定细胞增生情况；向有正方形无细胞区的6孔培养板中加入不同质量浓度的HGF，24h后计数进入空白区的细胞，判定细胞移行效应；流式细胞仪测增生周期。结果HGF对BREC促增生成剂量一时间依赖关系，在不同质量浓度下增生率分别为8．5％，12．4％，33．8％，39．8％。25ng／ml HGF作用1～4d，增生率分别为4．5％，8．3％，10．4％，15．6％。HGF对BREC促移行呈质量浓度依赖关系，移行能力分别为10％，63％，239％，476％。流式细胞仪结果显示HGF促BREC增生主要作用于细胞周期的M期。结论HGF可显著促进BREC的增生和移行，是细胞的有丝分裂原和强有力的促移行因子。     

密蒙花提取物对高糖下人视网膜血管内皮细胞增生及VEGF表达的影响

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病严重的微血管并发症之一,其病理特征为视网膜新生血管形成,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）能特异性地作用于视网膜血管内皮细胞,是最直接的眼内新生血管形成因子之一。密蒙花是用于治疗眼部疾病的一种中药,具有维生素P样作用,能降低皮肤和小肠血管的通透性及脆性。     

雌激素对不同氧环境下牛视网膜毛细血管内皮细胞血管内皮生长因子的影响

早产儿视网膜血管发育尚不成熟，在吸入过多氧或其他因素造成机体相对缺氧后，易致视网膜血管异常增生，发生早产儿视网膜病变（ROP）。在胎儿期，雌激素水平较高，视网膜血管发育过程正常有序，对于早产儿补充适量雌激素，是否可以抑制视网膜血管异常增生，从而预防ROP？我们以培养的牛视网膜毛细血管内皮细胞（BREC）为模型，[第一段]     

缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF-1α及其mRNA的表达

目的探讨在缺氧状态下视网膜血管内皮细胞缺氧诱导因子-1 α（HIF-1 α）及其mRNA表达的时空规律。方法对分离的牛视网膜血管内皮细胞分别进行常规和CoCl2模拟缺氧培养，采用免疫组织化学和逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）检测不同缺氧时间HIF-1 α及其mRNA的表达。结果正常对照组HIF-1 α有极低表达，缺氧1h表达量显著上升，4h达到高峰，16h后下降。与对照组比较，各缺氧组HIF-1 α的表达均有显著统计学差异（P〈0．01）。但各缺氧组HIF-1 αmRNA的表达无显著统计学差异。结论视网膜血管内皮细胞在缺氧早期HIF-1 α表达有短暂、迅速的增加，但其mRNA的表达无明显变化，提示缺氧可以促进视网膜血管内皮细胞HIF-1 α的表达，但不是在基因的转录水平。     

单分子成像显示视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2聚集状态

目的:观察单个视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2 （VEGFR2）的聚集状态。方法:将猴视网膜血管内皮细胞（RF/6A）分为空白对照组（正常培养）、质粒转染组[转染VEGFR2-绿色荧光蛋白（GFP）重组质粒]。采用共聚焦显微镜观察质粒转染组GFP的表达;实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、蛋白免疫印迹法（...     

可溶性VEGF受体1在视网膜新生血管疾病中的研究进展

视网膜新生血管性疾病的共同特征是病理性新生血管形成。目前研究的内源性视网膜新生血管因子最主要的是VEGF。可溶性VEGF受体1(sFlt-1)是VEGFR-1的mRNA胞外区剪接形成的可溶性形式,只编码胞外区,缺乏细胞内酪氨酸激酶区域,所以其仅具有与配体结合的能力,而无信号转导能力,从而阻止新生血管的形成。sFlt-1作为近年来的研究热点,有可能成为治疗该类疾病的新的基因治疗方法。本文就sFlt-1在视网膜新生血管疾病治疗中的作用机制及研究进展做一综述。     

京尼平苷对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及血管生成的影响及机制研究

目的 研究京尼平苷(Gen)对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(hRVECs)增殖、迁移及血管形成能力的影响,并探讨其作用机制。方法 采用不同浓度(0、1、5、10、20、40、80 mg·L^-1)Gen干预hRVECs 24 h, CCK-8检测Gen对hRVECs细胞增殖活性的影响。将hRVECs分为对照组,高糖(25 mmol·L^-1)组,Gen低、中、高浓度(5、10、20 mg·L^-1)组,贝伐珠单抗(BEV,250μg·L^-1)组和Gen高浓度+BEV(250μg·L^-1)组。CCK-8检测细胞增殖活性;划痕实验检测细胞迁移能力;体外成管实验检测细胞成管能力;Western blot检测细胞中血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、可溶性VEGF受体-1(sFlt-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等蛋白表达水平。结果 与0 mg·L^-1 Gen比较,1、5、10、20、40、80 mg·L^-1     

Müller细胞对视网膜血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响

目的
探讨体外培养的Müller细胞在糖基化终末产物（AGEs）作用下增殖活性的变化，以及这种改变对牛视网膜血管内皮细胞（BREC）紧密连接蛋白（occludin）表达的影响。
方法
培养新生大鼠Müller细胞和BREC，两类细胞均用特异性抗体进行免疫鉴定。将培养的BREC分4组观察：第1组未添加任何细胞上清液；第2组添加正常Müller细胞上清液；第3组添加糖基化终末产物(AGEs)作用后的Müller细胞上清液；第
4组无细胞组，为空白对照组。酶联免疫吸附法（ELISA）测定4组细胞上清液中紧密连接蛋白的含量，比较其变化。
结果
添加正常Müller细胞上清液组紧密连接蛋白表达量最多，未添加任何细胞上清液组次之，添加AGEs作用后的Müller细胞上清液组更少。
结论
AGEs能促进Müller细胞异常增殖、抑制BREC表达紧密连接蛋白。
(中华眼底病杂志, 2006, 22: 28-30)     

血管内皮生长因子及表皮生长因子受体在挫伤兔视网膜中的表达

目的 探讨挫伤兔视网膜中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的变化.方法 健康新西兰兔(普通级)40只,随机分为实验组(36只)和对照组(4只),以自由落体方式,用350 g光滑铅球正面击打正常兔眼,观察对照组和实验组免视网膜伤后不同时间点(伤后2h、1 d、3 d、7 d、14 d、20 d)及EGFR的免疫组织化学变化情况.结果 实验组挫伤兔视网膜中VEGF的表达先轻微下调,再随伤后时间延长而上调,伤后7 d即高于对照组(P＜0.05),20 d时已回落至正常水平,即伤后7 d灰度值为51.05±065,对照组为51.95±0.13(P＜0.05);伤后20 d实验组为51.03±0.69,对照组51.98±0.36(P=0.050 3).EGFR的表达在挫伤后2 h、7 d 2组比较差异无统计学意义.结论 挫伤后,兔视网膜中VEGF表达明显上调,而EGFR变化不大,提示一定强度眼挫伤后,组织细胞以局部修复为主,不出现大范围的细胞增生和分化,也不会产生广泛的新生血管形成.     

缺氧诱导因子-1α与血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及相关性

目的:检测视网膜新生血管中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,研究其与血管内皮生长因子(VEGF)表达的相关性。方法:以高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立视网膜新生血管模型,取对照组和给氧组幼鼠眼球作荧光素血管灌注,病理切片及免疫组织化学检测,分别观察视网膜血管的改变,视网膜新生血管内皮细胞数目及HIF-1α,VEGF蛋白的表达。结果:给氧组视网膜可见大量新生血管形成,新生血管内皮细胞核数为(23.38±1.07)个,与对照组相比差异有极显著性(P<0.01)。HIF-1α蛋白表达在神经节细胞层和突破视网膜内界膜的新生血管。VEGF蛋白表达在内核层,神经节细胞层和突破视网膜内界膜的新生血管。两者表达呈显著正相关(r=0.931,P<0.01)。结论:在视网膜新生血管形成中存在HIF-1α,VEGF的高表达,且两者表达密切相关。