TLR4激动上调内皮细胞氧化低密度脂蛋白受体LOX-1表达

目的近年研究表明介导先天免疫反应的受体Toll样受体4(TLR4)参与了动脉硬化的发生发展.业已证明氧化低密度脂蛋白受体LOX-1介导内皮细胞活化和功能失调,激发炎症过程,在动脉粥样硬化的发生和发展中起着极为重要作用.本研究观察TLR4激动是否调节内皮细胞LOX-1表达.方法应用脂多糖(LPS)刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)24 h.采用RT-PCR和流式细胞术分别检测TLR4、LOX-1 mRNA和蛋白表达水平.为了观察转录因子NF-κB在调节LOX-1表达中的作用,应用NF-κB特异性抑制剂咖啡酸苯乙酯(CAPE)预处理细胞,然后以LPS刺激,检测LOX-1 mRNA和蛋白变化.结果LPS(10～1 000 ng/mL)上调HUVECs TLR4和LOX-1 mRNA表达,LPS(1 000ng/mL)上调TLR4和LOX-1蛋白表达,CAPE(20μg/mL)可抑制LPS介导的LOX-1表达上调.结论TLR4/NF-κB信号途径可能通过上调内皮细胞LOX-1表达参与动脉粥样硬化的发生及发展.     

Toll样受体4/核因子κB和氧化低密度脂蛋白受体LOX-1对单核内皮细胞黏附的影响

目的近年研究表明介导先天免疫反应的受体Toll样受体4（TLR4）参与动脉粥样硬化的发生发展。TLR4激动后通过诱导核因子κB（NF—κB）激活,调控炎症因子的表达。研究观察TLR4／NF—κB激活对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化低密度脂蛋白受体（lectin—like oxidized lowdensity lipoprotein receptor-1,LOX-1）、细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）、E-选择素（E—selectin）表达的调节,以及它们在介导单核内皮细胞黏附中的作用。方法应用脂多糖（LPS,1mg／L）刺激HUVECs 24h。采用RT—PCR方法检测TLR4、LOX-1、ICAM-1、E—selecfin mRNA表达水平;采用蛋白质印迹技术检测TLR4、LOX-1蛋白表达水平及核蛋白NF—κB p65表达的变化;采用直接计数法观察HUVECs与单核细胞的黏附率。结果LPS上调TLR4表达,激活NF—κB,上调HUVECs LOX-1、ICAM-1、E—selectin表达,增加单核细胞与内皮细胞的黏附率;抗LOX-1、ICAM-1、E—selectin抗体均部分抑制LPS介导的单核与内皮细胞黏附率的增加;NF—κB抑制剂一咖啡酸苯乙酯（CAPE）抑制了LPS介导的上述效应。结论TLR4／NF—κB激活上调LOX-1、ICAM-1、E—selectin表达,它们均在LPS介导的单核内皮细胞黏附过程中起部分作用,NF—κB在LPS介导的上述效应中起关键调节作用,干预NF—κB激活可能成为防治动脉粥样硬化的靶目标。     

Toll样受体4信号激动对心肌细胞血管紧张素原及血管紧张素Ⅱ 1型受体表达的影响

目的 应用Toll样受体4(TLR4)的特异性激动剂脂多糖(LPS)刺激培养的新生大鼠心肌细胞,激活TLR4介导的信号通路,观察对心肌局部的血管紧张素原和血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)表达的影响,探讨TLR4在心血管疾病中的参与机制.方法 用TLR4的激动剂LPS以10、100、1000 ng/mL的浓度作用于体外培养新生大鼠心肌细胞(NRVMs)24 h后应用RT-PCR法测定NRVMs的TLR4、血管紧张素原(AGT)及AT1R mRNA的表达情况.结果 LPS刺激下明显升高NRVMs TLR4 mRNA表达水平,并呈剂量依赖性(P<0 05).AGT和AT1R的表达也明显增高(P<0 05).结论 培养的NRVMs在LPS的作用下,在10 ng/mL的浓度下,TLR4增加自身受体TLR4表达的同时,也上调NRVMs的AGT与AT1R的表达,提示TLR4可能通过介导的心肌局部肾素血管紧张素系统(RAS)的活化加重细胞的损伤,参与心血管疾病的发生发展.     

Toll样受体4信号激动对心肌细胞血管紧张素原及血管紧张素Ⅱ1型受体表达的影响

目的应用 Toll 样受体4(TLR4)的特异性激动剂脂多糖(LPS)刺激培养的新生大鼠心肌细胞,激活 TLR4介导的信号通路,观察对心肌局部的血管紧张素原和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT_1R)表达的影响,探讨TLR4在心血管疾病中的参与机制。方法用 TLR4的激动剂 LPS 以10、100、1000 ng/mL 的浓度作用于体外培养新生大鼠心肌细胞(NRVMs)24 h 后应用 RT-PCR 法测定 NRVMs 的 TLR4、血管紧张素原(AGT)及 AT_1RmRNA 的表达情况。结果 LPS 刺激下明显升高 NRVMs TLR4 mRNA 表达水平,并呈剂量依赖性(P<0.05)。AGT 和 AT_1R 的表达也明显增高(P<0.05)。结论培养的 NRVMs 在 LPS 的作用下,在10 ng/mL 的浓度下,TLR4增加自身受体 TLR4表达的同时,也上调 NRVMs 的 AGT 与 AT_1R 的表达,提示 TLR4可能通过介导的心肌局部肾素血管紧张素系统(RAS)的活化加重细胞的损伤,参与心血管疾病的发生发展。     

PCKS9通过TLR4/NF-κB/COX-2途径调节单核-内皮细胞黏附性

目的探讨前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是否通过人脐静脉内皮细胞(HUVECs)Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/环氧合酶2(COX-2)途径调节单核-内皮细胞黏附性。方法氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)处理HUVECs,real-time PCR与Western blot法检测PCSK9、TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达;ox-LDL处理后,用人重组PCSK9蛋白孵育或PCSK9 siRNA转染HUVECs,检测TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达;ox-LDL处理后,用人重组PCSK9蛋白与TLR4抑制剂瑞沙托维(TAK-242)或NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)共同孵育HUVECs,检测NF-κB p65与COX-2的mRNA和蛋白表达;COX-2抑制剂(NS398)与人重组PCSK9蛋白先后处理HUVECs后,加入THP-1单核细胞检测单核-内皮细胞黏附性。结果 ox-LDL上调HUVECs的PCSK9、TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达(P均0.05);人重组PCSK9蛋白在ox-LDL基础上上调TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达(P均0.05);PCSK9 siRNA转染可抑制ox-LDL对TLR4、NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达的上调作用(P均0.05);TAK-242抑制人重组PCSK9蛋白对TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达的上调作用(P均0.05);PDTC抑制人重组PCSK9蛋白对NF-κB p65、COX-2 mRNA和蛋白表达的上调作用(P均0.05);NS398可抑制人重组PCSK9蛋白的促单核-内皮细胞黏附作用(P均0.05)。结论 PCSK9可通过TLR4/NF-κB/COX-2途径调节单核-内皮细胞黏附性。     

氧化低密度脂蛋白通过血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1诱导血管内皮细胞粘附分子的表达

目的探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）在氧化低密度脂蛋白（ox—LDL）诱导血管内皮细胞粘附分子表达中的作用。方法用不同浓度ox-LDL培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,用RrealtimeRT—PCR测定LOX-1 mRNA的表达;RT—PCR测定细胞间粘附分子1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子1（VCAM-1）以及E选择素的mRNA表达;用Westernblot测定LOX-1、ICAM-1、VCAM-1以及E选择素蛋白的表达,观察ox-LDL对血管内皮细胞粘附分子表达的影响。HUVECs预先用聚肌苷酸[poly（I）]和爱兰苔胶处理,再用ox—LDL培养,再分别测定上述粘附分子的表达水平,比较加入LOX-1阻断剂前后粘附分子表达的变化。结果ox-LDL各剂量组皆可上调LOX-1、ICAM-1、E选择素的mRNA和蛋白表达（P〈0．01）,在10～50μm/ml剂量范围内呈现明显的剂量一效应关系（P〈0．01）,但ox—LDL对VCAM-1的表达没影响。HUVECs预先与250μg／ml的poly（Ⅰ）或爱兰苔胶作用2h,然后加入50μg/ml的ox—LDL作用24h。poly（Ⅰ）和爱兰苔胶都能抑制ox—LDL诱导的LOX-1、ICAM-1和E选择素的mRNA和蛋白表达水平,与未阻断组相比,差异皆有统计学意义（P〈0．01）。结论ox—LDL可以上调血管内皮细胞粘附分子的表达,LOX-1受体阻断剂可以部分阻断ox—LDL的上调作用,ox-LDL诱导血管内皮细胞粘附分子的表过是通过LOX-1介导的。     

异常血流动力对TLR4/NF-κB信号传导通路及其下游炎症因子的影响

目的研究异常血流应力或压力单独作用对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/NF-κB信号传导通路及下游炎症因子:血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)等的影响,探讨异常血流动力导致动脉粥样硬化的机制。方法将生长良好的HUVECs以1×105个/ml密度接种于细胞综合应力刺激实验系统(型号BIO-CCS13)中进行干预。将HUVECs按所受的应力不同分成应力组、压力组和正常组。在各组应力作用下培养一天后收集细胞备用,用q PCR方法测定TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)、肿瘤坏死因子受体相关因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF-6)、血凝素样氧化低密度酯蛋白受体-1(LOX-1)、核因子-κB(NF-κB)、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的基因表达,用蛋白质印迹方法测定TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的蛋白表达。结果与正常组比较,应力组和压力组TLR4、My D88、TRAF-6、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1m RNA表达水平显著升高(P0.01),TLR4、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P0.01)。结论异常血流动力导致动脉粥样硬化的机制可能与激活TLR4/NF-κB信号传导通路和增强下游炎症因子:LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1等的表达有关。     

活化Toll样受体4诱导静脉血管内皮细胞介导非耐受性炎症反应

目的:通过分析活化Toll样受体4(TLR4)对人脐静脉内皮细胞分泌炎性细胞因子的影响,探讨静脉内皮细胞在炎症反应中的作用.方法:逆转录聚合酶链式反应检测TLR4和细胞因子信使核糖核酸(mRNA)在人脐静脉内皮细胞中的表达,流式细胞分析检测TLR4及其辅助受体CD14的蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清中细胞因子的表达水平.结果:TLB4配体脂多糖诱导了人脐静脉内皮细胞中TLB4的基因和蛋白表达上调以及CD14的蛋白表达上调.活化TLR4显著上调人脐静脉内皮细胞中炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-8的基因表达以及IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的蛋白表达,并呈剂量依赖关系.活化TLR4诱导的细胞因子上调依赖NF-кB信号传导途径,信号传导阻滞剂能抑制细胞因子的表达上调.而且初次活化后,TLR4的再次活化仍然诱导高水平的炎性细胞因子.结论:活化TLR4诱导静脉内皮细胞分泌炎性细胞因子,介导非耐受性炎症反应,提示静脉内皮细胞是重要的炎症效应细胞.     

丹皮酚对高血压患者血管内皮细胞Toll样受体4、核因子-κB表达的影响

目的 观察丹皮酚对Toll样受体(TLR)、核因子(NF) -κB信号转导通路的影响,探讨其对高血压患者血管内皮细胞的保护机制.方法 10％高血压患者及健康人血清干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)24 h,实时荧光定量(PCR)法检测TLR4 mRNA表达.不同浓度的丹皮酚干预脂多糖(LPS)诱导的HUVEC-C TLR4表达(24 h)及NF-κB活化(2 h),PCR法测TLR4 mRNA及NF-κB mRNA的表达,免疫印迹技术测TLR4蛋白及NF-κB蛋白的表达.结果 血清作用24 h后,高血压病组TLR4 mRNA的表达较健康组增高(P＜0.01).丹皮酚可呈剂量依赖性减少LPS诱导的TLR4 mRNA高表达,抑制LPS诱导的TLR4蛋白高表达和IκBα蛋白的降解(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001).结论 TLR-NF-κB信号途径介导的炎症反应和免疫紊乱是高血压病血管内皮损伤的机制之一,丹皮酚可通过抑制其表达保护血管内皮细胞损伤.     

OxLDL/LOX-1系统及NF-κB通路在糖尿病血管内皮功能障碍中的作用机制

腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型(DM组),结果显示糖尿病大鼠2周时氧化低密度脂蛋白(oxLDL)水平已高于正常对照大鼠[(2.87±0.40对2.27±0.36)μg/dl,P＜0.05],血管舒张反应迟钝;6周时oxLDL水平更高[(4.32 ±0.66) μg/dl,P＜0.01],乙酰胆碱诱导的血管环舒张最大百分比(Rmax)明显降低(P＜0.01),糖尿病大鼠主动脉植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1( LOX-1)、NF-kB、内皮细胞间黏附分子1(ICAM-1)蛋白及mRNA表达明显高于正常对照大鼠(P＜0.01),糖尿病大鼠LOX-1 mRNA表达水平与外周血oxLDL水平、NF-kBp65、ICAM-1 mRNA表达水平正相关,与Rmax呈负相关.提示OxLDL/LOX-1系统可能通过激活NF-kB,上调ICAM-1的表达,导致糖尿病早期内皮功能障碍.     

In vivo and in vitro expression of adhesion molecules by peripheral blood lymphocytes from patients with primary Sjogren's syndrome: culture-associated enhancement of LECAM-1 and CD44

The interaction of adhesion receptors on lymphocytes with their ligands over endothelial cells provides the mechanism by which lymphocytes infiltrate target tissues in autoimmune diseases. Primary Sjogren's syndrome (SS) is associated with lymphocytic infiltration in exocrine glands. The aim of this study was to examine levels of expression of adhesion molecules by peripheral blood lymphocytes from patients with SS (before and after stimulation). Peripheral blood lymphocytes from 16 patients with primary SS and from 15 controls were stained directly or cultured for 72 h with and without phytohaemagglutinin (PHA). Indirect immunofluorescence with monoclonal antibodies and flow cytometry were used. The following molecules were detected in patients before culture: CD18 (mean percentage 94%), CD11a (94%), CD11b (39%), CD54 (23%), CD58 (62%), CD44 (Hermes-1; 82%), CD49-d (VLA-4; 80%), CD25 (11%) and LECAM-1 (62%). After stimulation with PHA, there was an increase in the levels of CD18 (2.5-fold), CD11a (2.3-fold), CD54 (10.2-fold), CD58 (2.5-fold), CD44 (2.4-fold), CD49d (3.4-fold) and CD25 (62-fold) on lymphocytes from both patients and controls. The number of positive cells and level of expression did not differ from the controls, except in the case of unstimulated, cultured lymphocytes in which the levels of CD44 and LECAM-1 were increased more in patients than in normal controls. The increase in the level of in vitro expression of CD44 (P< 0.05) and LECAM-1 (P< 0.002) on lymphocytes from patients with primary SS reached statistical significance when compared to similarly cultured lymphocytes from controls. The regulation of LECAM-1 and CD44 expression in patients with SS may contribute to the immunopathogenesis of this desease by increased tethering or rolling (early adhesive events) of lymphocytes over endothelial cells. Such molecules may be involved in lymphocytic homing to tissues in SS.     

The expression of chemokine receptor CXCR3: relevance to disease activity of rheumatoid arthritis

 CXC chemokine receptor 3 (CXCR3) is selectively expressed on T helper 1 (Th1) type T cells and has been shown to be responsible for Th1-dominant immune responses. In this study, we analyzed the expression of CXCR3 on peripheral blood T lymphocytes of patients with rheumatoid arthritis (RA) by FACS analysis using antihuman CXCR3 monoclonal antibody and determined the clinical relevance in this disease. Significantly higher expression of CXCR3 was found on peripheral blood CD4+ T lymphocytes of RA patients than healthy controls. The CXCR3 expression in RA patients with a high erythrocyte sedimentation rate was significantly higher than in those with a low erythrocyte sedimentation rate. Moreover, we found that the CXCR3 expression in RA patients with long-term disease duration was significantly higher than in those with short-term disease. On the other hand, CC chemokine receptor 4 (CCR4), which was shown to be selectively expressed on Th2-type T cells, was expressed at low levels in RA patients as well as in healthy controls. The serum level of interleukin (IL)-18 in RA patients was higher than that in healthy controls, although there was no statistically significant difference. This study suggests that the Th1 immune response is predominant in RA and that CXCR3 may have relevance in regard to the disease course in RA patients. Received: January 28, 2002 / Accepted: August 14, 2002     

反式载脂蛋白A1模拟肽R-D4F对内皮祖细胞黏附及迁移功能的影响

目的探讨反式载脂蛋白A1模拟肽R-D4F对人内皮祖细胞黏附及迁移功能的影响。方法取新鲜人脐静脉血,采用密度梯法从中分离、诱导培养人内皮祖细胞,并使用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1染料进行双荧光染色以及流式细胞术进行鉴定。分别给于牛血清白蛋白、顺式D-4F(50μg/ml)及R-D4F(5~50μg/ml)处理后,采用黏附能力测定实验及Transwell小室观察内皮祖细胞黏附及迁移能力的变化。结果与牛血清白蛋白对照组相比,D-4F显著增强内皮祖细胞的黏附及迁移功能。相似的是,R-D4F呈剂量依赖性地增强内皮祖细胞的黏附与迁移。结论 R-D4F具有与D-4F相似的生物学作用,可促进人内皮祖细胞的黏附及迁移。     

外周血中TLR4、TIRAP表达与脓毒症相关性研究

目的探讨外周血中TOLL样受体4(TLR4)及TOLL/白介素-1受体相关蛋白(TIRAP)水平与脓毒症严重程度的相关性。方法 30例正常健康体检者为正常组,53例脓毒症患者,进行APACHEⅡ评分,APACHEⅡ≤20患者40例为脓毒症低评分组,APACHEⅡ20患者13例为脓毒症高评分组。所有研究对象应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测静脉血清总TLR4、TIRAP浓度。结果血清中TLR4及TIRAP浓度:正常组为0.886±0.058 ng/ml及5.216±0.410 ng/ml、脓毒症低评分组为2.253±0.379 ng/ml及9.540±2.294ng/ml、脓毒症高评分组为4.494±0.709 ng/ml及19.206±1.755 ng/ml,脓毒症低评分组及脓毒症高评分组与正常组相比均有显著性差异(P均=0.000),脓毒症低评分组与脓毒症高评分组相比存在显著性差异(P均=0.000)。以APACHEⅡ评分等于20分为界,即脓毒症低评分组为低危患者,脓毒症高评分组为高危患者,来区分脓毒症严重程度。经Pearson相关分析,TLR4浓度与脓毒症严重程度呈正相关(r=0.931,P0.05),TIRAP浓度与脓毒症严重程度也呈正相关(r=0.972,P0.05),TLR4浓度与TIRAP浓度呈正相关(r=0.936,P0.05)。结论脓毒症患者血清总TLR4、TIRAP水平可以预测及判断脓毒症严重程度。