高糖对心肌细胞损害调节新机制:烟酰胺核糖通过Sirt3- p53/PGC-1α改善线粒体自噬及线粒体合成

目的 明确烟酰胺核糖（nicotinamide riboside,NR）对成年小鼠心肌细胞在高糖条件下线粒体自噬及线粒体合成的影响及潜在机制。方法 分离成年小鼠心肌细胞后,将细胞分为:①对照组;②高糖组;③高糖+NR组;④高糖+NR+Sirt3siRNA;⑤高糖+NR+过氧化物酶体增生物活化受体γ共激活剂(Peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator,PGC)-1α siRNA组;⑥高糖+NR+nutlin-3组。采用TUNEL法,流式细胞术检测凋亡指数(AI),JC-1染色检测线粒体膜电位,Western blot法检测自噬相关蛋白Atg5、LC3,p62等蛋白表达水平,线粒体自噬相关蛋白Parkin,线粒体合成相关蛋白PGC-1α,Tfam蛋白表达水平,Sirt3。结果 与对照组相比,高糖干预后细胞AI增加（P<0.01）,线粒体膜电位降低（P<0.01）,PGC-1α、Tfam、Sirt3、Atg5、LC3和Parkin表达降低（P<0.01）、p62表达升高（P<0.01）。加入NR后,细胞凋亡减少（P<0.01）,线粒体膜电位增高（P<0.01）,PGC-1α、Tfam、Sirt3、Atg5、LC3和Parkin表达增高（P<0.01）、p62表达降低（P<0.01）,然而,加入Sirt3siRNA,NR的作用减弱（P<0.01）;加入PGC-1αsiRNA,NR作用减弱（P<0.01）,加入nutlin-3后,NR作用减弱（P<0.01）。结论 NR通过加入p53激动剂nutlin-3,改善线粒体自噬,NR通过提高PGC-1α表达水平改善线粒体合成,最终减轻高糖对成年小鼠心肌细胞的损伤。     

MCU及线粒体分裂介导的曲美他嗪抗心肌缺血再灌注损伤的实验研究

目的探讨线粒体钙单向转运蛋白(MCU)和线粒体分裂在曲美他嗪(TMZ)保护心肌避免缺血再灌注损伤(I/R)中的作用。方法建立小鼠心肌I/R的动物模型,观察TMZ给药对心肌细胞凋亡的作用;建立原代C57BL6乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型(H/R),给与TMZ处理,观察TMZ加入对H/R引起的线粒体MCU表达、线粒体分裂、细胞凋亡相关蛋白表达的作用。通过转染siRNA敲低MCU、腺病毒载体过表达MCU等干预措施,探讨MCU表达对线粒体分裂和细胞凋亡的作用机制。结果在小鼠模型中TMZ可抑制I/R损伤引起的心肌凋亡。体外实验中H/R引起MCU表达上调,增加线粒体分裂和细胞凋亡,而siRNA敲低MCU可逆转这些损伤改变;TMZ下调H/R引起的MCU的高表达并抑制胞浆线粒体分裂蛋白向线粒体转移,从而减少线粒体分裂及细胞凋亡;过表达MCU能取消TMZ对H/R的保护作用。结论 TMZ通过下调MCU的表达,减少线粒体分裂,抑制凋亡,从而减轻心肌I/R损伤。     

激活Notch1通路减轻高温高湿条件下H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的明确Notch1通路在高温高湿条件下H9C2心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)损伤中的作用及其潜在机制。方法常规培养H9C2心肌细胞并将其分6组即对照组;H/R组;高温高湿组;高温高湿+H/R组;高温高湿+Jagged1(Notch1激动剂)+H/R组;高温高湿+溶剂+H/R组。TUNEL法检测细胞凋亡,荧光探针JC-1检测线粒体膜电位,ATP检测试剂盒检测ATP含量,Western blot检测Notch1细胞内段(Notch1 intracellular domain,Notch1 ICD)、Hairy和分裂增强子(Hairy and enhancer of split,Hes1)、微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociated protein1 light chain 3,LC3)和p62的蛋白表达水平。结果与对照组相比,急性损伤H/R后,细胞凋亡增加(P0.05),线粒体膜电位降低(P0.05),ATP含量减少(P0.05),Notch1 ICD、Hes1、LC3-II/I(p62相应降低)表达升高(P0.05),而慢性损伤高温高湿后,细胞凋亡增加(P0.05),线粒体膜电位降低(P0.05),ATP含量减少(P0.05),Notch1 ICD、Hes1、LC3-II/I表达降低(p62相应升高)(P0.05);和H/R组或高温高湿组对比,高温高湿+H/R组中细胞凋亡进一步增加(P0.05),线粒体膜电位和ATP含量进一步降低(P0.05),Notch1ICD、Hes1、LC3-II/I表达进一步降低(p62进一步升高)(P0.05);和高温高湿+H/R组对比,加入Notch1激动剂Jagged1后,细胞凋亡减少(P0.05),线粒体膜电位和ATP含量增高(P0.05),Notch1 ICD、Hes1、LC3-II/I表达升高(p62相应降低)(P0.05)。结论激活Notch1通路通过促进自噬从而缓解高温高湿条件下H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

TRAF6基因对缺氧复氧肝细胞凋亡、Caspase-3、Caspase-9表达及线粒体膜电位的影响

目的探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因对缺氧复氧(H/R)肝细胞凋亡、Caspase-3和Caspase-9表达及线粒体膜电位的影响。方法人正常肝L02细胞分为对照组(不进行转染和H/R处理)、H/R组(细胞缺氧12 h,复氧12 h)、H/R+NC组(转染NC后进行H/R处理)和H/R+si-TRAF6组(转染si-TRAF6后进行H/R处理)。Western blotting检测TRAF6、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达。流式细胞仪检测细胞凋亡率及膜电位变化。结果 si-TRAF6转染L02细胞后,细胞中TRAF6蛋白表达明显降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。H/R处理可明显上调L02细胞TRAF6、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达,促进细胞凋亡,降低线粒体膜电位,而抑制TRAF6蛋白表达可降低TRAF6、Caspase-3和Caspase-9表达,抑制细胞凋亡,提高线粒体膜电位。结论抑制TRAF6基因表达可降低H/R诱导的L02细胞凋亡,提高线粒体膜电位,下调Caspase-3和Caspase-9表达。     

瑞舒伐他汀强化治疗对心肌梗死PCI术后小鼠心肌线粒体稳态的影响

目的观察瑞舒伐他汀强化治疗对心肌梗死经皮冠状动脉介入(PCI)术后小鼠心肌线粒体稳态的影响。方法选取雄性小鼠40只,随机分为假手术组、模型组、瑞舒伐他汀1组、瑞舒伐他汀2组,每组10只。假手术组与模型组在手术前1周予以5 mg/kg的蒸馏水灌胃;瑞舒伐他汀1组在手术前1周予以5 mg/kg瑞舒伐他汀灌胃;瑞舒伐他汀2组在手术前1周予以20 mg/kg瑞舒伐他汀灌胃。各组均为每日1次,共灌胃8周。观察各组血流动力学相关指标、心肌线粒体各相关标志物蛋白表达、线粒体膜电位及线粒体三磷酸腺苷(ATP)合成活力。结果与假手术组比较,模型组左心室收缩期内压(LVESP)、左心室压力上升最大速率(+dp/dtmax)水平降低,左心室压力下降最大速率(-dp/dtmax)、左心室舒张末期内压(LVEDP)水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,瑞舒伐他汀2组+dp/dtmax水平升高,-dp/dtmax、LVEDP水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);瑞舒伐他汀2组+dp/dtmax高于瑞舒伐他汀1组(P<0.05),-dp/dtmax低于瑞舒伐他汀1组(P<0.05)。与假手术组比较,模型组心肌线粒体功能学指标膜电位、ATP合成活力降低,活性氧(ROS)生成速率增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,瑞舒伐他汀2组膜电位、ATP合成活力升高,ROS生成速率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,模型组PINK1、Beclin1、Drp1蛋白表达升高,Mfn2蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,瑞舒伐他汀2组、瑞舒伐他汀1组PINK1、Beclin1、Mfn2蛋白表达升高,Drp1蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,模型组心肌线粒体生物合成指标COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05);瑞舒伐他汀2组COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表达均高于模型组(P<0.05),瑞舒伐他汀1组PGC-1α高于模型组(P<0.05);瑞舒伐他汀2组心肌线粒体生物合成指标COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表达均高于瑞舒伐他汀1组(P<0.05)。结论与5 mg/kg的瑞舒伐他汀用药方案比较,瑞舒伐他汀强化治疗心肌梗死PCI术后的心肌线粒体稳态更加具有实效性。     

上调Yes相关蛋白对缺氧复氧心肌细胞损伤保护作用的实验研究

目的研究Yes相关蛋白(YAP)在缺氧复氧(H/R)心肌细胞损伤中的作用。方法用过表达YAP重组慢病毒感染心肌细胞,给予H/R处理,用real-time PCR和Western blot检测细胞中YAP表达情况。CCK8法测定增殖变化,二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术检测凋亡变化,Western blot检测活化型Caspase-3和Caspase-9蛋白水平,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平,黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,JC-1法检测线粒体膜电位,Western blot法检测胞浆和线粒体中细胞色素C(Cytochrome C)蛋白水平。结果过表达YAP重组慢病毒感染可以提高H/R条件下心肌细胞中YAP表达水平。H/R处理后的心肌细胞增殖活性降低,LDH漏出率升高,细胞凋亡率升高,细胞中活化型Caspase-3和Caspase-9蛋白水平升高,ROS水平也升高,SOD活性降低,线粒体膜电位下降,胞浆中Cytochrome C蛋白水平升高,线粒体中Cytochrome C蛋白水平降低。上调YAP可以提高H/R条件下心肌细胞增殖活性,降低LDH漏出率,减少细胞凋亡,降低细胞中活化型Caspase-3和Caspase-9蛋白水平表达,提高SOD活性,减少细胞中ROS水平,提高线粒体膜电位,降低胞浆中Cytochrome C蛋白水平,提高线粒体中Cytochrome C蛋白水平。结论上调YAP减轻缺氧复氧心肌细胞损伤,减少细胞凋亡,作用机制可能与提高抗氧化酶活性,减少细胞内ROS水平,抑制线粒体凋亡途径有关。     

烟酰胺核糖抑制1型糖尿病大鼠心肌线粒体分裂的作用及机制

目的 探讨烟酰胺核糖（nicotinamide riboside, NR）对1型糖尿病（DM）大鼠心肌线粒体融合分裂的作用及其机制。 方法 利用链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导1型DM大鼠模型,随机分为4组:正常对照（Con）组,Con+NR组,DM组,DM+NR组。监测大鼠血糖和体质量变化,葡萄糖耐量试验（IPGTT）检测糖代谢情况,采用小动物超声评估大鼠心脏功能变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,DHE染色检测心肌细胞ROS含量,透射电镜观察线粒体形态,Western blot法检测线粒体分裂、融合相关蛋白表达水平。 结果 与Con组相比,DM组大鼠的血糖、血脂明显升高,体质量减轻,心脏左室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左心室短轴缩短率（Left ventricular fractional shortening, LVFS）减低,心肌细胞凋亡增加,氧化应激增强,线粒体分裂增多,线粒体融合蛋白Opa1表达下调（P<0.05, P<0.01）;与DM组相比,DM+NR组大鼠心脏LVEF改善,心肌细胞凋亡减少,氧化应激减少,线粒体融合增加,线粒体融合蛋白Opa1和Mfn2表达上调（P<0.05）。 结论 NR可增加DM心肌融合蛋白Opa1与Mfn2的表达,抑制DM心肌线粒体分裂,降低DM心肌凋亡和氧化应激,改善心脏功能。     

血管紧张素(1-7)抑制异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞凋亡

目的观察血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]对心肌细胞凋亡的影响,探讨其可能的作用机制。方法应用异丙肾上腺素(ISO)处理H9c2心肌细胞12 h建立心肌细胞凋亡模型,Ang(1-7)或PI3K抑制剂LY294002与H9c2心肌细胞共处理12 h观察对ISO诱导的心肌细胞凋亡的影响。显微镜下观察H9c2心肌细胞生长情况,采用MTS法检测各组细胞的相对细胞活性,TUNEL法检测各组细胞凋亡率。JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,Western blot检测cleaved Caspase-3、p-Akt及Akt蛋白的表达量。结果 ISO呈浓度依赖性抑制H9c2心肌细胞的相对细胞活性,Ang(1-7)呈浓度依赖性逆转ISO诱导的H9c2心肌细胞相对活性的降低;与对照组比较,ISO组细胞凋亡率及cleaved Caspase-3蛋白表达量显著增加,线粒体膜电位和p-Akt蛋白表达量显著降低;Ang(1-7)可抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞凋亡率的增加,减少cleaved Caspase-3蛋白的表达,增加线粒体膜电位和p-Akt蛋白表达量。LY294002预处理后Ang(1-7)对ISO诱导的H9c2心肌细胞的保护作用明显减弱,表现为心肌细胞凋亡率及cleaved Caspase-3蛋白的表达量明显增加,p-Akt蛋白表达量减少。结论 ISO能诱导H9c2心肌细胞线粒体途径的细胞凋亡,而Ang(1-7)能抑制ISO诱导的线粒体途径的细胞凋亡。PI3K/Akt信号通路可能在Ang(1-7)抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞凋亡中起到关键作用。     

sRAGE对缺氧/复氧大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响

目的观察可溶性糖基化终产物受体(sRAGE)对缺氧/复氧(H/R)大鼠心肌细胞线粒体凋亡途径的影响。方法取大鼠心肌细胞培养72 h,以缺氧3 h、复氧2 h复制H/R模型,实验分为4组:对照组、对照+sRAGE组、H/R组、H/R+sRAGE组。以荧光探针JC-1方法检测线粒体膜电位,酯化钙黄绿素和氯化钴共孵育测定线粒体通透性转换孔(mPTP)开放,Western blot方法检测心肌细胞凋亡。结果与对照组比较,H/R组mPTP开放增多,线粒体膜电位去极化程度增加,凋亡率升高(P均<0.05);与H/R组比较,H/R+sRAGE组mPTP开放减少,线粒体膜电位去极化程度减轻,凋亡率下降(P均<0.05)。结论 sRAGE可通过抑制线粒体凋亡途径,拮抗心肌H/R损伤。     

磷酸肌酸对心肌细胞线粒体的保护作用

目的 :研究能量治疗对心力衰竭的治疗机制。观察磷酸肌酸 （phosphocreatine,CP）对心肌细胞线粒体膜电位的保护作用。方法 :采用胶原酶分离成年大鼠心肌细胞 ,0 .2 mmol/ L H2 O2 刺激细胞 ,于刺激前 10 min加入 10mm ol/ L CP,利用荧光探针 JC-1结合流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化 ;Annexin-V/ PI及 TUNEL 染色法鉴定心肌细胞的凋亡。结果 :H2 O2 导致线粒体膜电位下降 ,细胞凋亡增加。CP有效地减低了线粒体膜电位的下降 ,减少了细胞凋亡。结论 :CP能够抗心肌细胞氧化损伤 ,其机制可能依赖于减少或抑制线粒体膜电位的下降 ,保护了线粒体的正常功能     

沙库巴曲缬沙坦调节线粒体动力系统改善缺氧心肌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨沙库巴曲缬沙坦（Sacubitril Valsartan,S/V）通过调节线粒体动力系统对缺氧H9c2心肌细胞凋亡保护作用。方法 实验分为3组: 对照组、造模组、造模 S/V组。流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,JC-1检测线粒体膜电位,蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）检测线粒体融合蛋白1（Mfn1）、线粒体融合蛋白2（Mfn2）、动力相关蛋白 1 (Drp1)、线粒体分裂蛋白1（Fis1）、细胞色素C（CytC）、B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白（Bax）及含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3 (Caspase-3)表达情况。采用 GraphPad Prism 8统计软件进行数据分析,多组间比较采用单因素方差分析。结果 H9c2心肌细胞建立糖氧剥夺模型,经S/V处理光镜下心肌细胞形态学明显改善;流式细胞技术分析S/V明显降低细胞内ROS水平,抑制心肌细胞凋亡（P＜0.05）;荧光显微镜分析提示S/V明显改善线粒体膜电位水平（P＜0.05）;WB显示S/V可明显提升Mfn2、Mfn1、Bcl2蛋白表达水平,降低Drp1、Fis1、CytC、Bax及Caspase-3蛋白表达水平（P＜0.05）。结论 S/V可能通过促进线粒体融合、抑制线粒体分裂调节线粒体稳态,减少ROS生成,减轻心肌细胞凋亡。     

PPARα/PGC-1α信号通路对阿霉素损伤H9c2心肌细胞能量代谢的调节

目的:探讨过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)信号通路对阿霉素损伤后H9c2心肌细胞能量代谢的调节。方法:将传代后生长良好的H9c2心肌细胞随机分为4组:空白对照组(C组)、阿霉素损伤组(DI组)、PPARα预激动组(PPA组)和PPARα预抑制组(PPI组),药物预处理后予以阿霉素建立心肌细胞损伤模型。细胞继续培养24h后,荧光定量RT-PCR方法检测PPARα、PGC-1α和P300基因表达变化,运用Western blotting方法测定PPARα、PGC-1α及P300蛋白表达情况,高效液相色谱法(HPLC)测细胞线粒体内的腺苷酸含量。结果:与对照组相比,阿霉素损伤组、PPARα预抑制组中PPARα、PGC-1α及P300的表达均下降(P0.01),高能磷酸盐的含量均显著降低(P0.01)。与阿霉素损伤组、PPARα预抑制组相比,PPARα预激活能够提高PPARα、PGC-1α及P300的表达(P0.01),增加高能磷酸盐的含量(P0.01)。结论:阿霉素能够通过减少PPARα/PGC-1α轴的表达降低H9c2心肌细胞内磷酸腺苷含量,影响H9c2心肌细胞的能量代谢。而PPARα/PGC-1α轴的预激活能够增加阿霉素损伤H9c2心肌细胞磷酸腺苷的含量,改善H9c2心肌细胞能量代谢。     

当归补血汤超滤物对大鼠心肌细胞线粒体凋亡通路的影响

目的探讨当归补血汤超滤膜提取物对大鼠心肌细胞线粒体凋亡通路的影响。方法原代培养Wistar大鼠乳鼠心肌细胞,阿霉素诱导心肌细胞凋亡。实验分正常组、阿霉素组(2.5 mg/L)、当归补血汤超滤膜提取物低、中、高剂量干预组(阿霉素造模前,预先给予含30,60,120 mg/L当归补血汤超滤膜提取物完全培养基培养2 h)。MTT法检测各组细胞存活率,荧光显微镜下各组细胞凋亡形态学观察,激光共聚焦技术测定各组心肌细胞线粒体膜电位水平,蛋白印迹法测定各组Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白表达水平。结果与正常组相比,阿霉素组心肌细胞存活数明显降低,可见细胞凋亡及线粒体膜电位降低;Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax、Caspase-3表达水平升高(P0.05);与阿霉素组比较,当归补血汤超滤膜提取物干预组的心肌细胞存活数明显升高,凋亡细胞数目减少,线粒体膜电位升高,Bax、Caspase-3表达水平下调,Bcl-2蛋白表达水平上调(P0.05)。结论线粒体凋亡通路的激活是阿霉素诱导心肌细胞凋亡的机制之一,当归补血汤超滤膜提取物可调控该通路发挥心肌细胞保护作用。     

MNK2通过激活cAMP/PKA-CREB通路促进小鼠心肌缺血再灌注损伤后修复功能及机制

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶2(MNK2)是否能够抑制缺氧复氧诱导的小鼠心肌细胞凋亡并促进心脏修复,以及其相关机制。方法 构建心肌细胞缺氧复氧(H/R)体外模型,实验分为：H/R+空载体组、H/R+MNK2过表达组和H/R+siRNA-MNK2组。构建成年小鼠心脏缺血再灌注(I/R)损伤模型,实验分为：I/R+空载体组、I/R+MNK2过表达组。Western blot检测各组MNK2、p-MNK2以及Bax、Bcl-2等凋亡指标蛋白表达;TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡水平;心脏超声检测心脏功能差异。后续对H/R+MNK2过表达组和H/R+空载体组的原代心肌细胞进行RNA测序分析(RNA-seq),通过差异基因富集及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析MNK2抗凋亡作用的相关机制,并验证筛选出cAMP/PKA-CREB信号通路的调控关系。结果 体外H/R模型及体内I/R模型中p-MNK2表达水平较对照组显著升高。体外实验中,MNK2过表达腺病毒转染显著增加心肌细胞中MNK2和p-MNK2蛋白表达水平,凋亡指标蛋白Bcl-2表达增加,Bax表达减少,心肌细胞凋亡水平下降...     

沙库巴曲缬沙坦对缺氧心肌细胞线粒体动力系统和细胞凋亡的影响

目的 验证沙库巴曲缬沙坦(S/V)能否通过调节线粒体动力系统改善缺氧大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)凋亡水平,发挥心脏保护作用。方法 培养H9c2心肌细胞,建立糖氧剥夺模型(OGD),将细胞分为对照组、造模组、药物组。对照组正常培养心肌细胞,造模组采用OGD建模,药物组采用OGD建模后加用S/V 20μmol/L干预处理,每组重复5遍。采用流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧(ROS),JC-1检测线粒体膜电位,蛋白质免疫印迹法(WB)检测线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、细胞色素C(CytC)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)及含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表达情况。采用GraphPad Prism 8统计软件进行数据分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。结果 H9c2心肌细胞建立OGD模型,经S/V处理后,光镜下心肌细胞形态学明显改善;流式细胞技术分析结果显示S/V明显降低细胞内ROS水平,抑制心肌细胞凋亡(P＜0.05);荧光显微镜分析结果显示S/V明显改善线粒体膜电位水平(P＜0.05);WB结果显示S/V可明显提升Mfn2、Mfn1、Bcl2蛋白表达水平,降低Drp1、Fis1、CytC、Bax及Caspase-3蛋白表达水平(P＜0.05)。结论 S/V可能通过促进线粒体融合、抑制线粒体分裂调节线粒体稳态,减少ROS生成,减轻心肌细胞凋亡。     

U50，488H抑制心肌细胞缺氧/复氧诱导Drp1线粒体转位的作用及机制

目的 研究κ-阿片受体（κ-OR）激动剂U50,488H对缺氧/复氧（H/R）原代心肌细胞Drp1线粒体转位的作用与机制。 方法 将心肌细胞共分为6组,分别为常氧（Control）组、H/R组、H/R+U50,488H组、Control+Scramble RNAi组、H/R+Scramble RNAi组、H/R+Mid51 RNAi组。利用CCK-8试剂盒检测细胞活力;AnnexinV、PI试剂盒检测细胞凋亡;采用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态变化和Drp1与线粒体共定位情况,Western blotting检测细胞内线粒体外膜Drp1相关结合蛋白（Fis1、Mff、Mid49和Mid51）的表达水平。 结果 与常氧组相比,H/R组细胞凋亡与死亡率明显增加（P<0.01）,线粒体分裂明显增加（P<0.01）,Drp1的线粒体转位明显增多,Mid51表达显著上调（P<0.01）,但Fis1、Mff与Mid49的表达无明显差异;而κ-OR激动剂U50,488H可降低H/R后细胞凋亡与死亡率（P<0.01）,抑制线粒体分裂（P<0.01）,减少Drp1与线粒体的结合同时下调Mid51的表达水平（P<0.01）,但Fis1、Mff与Mid49的表达无明显变化;进一步研究发现,敲低Mid51可降低H/R后细胞凋亡与死亡率（P<0.01,P<0.05）,抑制线粒体的分裂（P<0.01）,减少Drp1的线粒体的转位。 结论 H/R可引起线粒体分裂与心肌细胞损伤,激活κ-OR可通过下调Mid51抑制Drp1的线粒体转位,进而抑制线粒体分裂,从而减轻H/R损伤。     

microRNA-1对心肌缺氧复氧中细胞凋亡的影响

目的明确心肌缺氧复氧(H/R)时miR-1的表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法建立乳大鼠心肌细胞H/R模型,TUNEL检测细胞凋亡、Western-Blot检测凋亡蛋白表达和实时荧光定量PCR检测miR-1表达。重组miR-1慢病毒感染乳大鼠心肌细胞,Western-Blot检测各组相关凋亡蛋白的表达。重组miR-1慢病毒感染乳大鼠心肌细胞后H/R处理,通过TUNEL检测心肌细胞凋亡,软件分析和计算心肌细胞凋亡率。结果心肌细胞H/R后,细胞凋亡率明显增加,同时促凋亡蛋白(Bax和Caspase-3)表达水平增加和抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降。在成功构建心肌细胞缺氧复氧细胞模型后,检测到心肌细胞miR-1表达水平下降。与对照组相比,感染LV-rno-miR-1组促凋亡蛋白(Bax和Caspase-3)明显增加和抗凋亡蛋白Bcl-2降低,而感染LV-rno-miR-1 sponge凋亡蛋白的结果相反。相对于感染LV-rnomiR-1组和缺氧复氧组,感染LV-rno-miR-1病毒后缺氧4小时复氧12小时,细胞凋亡率进一步增加。结论 miR-1具有促进细胞凋亡的作用。miR-1表达下降可能是心肌细胞缺氧复氧时维持稳态的一种自我调节机制。     

调控自噬对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响

目的探讨调控自噬水平对H9c2心肌细胞缺氧／复氧（H／R）损伤的影响及意义。方法将H9c2心肌细胞缺氧2h／复氧4h,建立H／R损伤模型。以3-甲基腺嘌呤（3-MA）为自噬特异抑制剂和雷帕霉素为自噬增强剂,试验随机分为四组：正常对照组（C组）、H／R组、H／R＋100mol／L3-MA组（M＋H／R组）、H／R＋100nmol／L雷帕霉素（R＋H／R组）,应用MTT法检测细胞活力,透射电镜检测心肌细胞自噬小体,流式细胞技术检测细胞凋亡比例,Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9、Caspase-3蛋白表达。结果H／R组明显诱导H9c2心肌细胞自噬发生、细胞活力下降、凋亡增加（P〈O．01）．Westernblot检测发现,Bax、Caspase-9、Caspase-3活性片段蛋白表达明显增加,Bcl-2表达明显抑制,Bax／Bcl-2比值、活化蛋白Caspase-3、Caspase-9表达增加（P〈O．01）;M＋H／R组H／R损伤作用明显减弱,线粒体凋亡通路及下游蛋白表达抑制（P〈O．01）;而R＋H／R组线粒体凋亡通路进一步激活,促进细胞凋亡发生（P〈O．01）。结论自噬在H9c2心肌细胞H／R损伤中起到致命性作用,抑制自噬可保护心肌细胞H,R氧化应激损伤,其机制与抑制线粒体凋亡通路有关。     

丁苯酞激活Hedgehog信号通路抑制缺氧复氧心肌细胞氧化应激、炎症、凋亡的机制研究

目的探讨丁苯酞(NBP)对缺氧复氧(H/R)心肌细胞氧化应激、炎症、细胞凋亡的影响及其分子机制。方法将心肌细胞分为空白组、H/R组、NBP-L组(NBP浓度为2μmol/L)、NBP-M组(NBP浓度为10μmol/L)、NBP-H组(NBP浓度为50μmol/L)。噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,酶联免疫(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)水平,试剂盒检测活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、活化的多聚ADP-核糖聚合酶(cleaved PARP)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、PTCH、Smoothened(SMO)和Gli-1蛋白表达。使用Hedgehog信号通路抑制剂HPI-4处理心肌细胞,观察其对丁苯酞诱导的缺氧复氧心肌细胞氧化应激、炎症、凋亡的影响。结果与空白组比较,H/R组心肌细胞存活率、cyclinD1、CDK2蛋白表达量、SOD活性、PTCH、SMO和Gli-1蛋白表达量明显减少(P0.05),H/R组心肌细胞凋亡率、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白表达量、TNF-α、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平显著增加(P0.05)。与H/R组比较,NBP-L、NBP-M、NBP-H组显著提高H/R心肌细胞存活率、cyclin D1、CDK2蛋白表达量、SOD活性(P0.05),显著降低心肌细胞凋亡率、cleaved PARP、cleaved caspase-3蛋白、TNF-α、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平、PTCH、SMO和Gli-1蛋白水平(P0.05)。HPI-4部分逆转丁苯酞对缺氧复氧心肌细胞的保护作用。结论丁苯酞通过激活Hedgehog信号通路,促进缺氧复氧心肌细胞增殖,并抑制缺氧复氧心肌细胞氧化应激、炎症、凋亡。     

左旋卡尼汀联合CrkL降低缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤

目的研究左旋卡尼汀联合CT10激酶调节子样蛋白(CrkL)降低缺氧复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤的作用。方法利用H/R损伤心肌细胞H9c2,使用左旋卡尼汀处理。细胞计数试剂盒8(CCK-8)、流式细胞术、Western blot分别检测细胞的增殖、凋亡和细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、核因子κB(NF-κB)、CrkL水平。在细胞H9c2中转染pcDNA-CrkL,使用H/R处理或H/R+左旋卡尼汀处理。采用上述方法检测细胞增殖、凋亡等。结果与对照组比较,H/R组H9c2细胞的活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2、CrkL蛋白表达量明显降低,细胞凋亡率、Bax蛋白水平及炎症因子TNF-α、IL-1β、NF-κB的蛋白水平显著升高(P0.05)。与H/R组比较,左旋卡尼汀明显增加H/R诱导的H9c2细胞活力及Ki-67、PCNA、Bcl-2、CrkL蛋白表达量,显著降低细胞凋亡率、Bax蛋白水平及TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白水平(P0.05)。CrkL过表达明显提高H/R诱导的H9c2细胞活力和Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量,显著降低细胞凋亡率、Bax蛋白水平及TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白水平(P0.05)。与单独使用左旋卡尼汀或CrkL过表达比较,左旋卡尼汀联合CrkL过表达明显提高H9c2细胞的活力和Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量,显著降低细胞凋亡率、Bax蛋白水平及TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白水平(P0.05)。结论左旋卡尼汀联合CrkL可以促进缺氧复氧诱导的心肌细胞增殖,降低细胞凋亡和炎症反应,从而保护心肌细胞。