逆转录病毒载体介导的RNAi抑制MCF-7细胞E2F1蛋白表达的研究

目的 采用逆转录病毒载体介导的RNAi技术靶向抑制乳腺癌细胞MCF-7 E2F1蛋白的表达.方法 构建重组的表达E2F1siRNA的逆转录病毒载体,将重组载体和空载体转染入MCF-7细胞中,筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养,应用Western Blot方法检测各组细胞E2F1蛋白的表达情况.结果 筛选出4个转染逆转录病毒载体的单克隆,命名为SIR1～4,其E2F1蛋白表达量分别为0.776±0.012,0.768±0.013,0.764±0.012,0.720±0.016;转染空载体组和未转染细胞组E2F1蛋白表达量分别为1.512±0.011和1.494±0.013;SIR1～4 E2F1蛋白表达量低于空载体组及未转染组,差异有统计学意义(P<0.05),SIR1～4各组E2F1蛋白表达均受到抑制;空载体转染组与未转染组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论 逆转录病毒载体介导的RNAi技术特异、高效抑制靶基因的表达,为肿瘤基因治疗提供了新的思路和工具.     

RNA干扰对乳腺癌MCF-7细胞株WT 1基因表达的抑制作用

目的：为探索治疗乳腺癌新途径，研究RNA干扰（RNA interferance，RNAi）对MCF-7细胞株WT 1基因表达的抑制作用。方法：设计制备多对针对WT 1基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），转染MCF-7细胞，采用实时定量PCR（real—time quantitative polymerase chainreaction，RQ-PCR）法测定WT1 mRNA的表达，western blot测定WT1蛋白的表达，流式细胞仪检测加入长春新碱后的MCF-7细胞凋亡率。结果：siRNA能有效抑制WT1基因的表达，但不呈剂量关系，在较低浓度可维持RNAi至少4d时间，WT1基因表达下调的MCF-7细胞凋亡率增加。结论：RNAi能有效抑制MCF-7细胞中WT1基因的表达，同时转染siRNA后细胞对长春新碱敏感。     

化学修饰的siRNA对乳腺癌细胞VEGF基因表达抑制及凋亡的诱导作用

目的：体外水平探讨化学修饰的小干扰RNA（siRNA）介导的RNAi治疗乳腺癌的可行性。方法：选用阳离子脂质体Lipofectamine2000^TM作为转染试剂,将化学修饰的针对人VEGF基因的siRNA转染人类乳腺癌细胞株MCF-7。半定量RT—PCR和蛋白印迹试验分别检测转染前后细胞中VEGF、Bcl2和baxmRNA和蛋白水平表达的变化,Hoechst33258荧光染色分析细胞凋亡。结果：与未转染的正常细胞组相比,靶向VEGF基因的siRNA转染MCF-7后,细胞中VEGF及Bcl-2mRNA和蛋白表达水平显著降低,P〈0．01。bax基因的表达未发生明显变化,Bcl-2和bax比值下降。Hoechst33258荧光染色显示转染siRNA72h后细胞内可见凋亡小体。结论：化学修饰的siRNA介导的RNAi下调靶基因VEGF的表达,并对MCF-7细胞有明显的凋亡诱导作用。     

慢病毒载体过表达SATB1蛋白对乳腺癌细胞侵袭性的影响

目的构建SATB1基因过表达的慢病毒载体,检测其在MCF-7乳腺癌细胞中的表达及对癌细胞侵袭性的影响。方法应用DNA重组技术,将SATB1基因插入到含有绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体质粒GV287中,获得重组载体,经测序鉴定后转染293T细胞产生慢病毒载体GV287-SATB1,用GV287-SATB1转染人乳腺癌MCF-7,Western blot分析转染前后SATB1表达情况,穿膜实验检测MCF-7细胞的侵袭性。结果成功构建人MCF-7细胞SATB1基因过表达慢病毒载体,MCF-7细胞转染慢病毒载体后SATB1蛋白表达水平显著上调,细胞的侵袭性显著增强。结论 SATB1基因过表达的慢病毒载体,可在MCF-7乳腺癌细胞中过表达SATB1蛋白,并显著增强MCF-7细胞的侵袭性。     

紫杉醇耐药基因TXR1 对乳腺癌细胞耐药性的影响

目的:构建人紫杉醇耐药基因1（TXR 1）的表达载体并对MCF-7 人乳腺癌细胞系进行转染且检测其表达。方法:RT-PCR 方法扩增TXR 1 CDS 片段,并将扩增的片段插入pEGFP-C3 真核表达载体,构建成含TXR 1 cDNA 的重组载体pEG ?FP-TXR1,以脂质体介导该质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7,应用RT-PCR、Western Blot和荧光显微镜鉴定转染细胞中TXR 1 的表达。用MTT 法对转染前后的MCF-7 细胞进行紫杉醇耐药性分析。结果:成功构建含TXR 1 cDNA 的重组载体pEGFP-TXR1,转染MCF-7 细胞后成功表达TXR 1 蛋白,在转染的细胞中,证实有TXR 1 mRNA 和蛋白表达上调。MTT 法显示转染了TXR 1 的MCF-7 细胞获得紫杉醇耐药性。结论:成功构建TXR 1 表达载体,并在人乳腺癌细胞系MCF-7 得到表达,获得紫杉醇耐药性。      

慢病毒介导的siRNA干扰乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达的实验

目的研究慢病毒载体介导的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞系VEGF-C表达的敲减作用。方法构建慢病毒VEGF-C/siRNA载体,转染乳腺癌MCF-7细胞,采用Real-time PCR检测MCF-7细胞在转染前后VEGF-C的mRNA表达,计算其转染效率和VEGF-C敲减率。结果慢病毒VEGF-C/siRNA转染效率超过80%,其VEGF-C的mRNA表达敲减率达50%。结论慢病毒VEGF-C/siRNA转染率高,能有效敲减VEGF-C的mRNA表达。     

RNA干扰抑制Dicer对人乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的:观察应用RNA干扰(RNAi)技术抑制Dicer基因,对人乳腺癌MCF-7细胞生物学特征的影响。方法:选取人乳腺癌MCF-7细胞株,应用脂质体法转染Dicer siRNA序列,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot方法检测转染后Dicer基因的表达。应用MTT法和Transwell方法评价人乳腺癌细胞Dicer基因抑制前后生物学行为的变化。结果:RNAi可显著抑制MCF-7细胞Dicer基因的表达;和对照组比较,转染siRNA实验组Dicer mRNA水平在转染后24、48、72h明显降低(分别为0.00152、0.00063、0.00096,P＜0.01),且在转染后48h降低最明显,并且Dicer蛋白水平在转染后48h也明显降低(2.581±0.028,P＜0.01)。转染siRNA序列组的MTT吸光度值在转染后明显增高,Transwell穿膜细胞数在转染后48h也明显增多。结论:抑制Dicer基因在人乳腺癌细胞中表达后,人乳腺癌细胞增殖能力和细胞迁移能力明显增强。     

线粒体融合素基因-2对乳腺癌细胞RECK基因表达的影响

目的探讨线粒体融合素基因-2(mfn2)对乳腺癌细胞株MCF-7细胞中 RECK表达的影响。方法利用脂质体lipofectamine2000将构建的重组真核表达质粒pEGFP-mfn2转染MCF-7细胞。RT-PCR检测细胞mfn2和RECK基因 mRNA的转录水平;Weastern blot法检测mfn2及RECK蛋白的表达。结果转染pEGFP-mfn2质粒的MCF-7细胞可以稳定高表达mfn2, RECK基因在转染空质粒组和未转染组细胞中无表达,转染mfn2基因后RECK基因mRNA转录及蛋白的表达显著升高。结论mfn2基因可激活MCF-7细胞中RECK基因的表达。     

siRNA-TRF2对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的 构建表达端粒重复序列结合因子2基因小干扰RNA的腺病毒表达载体（rAd-shRNA-TRF2）,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法 根据预实验筛选出的针对人TRF2 mRNA的特异性siRNA靶序列,构建表达siRNA-TRF2的重组腺病毒载体rAd-shRNA-TRF2,转染人乳腺癌MCF-7细胞后,用MTT比色法检测MCF-7细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布情况。结果 rAd-shRNA-TRF2转染MCF-7细胞后,MCF-7细胞增殖抑制、细胞周期阻滞于G₀/G₁期、增殖指数显著下降。结论 通过RNAi抑制TRF2基因表达进而抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖的方法有望成为肿瘤基因治疗的一个新策略。     

ＲｈｏＡ小干扰ＲＮＡ抑制乳腺癌细胞株ＭＣＦ-７及其裸鼠皮下移植瘤的实验研究

目的　观察ＲｈｏＡ小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲｈｏＡ）对乳腺癌细胞株ＭＣＦ-７增殖、迁移、周期和凋亡的影响以及对裸鼠移植瘤生长的影响。方法　ｓｉＲｈｏＡＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００介导下转染乳腺癌细胞ＭＣＦ-７,转染４８ｈ后,采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测ＲｈｏＡ蛋白的表达,ＭＴＴ实验检测ｓｉＲｈｏＡ转染细胞的增殖变化,损伤刮擦实验检测ｓｉＲｈｏＡ转染细胞的迁移能力,流式细胞仪检测ｓｉＲｈｏＡ转染细胞的周期和凋亡,裸鼠移植瘤实验检测ｓｉＲｈｏＡ对肿瘤生长的影响。结果　成功转染ｓｉＲｈｏＡ的肿瘤细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示ＲｈｏＡ蛋白表达在ＭＣＦ-７细胞中明显下降;ｓｉＲｈｏＡ对ＭＣＦ-７细胞的增殖、迁移均有显著的抑制作用并能促进肿瘤细胞凋亡及细胞周期中Ｓ期细胞减少,Ｇ１／Ｇ０期细胞增加;裸鼠移植瘤内重复注射ｓｉＲｈｏＡ后肿瘤生长明显减缓。结论　ｓｉＲｈｏＡ能够明显抑制ＲｈｏＡ基因在乳腺癌细胞ＭＣＦ-７中的表达,部分逆转ＭＣＦ-７的恶性生物学行为并抑制裸鼠移植瘤的生长。     

细胞周期蛋白E小干扰RNA靶向调控乳腺癌细胞的生长

目的 研究乳腺癌细胞中细胞周期蛋白E(cyelin E)对乳腺癌细胞肿瘤生物学特征的影响.方法 用带有cyclin E小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体pEGFP/CCNE2转染乳腺痛细胞系MCF-7.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法分别在RNA水平和蛋白水平检测siRNA对细胞内cyclin E表达水平的影响,CCK-8方法检测转染后细胞株生长增殖能力以及对化疗药物的敏感性,流式细胞仪检测细胞周期的变化,裸鼠移植瘤成瘤实验检测转染后细胞成瘤能力的变化.结果 pEGFP/CCNE2转染后,MCF-7细胞内cyclin E的表达受到抑制,cyclin E mRNA相对表达水平为0.23±0.05,蛋白相对表达水平为0.24±0.05;细胞的生长增殖能力下降,抑制率为68.56%±0.08%,对化疗药物的敏感性增加;细胞被大量阻滞在G1期,G1期细胞占77.38%.细胞的成瘤能力降低,移植瘤体积缩小.结论 抑制乳腺癌细胞中cyclin E的表达能够抑制乳腺癌细胞的生长、分化和增殖,提高肿瘤对化疗药物的敏感性.     

Knockdown of the c-Jun-N-terminal kinase expression by siRNA inhibits MCF-7 breast carcinoma cell line growth

We have examined the effect of two small interference RNA against Jnk-1 and Jnk-2 in the breast cancer cell line MCF-7. The expression of the JNK-1 and JNK-2 is frequently elevated in breast cancer and is a frequent genetic abnormality in this malignancy. For a better understanding of its role in maintaining the malignant phenotype, we used small RNA interference (siRNA) directed against Jnk-1 or Jnk-2. We made control and Jnk-1 and Jnk-2 siRNA using vector plasmid, which was then transfected to reduce its expression in MCF-7 cells. We assessed the effects of JNK-1 or JNK-2 silencing on cell growth by western blot analysis, soft agar assay, cell proliferation assay, cell viability by MTT assay and caspase assay in vitro. Our data showed that siRNA against Jnk-1 or Jnk-2 markedly and durably reduced its expression in MCF-7 cells by up to 70%, decreased the growth rate of MCF-7 cells, inhibited colony formation in soft agar and significantly reduced cell growth in MCF-7 carcinoma culture cell line. We also found that depletion of JNK-1/2 in this manner promoted apoptosis of MCF-7 cells upon serum withdrawal. In addition, we found that MCF-7 cells did not exhibit any caspase-3 activity. In conclusion, we observed that JNK-1 and JNK-2 have a pivotal function in the development of breast cancer. Our data show that decreasing the JNK-1 or JNK-2 protein level in MCF-7 cells by siRNA could significantly inhibit MCF-7 cell growth in in vitro assay, and imply the therapeutic potential of siRNA on the treatment of breast cancer by targeting overexpression kinases such as JNK-1/2 and might be a potential therapeutic target for human breast cancer.     

HER2基因转染MCF-7细胞及生物学特性观察

目的:建立共表达HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)基因和ER(Estrogen Receptor)基因的细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-HER2,利用脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法和肿瘤细胞侵袭实验,观察转染细胞的生物学活性.结果:在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有HER2基因的高表达,转染后细胞的增殖能力和侵袭能力明显增强.结论:构建含HER2基因的重组载体,导入乳腺癌MCF-7细胞后,获得生物学活性稳定的HER2基因和ER基因高表达的细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

VEGF-C短发夹RNA抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭能力的实验研究

目的探讨应用靶向VEGF—C的短发夹RNA（shRNA）质粒载体在体外抑制乳腺癌细胞株MCF-7生物学活性的影响。方法制备携带有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的VEGF—C—shRNA质粒载体，脂质体转染方法转入乳腺癌细胞株MCF-7，通过倒置荧光显微镜及流式细胞术检测细胞的转染效率，RT—PCR及Western blot检测转染细胞内VEGF—CmRNA及蛋白的表达变化，MTT法检测细胞增殖抑制率，重组基底膜侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果高效转染入VEGF—C—shRNA的MCF-7细胞VEGF—C mRNA及蛋白表达水平显著下降；VEGF—C ShRNA对MCF-7细胞具有明显的增殖抑制作用，其抑增殖效应呈时间依赖性；VEGF—C—shRNA可抑制乳腺癌细胞MCF-7体外侵袭重组基底膜的能力，与阴性shRNA转染组、空载体组及空白组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；结论VEGF-C在乳腺癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用，通过RNA干扰技术实现VEGF—C沉默在乳腺癌的基因治疗中具有可行性。     

野生型PTEN基因在乳腺癌细胞中对表阿霉素的增敏作用

目的探讨野生型PTEN基因在人乳腺癌细胞系MCF-7和ZR-75-1中对表阿霉素的增敏作用。方法腺病毒介导野生型PTEN基因导入人乳腺癌细胞系MCF-7和ZR-75-1,RT-PCR检测PTEN mRNA的表达,Western blot检测转染后PTEN蛋白的表达;Ad-PTEN感染联合不同浓度的表阿霉素处理细胞,采用CCK-8法测定细胞增殖抑制率和联合效应。结果腺病毒介导的PTEN基因导入法可明显地增加细胞中PTEN基因的表达,野生型PTEN 基因转染联合表阿霉素使乳腺癌细胞MCF-7对表阿霉素的敏感度增加了两倍,而使乳腺癌细胞ZR-75-1对表阿霉素的敏感度增加了十倍。结论腺病毒重组的野生型PTEN基因联合表阿霉素对人乳腺癌细胞增殖具有显著的协同抑制效应。     

多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/Adr中体外转录的小分子干扰RNA(siRNA)对mdr1基因的干扰作用

目的 探讨多药耐药乳腺癌细胞MCF-7／Adr中体外转录的小分子干扰RNA（siRNA）对mdr1基因的干扰作用。方法将siRNA转染多药耐药乳腺癌细胞MCF-7／Adr后，采用共聚焦荧光显微镜、Northernblot和Westernblot分析siRNA在蛋白和mRNA水平对mdr1基因的静止作用；并用MTT法测定siRNA处理后阿霉素对MCF-7／Adr细胞的杀伤作用。结果 特异性siRNA能明显抑制P170蛋白表达及其mRNA，并能明显提高阿霉素对MCF-7／Adr细胞的杀伤作用。结论 siRNA能逆转细胞耐药性，可能将为肿瘤耐药的治疗提供又一新技术。     

利用siRNA阻抑survivin基因表达诱导乳腺癌细胞系MCF-7细胞凋亡的研究

背景与目的:survivin属IAP基因家族成员,表达于多种肿瘤组织中,能促使细胞逃避凋亡,并促进细胞的异常有丝分裂。本研究旨在探讨敲除survivin基因后,癌细胞的增殖和凋亡情况。方法:利用RNAi阻抑人乳腺癌细胞内survivin基因的表达,RT-PCR和Westernblot法分析survivin基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:survivinsiRNA转染组,survivin基因表达水平与未转染组比较下调了64%。随着siRNA浓度的增加,细胞增殖抑制率逐渐增高,200nmol/L剂量组细胞增殖抑制率最高,可达60.9%。不同浓度的siRNA可不同程度地诱导细胞凋亡,200nmol/L剂量组凋亡率最高,可达29.0%。结论:survivinsiRNA有可能成为治疗乳腺癌的新药物。