FADDdel-GFP真核表达载体的构建及其抗细胞毒效应初步观察

目的构建融合蛋白FADDdel-GFP真核表达载体pFADDdel-GFP，用该融合基因转染小鼠胰岛瘤细胞(NIT)，从而抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导，以探讨IDDM的发病机制及防治措施。方法采用基因重组技术将FADDdel定向连接于真核表达载体pEGFP-N1，用脂质体将重组子pFADDdel-GFP导入哺乳动物细胞NIT并检测其表达，采用FACS和MTT法检测特异性T细胞对转染重组子NIT引起的细胞毒效应。结果转染重组子pFADDdel-GFP的NIT可见绿色荧光蛋白表达；pFADDdel-GFP转染的NIT对特异性T细胞介导的细胞毒有明显抵抗。结论成功构建pFADDdel-GFP融合基因并获稳定表达；pFADDdel-GFP转染NIT可有效抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导。     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。 目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。 方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope 共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72 h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。 结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×10⁸ TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P < 0.05),MOI值为10的组能获得>70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。 目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。 方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。 结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72 h表达最强,感染率达80%,96 h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

表达载体pEGFP-C3-PENK的构建以及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建质粒pEGFP-C3-PENK,并观察其在真核细胞中表达的时效.方法:构建质粒pEGFP-C3-PENK;低浓度裸质粒、高浓度裸质粒、脂质体介导分别转染NIH3T3细胞,观察转染率、绿色荧光蛋白表达情况;放射免疫法和免疫细胞化学法检测脑啡肽的表达情况.结果:质粒pEGFP-C3-PENK成功构建;低浓度裸质粒转染率5%;高浓度裸质粒转染率8%,脂质体介导转染率为20%;转染5周后仍有绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建质粒pEGFP-C3-PENK,可在NIH3T3细胞中表达超过5周.     

AFP增强型四元复合体介导N-ras反义RNA抑制HepG2.2.15细胞成瘤性的研究

目的　观察AFP增强型四元复合体介导的N ras反义RNA转移系统对HBV转基因肝癌细胞系HepG2 .2 .15致瘤性的体内外抑制作用。方法　构建含有N ras反义RNA的AFP增强型四元复合体 ,体外瞬时转染HBV转基因HepG2 .2 .15细胞 ,流式细胞术检测转染前后N ras蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞周期的变化 ,同时建立稳定表达N ras反义RNA的肝癌细胞系HepG2 .2 .15 /as ras,绘制转染前后生长曲线。体内抑瘤试验分别以HepG2 .2 .15或HepG2 .2 .15 /as ras细胞制备荷瘤裸鼠模型 ,比较二者成瘤率。HepG2 .2 .15成瘤组局部瘤内注射N ras反义RNA四元复合体 ,研究其对肿瘤的抑制作用。结果　AFP增强型四元复合体介导N ras反义RNA体外瞬时转染HepG2 .2 .15细胞可显著降低胞内N ras蛋白的表达水平 (P <0 .0 5 ) ,使细胞生长停滞于G0 /G1期 ,且可诱导细胞凋亡。体内抑瘤实验显示 ,HepG2 .2 .15 /as ras细胞注射组成瘤率 ( 4 0 % )显著低于HepG2 .2 .15细胞注射组( 10 0 % )。瘤内注射N ras反义RNA四元复合体可使肿瘤体积明显缩小。结论　AFP增强型四元复合体介导的N ras反义RNA转移系统可降低HBV转基因肝癌细胞HepG2 .2 .15N ras蛋白的表达水平 ,逆转其恶性行为 ,体内外均可有效抑制肿瘤的生长增殖     

阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析

本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料。预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455~ 55bp)、pGL3-417(-417~ 55bp)、pGL3-280(-280~ 55bp)、pGL3-202(-202~ 55bp)、pGL3-81(-81~ 55bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL3-47(-47~ 55bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47~ 55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81~ 55bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47~ 55bp)和空载体pEGFP-1未见表达。因此-81~-47bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列。     

重组载体pEGFP-N1/TNFR 1在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

目的： 构建肿瘤坏死因子受体1（TNFR 1）绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1/TNFR 1,并在人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中表达。方法: 分离并培养HUVECs,将已成功构建的融合表达载体pEGFP-N1/TNFR 1,通过阳离子脂质体Lipofectin介导的方法转染到HUVECs中,RT-PCR检测TNFR 1 mRNA的表达,Western blotting检测融合蛋白的瞬时表达,同时在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察。结果: 成功分离HUVECs,重组pEGFP-N1/TNFR 1融合表达载体转染HUVECs后,在细胞中检测到TNFR 1基因片段,Western blotting可以检测到TNFR 1在HUVECs表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论: 重组pEGFP-N1/TNFR 1融合表达载体在HUVECs中获得了表达,融合蛋白具有TNFR 1和绿色荧光蛋白(GFP)的双重活性,为进一步研究TNFR 1转位的调控因素打下基础。     

基因枪介导不同真核质粒DNA转染体外细胞系的实验研究

目的:建立基因枪子的弹制备及将不同质粒DNA转染体外培养MCF-7细胞系的方法。方法:以亚精氨-氯化钙沉淀法制备子弹,采用基因枪方法分别将真核表达质粒pEG-FP,Pmcherry转染对照组和实验组MCF-7细胞,转染24h后,利用荧光显微镜观察细胞中红、绿荧光蛋白的表达情况。结果:制备了基因枪子弹,基因枪介导的pEGFP、Pmcherry能够分别和共同转染入体外培养的MCF-7细胞中,转染后24h可检测到红、绿色荧光,而对照组则没有荧光蛋白的表达。结论:基因枪能够有效介导外源基因转移并能够实现两种基因的共同转移,基因枪转染的MCF-7细胞能够有效表达报告基因。     

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建。以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD2基因启动子不同长度的4段序列,利用特定的限制性内切酶位点,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这4个序列片段进行酶切并插入表达载体pEGFP-N3中,用Vsp I和Pst I双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000介导转染HTK293T细胞,转染24 h后加入TNF-α持续刺激细胞24 h或不加TNF-α刺激,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因绿色荧光蛋白(green fluores-cent proteins,GFP)。结果:pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEG-FP-N3-NOD2(1 387 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的4段重组质粒pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)转染的HTK293T均能表达绿色荧光,其中构建pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)重组质粒经TNF-α持续刺后激绿色荧光表达最强。4段不同长度的人NOD2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体成功构建,这为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。     

融合蛋白FADDdel-GFP对死亡受体介导的胰岛细胞凋亡的影响

目的研究融合蛋白FADDdel-GFP对死亡受体介导的细胞凋亡信号的生物学效应,以探讨通过基因修饰靶细胞对1型糖尿病的影响。方法用脂质体将融合基因pFADDdel-GFP导入胰岛细胞株NIT,通过细胞RT-PCR和荧光显微镜检测其表达,采用FACS检测抗-Fas抗体诱导的胰岛细胞株的细胞毒效应。结果转染重组子pFADDdel-GFP的NITf-g细胞可见绿色荧光蛋白表达;NITf-g细胞对抗-Fas诱导的细胞损伤率为10.16%,细胞内的Caspase-3的活性为12.33%,均明显低于对照组（P〈0.05）。结论成功建立了稳定表达FADDdel-GFP的胰岛细胞株;FADDdel-GFP可有效抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导。     

特异性ASODN抑制Fas表达降低FasL介导细胞凋亡的研究

为了研究特异性Fas反义寡核苷酸(ASODN)对T细胞Fas表达及肝癌细胞诱导其凋亡的抑制作用,用脂质体介导法将Fas ASODN导入Jurkat T细胞,并通过用流式细胞术、RT-PCR及与肝癌细胞共培养方法研究Fas ASODN对T细胞Fas表达、Fas mRNA水平及凋亡的影响。结果显示:①Hep G2.2.15细胞表达有功能的FasL,可诱导Jurkat细胞凋亡;②Jurkat细胞转染Fas ASODN后,Fas mRNA降低;细胞表面Fas表达下降;与Hep G2.2.15细胞共培养后的凋亡率下降。表明Fas ASODN转染可以部分逆转肝癌细胞对T细胞的凋亡诱导作用。     

嘌呤霉素抗性基因捕获载体的构建及在细胞中的功能验证

目的 构建具有嘌呤霉素抗性基因捕获载体,扩大基因捕获载体的应用范围.方法 用经改造的捕获载体(gene trapping vector)稳定转染HepG2.2.15肝癌细胞系,经嘌呤霉素筛选,制作单克隆细胞株.用PCR方法验证该载体的在细胞染色体中的整合,ELISA方法证明捕获载体捕获基因后的细胞的功能改变.结果 嘌呤霉素抗性基因捕获载体整合在HepG2.2.15肝癌细胞的染色体上,并能影响细胞HBsAg和HBeAg的分泌.结论 新构建的嘌呤霉素抗性基因捕获载体能在具有G418抗性的细胞中捕获有意义的目的 基因.     

AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位

构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem104-pEGFP-N1，利用脂质体转染体外培养的COS-1细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem104-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位，用RT-PCR和Western blot方法验证其mRNA和蛋白的表达。结果表明在空载体pEGFP-N1转染组中，COS-1细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒AngRem104-pEGFP-N1转染组中，绿色荧光集中在细胞核中，随着表达量的增高，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状，颗粒状，RT-PCR的结果表明AngRem104在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组。Western blot的结果也确证了AngRem104-EGFP融合蛋白的表达。提示新基因AngRem104/pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS-1中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有An-gRem104和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位，为基因功能研究提供了线索。     

脂质体介导哺乳动物细胞转染的改良方法

目的：提高脂质体介导的细胞转染效率.方法：在传统的脂质体生化转染过程中,介入了简单的物理转染技术,并应用有限稀释克隆技术和共聚焦荧光显微镜检测技术,对转染细胞进行了早期克隆筛选,用流式细胞术对转染细胞表达GFP的阳性率进行检测.结果：流式细胞术检测显示,通过改良法获得转染pcDNA3-GFP-PSA质粒的B16、RM1和EL4细胞,表达报告蛋白GFP的阳性百分率（26%、24%和40%）高于传统法转染的细胞（16%、16%和18%）.改良法转染的B16、RM1和EL4经过克隆筛选、液氮冻存、水浴复苏和体外连续培养2周后,外源基因报告蛋白GFP表达的阳性百分率分别为77%、69%和83%.在转染流程上,通过改良法获得单克隆转染细胞株的时间明显缩短.结论：改良的脂质体转染方法结合细胞克隆技术,能在最短时间内获得高表达外源基因的转染细胞株.     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

HBV X siRNA与5-氮-2'-脱氧胞苷对裸鼠肝癌皮下移植瘤作用的研究

目的 目的 探讨靶向HBV X的siRNA(X-siRNA)和5-氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-dC)对HBV相关肝细胞癌生长的影响及可能机制.方法 设计合成X-siRNA及对照siRNA,用siRNA处理HepG2/GFP-HBx细胞,RT-PCR法测定处理细胞的HBV X基因表达;将HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞接种于裸鼠皮下建立裸鼠肝癌皮下移植瘤,分别用X-siRNA、5-aza-dC单独或联合处理裸鼠并观察移植瘤生长;甲基化PCR测定移植瘤组织p16基因甲基化.结果 RT-PCR检测示X-siRNA处理的细胞HBV X mRNA水平明显降低;裸鼠体内实验显示HepG2/GFP-HBx组的皮下移植瘤体积明显大于HepG2/GFP组(P＜0.05);X-siRNA与5-aza-dC处理组移植瘤体积明显小于未处理组(P＜0.05);甲基化PCR检测示HepG2/GFP-HBx组移植瘤组织存在p16甲基化而HepG2/GFP组未检出p16甲基化;X-siRNA、5-aza-dC处理的移植瘤组织中p16基因甲基化减低.结论 X-siRNA及甲基化抑制剂可能通过逆转p16甲基化而能有效抑制肝细胞癌生长,具有潜在应用价值.     

携带甲胎蛋白基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对靶基因的沉默效率

目的构建携带甲胎蛋白（AFP）基因小干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体并转染肝癌细胞,评价其对AFP基因的沉默效率。方法设计和构建针对AFP基因的阳性siRNA及不针对任何已知基因的阴性siRNA,将其分别插入携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒载体,然后转染到表达AFP基因的人肝癌细胞HepG2并筛选阳性表达细胞株,分别为慢病毒转染阳性siRNA组和慢病毒转染阴性siRNA组。同时设立脂质体转染阳性siRNA组、脂质体转染阴性siRNA组以及加AFPsiRNA而未用转染试剂的siRNA组、空白对照组。荧光显微镜观察评估转染效率,荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组HepG2细胞APFmRNA及蛋白的相对表达量,比较不同转染方法对AFP基因表达的抑制率。结果慢病毒能够有效地转染siRNA到HepG2细胞内。荧光定量PCR显示慢病毒转染siRNA对AFPmRNA表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（92．1％比74．3％,P〈0．05）。免疫印迹亦显示慢病毒转染siRNA对AFP蛋白表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（88．2％比63．7％,P〈0．05）。结论慢病毒转染AFPsiRNA能够更有效地抑制HepG2细胞内AFP基因表达。     

壳聚糖脂质体复合载体的核酸递送

目的构建一种由脂质体Lipofectamine2000、低分子质量壳聚糖、pDNA组成的三元新型复合载体用于核酸递送能力研究。方法复合物形态采用原子力显微镜轻敲模式下表征、载体与核酸结合能力采用凝胶延滞法表征,Hep-2细胞报告基因表达利用倒置荧光显微镜检测。细胞毒性研究采用3-甲基-2-噻唑硫酮(MTT)法。结果复合载体与pDNA结合能力强,可完全延滞pDNA。脂质体/壳聚糖/pDNA复合载体形态呈现出未完全压缩的球形,短棒状和不规则的聚集块。新型载体转染Hep-2细胞提高了绿色荧光蛋白报告基因的表达效率。与脂质体对照载体比较,基因转染效率提高了2～4倍,对照壳聚糖载体无明显转染效果。细胞毒性表明壳聚糖降低了脂质体的细胞毒性。结论基于脂质体的壳聚糖新型复合载体具有核酸递送潜力。     

乙型肝炎病毒在体内外抑制补体C3和C4表达的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对补体C3和C4表达的影响,并探讨其调节机制.方法 采用基因芯片筛选HepG2和HepG2.2.15细胞的差异表达基因,免疫比浊法检测HBV患者和健康对照者补体C3和C4血清学水平,将HBV感染性克隆pHBV1.3转染HepG2细胞,RT-PCR和Western blot法检测C3和C4表达水平的变化.结果 补体C3和C4 mRNA在HepG2.2.15细胞中水平降低;C3和C4在慢性乙型肝炎患者和肝癌患者的血清学水平明显低于健康对照者(P＜0.05);HBV能够在mRNA和蛋白水平下调C3和C4的表达.结论 HBV能够在体内外抑制补体C3和C4的表达.