乌龙丹对大鼠局灶性脑缺血神经元凋亡及其相关基因表达的影响

目的:观察乌龙丹对大鼠局灶性脑缺血神经元损害病理过程的保护作用,并分析其作用途径。方法:实验于2004-09/2005-10在南方医科大学中医药学院实验室完成。①选用Wistar大鼠30只,3～4月龄,体质量(250±20)g。按随机抽签法将大鼠分为5组(每组6只):假手术组:只做开颅术,不结扎血管;模型组和乌龙丹低、中、高剂量组:造成局灶性脑缺血模型。乌龙丹低、中、高剂量组:造模前灌胃乌龙丹流浸膏眼乌龙丹由生黄芪、葛根、制首乌、川芎、丹参、地龙、全蝎、制僵蚕、水蛭、生晒参、石菖蒲、女贞子、白术、当归组成,由南方医科大学南方医院中药房提供,加工为流浸膏穴含生药2.5g/mL雪演1,2,4mL,给药7d;假手术组:术前灌胃2mL生理盐水,干预7d;模型组:造模前灌胃2mL生理盐水,干预7d。②于末次给药后2h造模:结扎右侧颈总动脉,夹闭左侧颈总动脉1h后放开;阻断大脑中动脉造成局灶性脑缺血模型。③大鼠造模24h后,剥取脑组织,冠状连续切片。在JEM1200-EX透射电镜下观察脑组织的超微结构。采用原位末端标记法,按试剂盒说明书方法操作,应用图形分析仪系统,计算原位末端标记法染色阳性细胞数(细胞凋亡数)。采用免疫组化法,按试剂盒说明书方法操作检测Bcl-2与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达情况。④组间计量资料差异比较采用单因素方差分析,结果:Wistar大鼠30只均进入结果分析。①假手术组:神经细胞形态正常。模型组:神经细胞有明显病理改变,神经元肿胀或浓缩,有凋亡细胞表现。乌龙丹3个剂量组:多数细神经细胞胞保存完好,神经细胞基本形态结构完整,与假手术组相似。②模型组脑组织原位末端标记法染色阳性细胞、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3免疫反应阳性细胞数明显多于其他4组穴P<0.05雪,Bcl-2免疫反应阳性细胞数明显少于其他4组穴P<0.05雪。乌龙丹低、中、高剂量组神经细胞凋亡情况与相关基因表达与假手术组相近。结论:乌龙丹具有减轻局灶性脑缺血神经细胞结构的病理损伤,对抗细胞凋亡的神经保护作用,该作用发挥可能与乌龙丹影响脑缺血后Bcl-2,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3基因表达有关。     

黄芪对脑缺血-再灌注后神经细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

目的:探讨黄芪对脑缺血-再灌注后神经细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Fas-L蛋白表达的影响.方法:采用Longa报道的线栓法制备大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型.将36只SD大鼠随机分为假手术组(生理盐水10 ml·kg-1·d-1灌胃)、模型组(生理盐水10 ml·kg-1·d-1灌胃)和黄芪干预组(黄芪煎剂6 g·kg-1·d-1灌胃),每组12只.采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记技术(TUNEL)检测各组大鼠脑组织神经细胞凋亡,免疫组化与医学图像分析结合的方法检测Bcl-2、Fas-L蛋白的表达.结果:与假手术组相比,模型组大鼠缺血侧脑组织TUNEL阳性神经细胞及Bcl-2、FasL阳性细胞表达增多(P均<0.01).与模型组相比,黄芪干预组大鼠缺血侧脑组织TUNEL阳性神经细胞及Fas-L阳性细胞表达减少,Bcl-2阳性细胞表达增多(P<0.01).结论:黄芪可增强Bcl-2蛋白表达,下调Fas-L蛋白表达,从而抑制脑缺血-再灌注后神经细胞凋亡,这可能是黄芪对脑缺血-再灌注损伤的神经保护作用机制之一.     

局灶性脑梗死大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的表达：空间分布特征及时间演变规律

目的：观察大鼠局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9表达的时间和空间分布的动态演变。方法：实验于2004-03／06在山东省泰山医学院微循环重点实验室完成。选择Wistar大鼠84只，随机分为正常组6只、假手术组6只、局灶性脑梗死组72只，局灶性脑梗死组根据光照后时间分为30min，3，6，9，12，24，36，48h，3，4，5，6d共12组，每组6只。采用光化学方法制作大鼠局灶性脑梗死模型。动物处死前1h注射10g／L伊文思兰1mL。正常组不作任何处理，假手术组仅暴露完整的颅骨，按要求时间点麻醉处死大鼠取脑组织，观测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的表达采用免疫组织化学分析。结果：参加实验的84只大鼠全部进入结果分析。①脑梗死后30min即有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9阳性细胞出现，呈半球状向四周放射样扩展，随脑梗死时间的延长逐渐增多，二者均在48h表达至高峰，但前者表达更显著(P&;lt;0．05)，阳性细胞局限于脑梗死区周围。②正常对照组、假手术组均未发现半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的阳性表达。结论：①局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9表达部位一致，以坏死区为中心呈放射状空间分布特征。②二者均在30min开始表达，48h时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3较半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9表达增多，这种时间变化规律说明细胞凋亡的级联反应最终通路有放大作用。     

黄芪注射液腹腔注射脑缺血再灌注模型大鼠海马组织神经元凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达

背景:有研究表明黄芪注射液可抑制脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡。目的:观察黄芪注射液腹腔注射脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。方法:采用四血管阻断法制备全脑缺血再灌注大鼠模型,建模后给予质量浓度2,4,6,8和10mL/kg的黄芪注射液腹腔注射,并设立假手术组。分别采用原位末端标记法染色和蛋白免疫印迹方法检测各组大鼠海马神经元凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达。结果与结论:模型组大鼠海马神经元凋亡指数及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达明显增多(P<0.05);与模型组相比,黄芪注射液4,6,8,10mL/kg组海马神经元凋亡指数及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达明显减少(P<0.05);与黄芪注射液4mL/kg组比,黄芪注射液6,8,10mL/kg组神经元凋亡指数及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达减少(P<0.05),且呈剂量依赖性。结果证实,黄芪注射液可抑制脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达。     

大鼠中等程度创伤性脑损伤后神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与活性的时效关系

目的：观察大鼠中等程度创伤性颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡执行因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的时间动态演变，并探讨三者之间的时效关系。方法：实验于2004-04／10在解放军第三军医大学创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室完成。选择健康SD大鼠48只，随机分为假致伤组8只和损伤组40只，损伤组根据处死时间分为2，12，24，48，72h共5个时相点，每个时相点8只大鼠。损伤组制备中等程度创伤性脑损伤模型，假致伤组仅作颅骨钻孔而不致伤，术后24h处死。观察中度脑损伤后2h-3d伤侧大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况采用原位末端标记技术；观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的变化采用免疫组织化学及免疫荧光技术。结果：48只大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠中度脑损伤后不同时间点大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况：创伤性脑损伤后2h在伤侧皮质和海马区即可见有少量凋亡细胞，并呈逐渐增多趋势，主要分布在伤侧皮质、皮质下白质、海马等区域，12-24h凋亡细胞增多，48-72h达到凋亡高峰，明显高于假致伤组。②各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达：脑损伤后2h在损伤灶及其周围皮质即有少量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞，脑损伤后24-48h阳性细胞数量明显增加。脑挫伤后72h半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数有所下降。假致伤组脑组织偶见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞。③各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化：脑损伤后损伤灶及附近皮质神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高，伤后48h达高峰，损伤侧海马区域神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高，24h达高峰，而后开始下降。结论：大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围皮质和损伤侧海马神经细胞凋亡数量的变化与伤后时程有关。伤后细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性增加可能是导致细胞凋亡的因素。     

益气活血方对脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡及相关基因表达的影响

目的:探讨益气活血方对脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2和FasL蛋白表达的影响.方法:采用Longa报道的线栓法制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型.将36只SD大鼠按随机数字表法均分为假手术组、模型组和益气活血方组.采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠脑组织凋亡神经元细胞;用免疫组化法与医学图像分析相结合的方法检测各组大鼠脑组织Bcl-2和Fas-L的蛋白表达.结果:①与假手术组相比,模型组大鼠缺血侧脑组织TUNEL阳性细胞及Bcl-2、Fas-L蛋白阳性细胞数目均增多(P均＜0.01);②与模型组相比,益气活血方组大鼠缺血侧脑组织TUNEL阳性细胞及Fas-L蛋白阳性细胞数目减少,Bcl-2蛋白阳性细胞数目增多(P均＜0.01).结论:益气活血方药(芪丹通脉片)可增强Bcl-2蛋白的表达,同时下调FasL蛋白的表达,从而抑制脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡,这可能是益气活血方对脑缺血/再灌注损伤起神经保护作用的机制之一.     

大鼠局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的表达及白花丹参叶的干预效应

目的：观察大鼠局灶性脑梗死后促进细胞凋亡的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9表达的变化规律及白花丹参叶的保护作用方法：实验于2004—03／06在山东省泰山医学院微循环重点实验室完成。取50只Wistar大鼠，随机分为局灶性脑梗死组和白花丹参叶预处理组两组符25只，每组义按光照后时间分为30min．12，24，48，72h等5个亚组，每亚组5只。造模前，白花丹参叶预处理组大鼠给予20g／kg白花丹参叶水提物灌服，1次／d，连续7d，然后两组同时采用光化学法制作大鼠局灶性脑梗死的模型。利用免疫组化染色技术观察局灶性脑梗死后不同时间点大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9表达的变化，并观察大鼠一般情况。结果：50只大鼠全部进入结果分析。①局灶性脑梗死组大鼠梗死后30min即有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，9阳性细胞出现，呈半球状向四周放射样扩展，随梗死时间的延长逐渐增多，二者行均在48h表达至高峰，但半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达更显著（P〈0．05），阳性细胞局限于梗死区周围。②预防性应用白花丹叶水提物后，大鼠出现明显的嗜睡现象，受损皮质表面积红染区、蓝染区明显减小，各时点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的阳性反应均明显减少，较单钝梗死组有显性差异（P〈0．05）。结论：局灶性脑梗死后可诱导仁胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,9的表达，白花丹参对脑梗死具有保护作用，其分子机制可能为抑制了半胱氨酸天冬氧酸蛋白酶3,9的表达。     

银杏平颤方对帕金森病鼠黑质半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和Bcl-2蛋白表达的影响

目的：观察银杏平颤全方及其拆方对帕金森病鼠黑质半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，9及B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白在不同时期表达的影响。方法：实验于2002-09／2003-12在北京中医药大学解剖教研室神经解剖实验室进行。动物随机分成6组：正常组、模型组、全方组、解毒组、平肝组和化瘀组，除正常组6只外，其余每组又分造模后14，28d两个时间点，每个时间点6只。除正常组外，其余5组动物腹腔注射1-甲基-4苯基-1，2，3，6四氢吡啶[30mg／(kg&;#183;d)，连续5d]建立帕金森病动物模型，从造模第1天开始每天分别灌胃中药0．5mL(全方含生药1．18g／L．拆方含生药0．6g／L)，模型组灌胃生理盐水0．5mL。动物存活到相应时间点处死，采用免疫组化技术观察黑质半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3.9和Bcl-2的表达。结果：66只动物全部进入结果分析。①帕金森病模型组鼠中脑黑质半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9．3的表达明显增加，14d较28d更强，而黑质内Bcl-2蛋白的表达下降，28d较14d更明显。②中药银杏平颤方及其拆方可不同程度地抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，9的表达，提高Bcl-2的表达。通过全方和3组拆方比较发现化瘀中药的作用基本同全方组，两个时间是均有效。③解毒中药在14d作用比28d显著，平肝中药在28d的作用一般大于14d。结论：银杏平颤方可能通过上调抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达，和下调促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，9的表达，从而抑制了帕金森病大鼠中脑多巴胺神经元的凋亡。     

局灶性脑梗死大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的表达空间分布特征及时间演变规律

目的观察大鼠局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9表达的时间和空间分布的动态演变.方法实验于2004-03/06在山东省泰山医学院微循环重点实验室完成.选择Wistar大鼠84只,随机分为正常组6只、假手术组6只、局灶性脑梗死组72只,局灶性脑梗死组根据光照后时间分为30 min,3,6,9,12,24,36,48 h,3,4,5,6 d共12组,每组6只.采用光化学方法制作大鼠局灶性脑梗死模型.动物处死前1 h注射10 g/L伊文思兰1 mL.正常组不作任何处理,假手术组仅暴露完整的颅骨,按要求时间点麻醉处死大鼠取脑组织,观测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的表达采用免疫组织化学分析.结果参加实验的84只大鼠全部进入结果分析.①脑梗死后30 min即有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9阳性细胞出现,呈半球状向四周放射样扩展,随脑梗死时间的延长逐渐增多,二者均在48 h表达至高峰,但前者表达更显著(P＜0.05),阳性细胞局限于脑梗死区周围.②正常对照组、假手术组均未发现半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的阳性表达.结论①局灶性脑梗死后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9表达部位一致,以坏死区为中心呈放射状空间分布特征.②二者均在30 min开始表达,48 h时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3较半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9表达增多,这种时间变化规律说明细胞凋亡的级联反应最终通路有放大作用.     

大鼠中等程度创伤性脑损伤后神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与活性的时效关系

目的:观察大鼠中等程度创伤性颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡执行因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的时间动态演变,并探讨三者之间的时效关系。方法:实验于2004-04/10在解放军第三军医大学创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室完成。选择健康SD大鼠48只,随机分为假致伤组8只和损伤组40只,损伤组根据处死时间分为2,12,24,48,72h共5个时相点,每个时相点8只大鼠。损伤组制备中等程度创伤性脑损伤模型,假致伤组仅作颅骨钻孔而不致伤,术后24h处死。观察中度脑损伤后2h～3d伤侧大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况采用原位末端标记技术;观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的变化采用免疫组织化学及免疫荧光技术。结果:48只大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠中度脑损伤后不同时间点大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况:创伤性脑损伤后2h在伤侧皮质和海马区即可见有少量凋亡细胞,并呈逐渐增多趋势,主要分布在伤侧皮质、皮质下白质、海马等区域,12～24h凋亡细胞增多,48～72h达到凋亡高峰,明显高于假致伤组。②各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达:脑损伤后2h在损伤灶及其周围皮质即有少量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞,脑损伤后24～48h阳性细胞数量明显增加。脑挫伤后72h半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数有所下降。假致伤组脑组织偶见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞。③各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化:脑损伤后损伤灶及附近皮质神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高,伤后48h达高峰,损伤侧海马区域神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高,24h达高峰,而后开始下降。结论:大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围皮质和损伤侧海马神经细胞凋亡数量的变化与伤后时程有关。伤后细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性增加可能是导致细胞凋亡的因素。