赫坎按蚊种群近缘种核糖体基因内转录第二间隔区序列分析

目的　分析赫坎按蚊种群内4个近缘种核糖体基因内转录第二间隔区(rDNAITS2)特征。　方法　采用特异性ITS2引物对中华按蚊和嗜人按蚊江苏实验株、辽宁省沈阳市和朝鲜开城现场捕获的嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2进行PCR扩增、基因测序和限制性内切酶酶切位点图谱分析。　结果与结论　赫坎按蚊种群近缘种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2分别为472、452、456和456bp,各基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶酶切位点     

PCRRFLP单酶切法鉴别赫坎按蚊复合体的研究

目的建立一种新的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别技术,应用于现场按蚊样本的鉴别。方法用分子生物学软件Vector NTI 9.0,对赫坎按蚊复合体的嗜人按蚊、雷氏按蚊、中华按蚊、八代按蚊4个近缘种按蚊rDNA基因的ITS2区段序列进行限制性内切酶酶切位点预测分析,选择特异性内切酶,建立一种能同时鉴别4种近缘种按蚊的聚合酶链反应限制性片段长度多态(PCR RFLP)单酶切法鉴别技术,并对现场捕获的452只按蚊样本进行基因鉴别。结果软件预测赫坎按蚊复合体近缘种4种按蚊的rDNA基因的ITS2区段可被限制性内切酶Dde I切成大小易于区分的不同片段,PCR RFLP单酶切实验结果和软件预测结果完全吻合。4个疟疾流行区捕获的452只按蚊样本经PCR RFLP Dde I单酶切法鉴定有20只嗜人按蚊、6只雷氏按蚊、391只中华按蚊、35只八代按蚊,与形态学鉴别结果符合率为93.4%,与PCR RFLP双酶切法结果符合率为100%。结论新建立的PCR RFLP Dde I单酶切法基因鉴别技术可准确鉴别赫坎按蚊复合体,比传统的形态学鉴别更为简便、可靠,适合用于复合媒介地区的媒介监测。     

用PCR-RFLP技术鉴别嗜人按蚊和中华按蚊的研究

目的　依据嗜人按蚊和中华按蚊rDNA的ITS2区段基因特征 ,建立一种新的嗜人按蚊和中华按蚊基因鉴别技术。方法　对不同地区的嗜人按蚊、可疑嗜人按蚊和中华按蚊样本通过采用特异性ITS2 引物PCR扩增 ,限制性内切酶RsaI和HinfI消化 ,以及琼脂糖凝胶电泳分析进行PCR -RFLP基因鉴别。 结果　不同地区嗜人按蚊rDNA的ITS2 基因PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfI酶切 ,并显示一条 4 5 0bp的酶切DNA条带 ;中华按蚊的ITS2 基因PCR扩增产物则能被限制性内切酶RsaI酶切 ,并显示 4 0 0bp和 2 0 0bp两条酶切DNA条带 ;辽宁可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与嗜人按蚊相同而广东珠海可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与中华按蚊相同。结论　依据rDNA的ITS2 区段基因特征建立的PCR -RFLP技术可用于嗜人按蚊和中华按蚊的基因鉴别。采用该PCR -RFLP基因鉴别技术发现辽宁可疑嗜人按蚊的基因与中国大陆的嗜人按蚊属同种 ,而广东可疑嗜人按蚊的基因与中华按蚊属同种。     

一种简便的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别新技术

目的 建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内不同近缘种按蚊的基因鉴别技术。方法 依据赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊ITS2区段的基因序列特征设计特异性引物，建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊的简便的PCR基因鉴别技术，并采用传统的形态学分类方法和新建立的基因鉴别技术对从辽宁、河南省以及在朝鲜现场捕获的按蚊分别进行了形态学和基因鉴别及比较。结果与结论 新建立的基因鉴别技术能准确鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊。具有比传统的形态学分类方法准确，比已有的PCR-RFLP蚊种基因鉴别技术更简便、价廉和省时的特点。适用于不同的复合媒介地区的疟疾媒介调查和监测。     

嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段序列分析和比较

目的 分析和比较不同地区中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2区段的基因特征。方法 采用特异性ITS2引物对嗜人按蚊和中华按蚊江苏实验株以及从湖北省和越南现场捕获的嗜人按蚊和中华按蚊进行PCR扩增、克隆并对ITS2区段序列进行分析。结果 嗜人按蚊实验株的ITS2区段序列有452bp，与嗜人按蚊现场株的ITS2区段序列相同，中华按蚊实验株的ITS2区段序列有472bp，与中华按蚊现场株的ITS2区段序列也相同；但嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶位点。结论 可依据中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2基因序列内限制性内切酶切位点不同的基因特征，采用PCR-RFLP技术建立中华按蚊和嗜人按蚊基因鉴别技术。     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法，对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测，并对已检测的标本随机抽取数个样本，进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中，中华按蚊占90．85％(586／645)、雷氏按蚊占5．27％(34／645)，无扩增条带的标本占3．88％(25／645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451bp，经Blast比对分析，显示与已公布的序列完全相同；3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊，其它成员种有待进一步证实。     

PCR—RFLP鉴别微小按蚊亲缘种A和C

目的 建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法-PCR产物酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)。方法 用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA，PCR特异扩增核糖体28S第3结构域(D3)基因，对PCR产物进行纯化、克隆和测序；分析微小按蚊A和CD3基因的酶切图谱，选择合适的限制性内切酶对两者PCR产物进行特异性切割，按照酶切片段长度区分两亲缘种。结果 微小按蚊A被限制性内切酶MboⅡ切割后在约376bp、268bp和108bp处出现3条条带，而微小按蚊C因第96bp、97bp位点突变，不存在限制性内切酶MboⅡ的特异识别位点而未被消化，仅在376bp处存在唯一条带。结论 本实验建立的PCR-RFLP分子鉴别方法能有效地将形态难以鉴别的微小按蚊亲缘种A和C(GenBank：AF416782，AF41：5594)区分开来。     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法,对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测,并对已检测的标本随机抽取数个样本,进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中,中华按蚊占90.85％(586/645)、雷氏按蚊占5.27％(34/645),无扩增条带的标本占3.88％(25/645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451hp,经Blast比对分析,显示与已公布的序列完全相同;3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊,其它成员种有待进一步证实。     

我国赫坎按蚊种团的分子鉴别及中华按蚊的区系分布研究

目的改进赫坎按蚊种团部分成员种的多重PCR鉴别方法,鉴别赫坎按蚊种团中的中华按蚊,研究我国中华按蚊的区系分布及其影响因素。方法依据赫坎按蚊种团成员种中华按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊、比伦按蚊和克莱按蚊的核糖体DNA内转录间隔区2 (rDNA-ITS2)序列差异设计种特异引物,改进多重PCR分子鉴别方法。2013-2018年,在我国8个省(直辖市、自治区)共18个地点,以诱虫灯和人工吸取相结合的方法采集按蚊,依据形态特征初步鉴定为赫坎按蚊种团的成员种。提取单只蚊虫基因组DNA,使用改进的多重PCR方法鉴定种类。对多重PCR法无扩增产物的个体分析rDNA-ITS2序列,在GenBank上进行BLAST比对,确定其种类。查找我国以及韩国和俄罗斯远东地区用分子特征鉴别为中华按蚊的文献,结合本研究结果,汇总中华按蚊采集地的地理位置和气候数据,使用地理探测器模型计算影响决定力q值,分析经度、纬度、年平均气温和年平均降雨量对中华按蚊分布的影响。结果改进的多重PCR法一次扩增即可依据扩增片段大小鉴别赫坎按蚊种团的5个成员种:中华按蚊(490 bp)、雷氏按蚊(313 bp)、八代按蚊(216 bp)、克莱按蚊(386 bp)和比伦按蚊(165 bp)。在我国18个采集点共捕获赫坎按蚊种团按蚊365只,多重PCR鉴别为中华按蚊114只(来自陕西、安徽与山东的采集点)、八代按蚊34只、雷氏按蚊9只、克莱按蚊181只和比伦按蚊5只。22只多重PCR无扩增产物的蚊虫中,经rDNA-ITS2序列分析鉴定为贵阳按蚊2只、类中华按蚊1只、朝鲜按蚊8只、林氏按蚊7只和帕氏按蚊4只。获取用分子特征鉴别为中华按蚊的文献17篇,共汇总了101个采集地信息,其中有中华按蚊分布的采集点80个,无中华按蚊分布的21个地点。地理探测器软件计算获得的q值,从大到小依次为0.592 0(年平均气温)、0.507 2 (纬度)、0.351 2 (经度)和0.214 4 (年平均降雨量)。中华按蚊的分布与年平均气温关系最为密切,其次是纬度。综合分析分布地的纬度和年平均温度等结果显示,年平均气温10℃可以作为划分中华按蚊在我国分布北界线的依据。我国中华按蚊的分布范围包括云南、贵州、重庆、河南、山东、天津、江苏、安徽、湖北、浙江、上海、福建、江西、广西、广东、海南等省(直辖市、自治区)及台湾、香港、澳门特别行政区的全境,以及西藏、四川、甘肃、陕西、山西、河北、北京、辽宁等省(直辖市、自治区)的南部部分地区。结论改进的赫坎按蚊种团多重PCR分子鉴定方法快速简单、客观可靠。综合分析显示划分中华按蚊在我国分布北界线的依据是年平均气温10℃线,中华按蚊在我国的分布应小于之前记载的范围。     

PCR-RFLP鉴别微小按蚊亲缘种A和C

目的　建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法—PCR产物酶切片段长度多态性分析 (PCR RFLP)。　方法　用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA ,PCR特异扩增核糖体 2 8S第 3结构域 (D3 )基因 ,对PCR产物进行纯化、克隆和测序 ;分析微小按蚊A和CD3基因的酶切图谱 ,选择合适的限制性内切酶对两者PCR产物进行特异性切割 ,按照酶切片段长度区分两亲缘种。　结果　微小按蚊A被限制性内切酶MboII切割后在约 3 76bp、2 68bp和 10 8bp处出现 3条条带 ,而微小按蚊C因第 96bp、97bp位点突变 ,不存在限制性内切酶MboII的特异识别位点而未被消化 ,仅在 3 76bp处存在唯一条带。　 结论　本实验建立的PCR RFLP分子鉴别方法能有效地将形态难以鉴别的微小按蚊亲缘种A和C(GenBank :AF416782 ,AF415 5 94)区分开来。