噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库的构建

目的构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选及结构和功能的研究打下基础。方法应用overlapping PCR制备Protein A的Z结构域。用含随机核苷酸序列的引物,制备对Z结构域的第10、13、27、28、31和32位氨基酸进行随机突变的定点随机突变体库。并在突变体片段两端引入KpnⅠ位点,3′端引入3个氨基酸大小随机连接肽的序列。经KpnⅠ酶切后随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S。克隆产物转化大肠杆菌TG1,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示定点随机突变组合文库。结果该定点随机突变组合文库的转化子数目为6.4×106个,滴度为1.4×1015TU/L;文库中含0.72以上的阳性克隆,其中有2个单结构域的阳性克隆占0.15;15个样品的序列分析显示各突变位点和随机连接肽的氨基酸序列呈随机性分布。结论成功构建了噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,该库库容量在一级结构上具有良好的随机性和多样性,可满足体外分子进化研究的要求。     

人和羊IgG对噬菌体展示细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的体外进化筛选

目的 使用人和羊不同物种IgG来诱导噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同的Fc段构像是否具有特异的结合优势,同时探索其优势结合序列的组合特点.方法 通过PCR获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的A、B、D、E和链球菌(C和G群)蛋白G (SpG)的B2、B3各单结构域片段,构建...     

噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库的构建

目的构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,研究IgA结合分子结构与功能的关系。方法基因合成IgA亲和体ZA1、ZA2片段。片段两端引入Kpn I酶切位点,3′端引入随机连接肽序列,Kpn I酶切,随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S的Kpn I克隆位点上,转化大肠杆菌TGI,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示随机组合文库。结果基因合成IgA亲和体;构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,容量为3·4×107,滴度为1·6×1012TU/L;文库中含79%以上的阳性克隆;序列分析显示组合文库由ZA1、ZA2随机组合而成,连接方式符合随机连接的特点,各亲和体之间连接肽序列也呈随机分布。结论合成IgA亲和体,构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,该文库库容量、多样性和随机性可满足体外分子进化研究的要求。     

噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的构建

目的:观察和评价转染血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的自体骨髓基质细胞移植于猪的慢性缺血模型后对心功能的保护和促血管新生作用.方法:置Ameriod环建立慢性心肌缺血猪模型,随机分为4组:转染VEGF基因的自体骨髓基质细胞组(组Ⅰ,n=9),单纯细胞移植组(组Ⅱ,n=8),单纯基因治疗组(组Ⅲ,n=7),以注射空腺病毒载体的实验动物为对照组(组Ⅳ,n=8).体外培养自体骨髓基质细胞,Ad.VEGF转染细胞,以CM-DiI为标记,移植于该模型猪心脏的缺血区域.观察和分析各实验组Rentrop分数、心脏射血分数(EF)、梗死区的面积百分比、移植细胞成活性、血管密度及VEGF的表达和分泌.结果:模型建成后,所有动物的冠脉造影左旋支(LCx)完全闭塞或闭塞程度大于95%,说明模型构建成功.与其他各组比较,组Ⅰ的Rentrop分数的升高值及心脏射血分数的升高值均有显著性提高(P＜0.01),梗死区面积明显减少(P＜0.01),具有维持心脏正常功能的几何构型及室壁厚度,且荧光显微镜下可见大量CM-DiI标记的移植成活细胞.组Ⅰ、组Ⅲ缺血区血管计数和VEGF在心肌中的蛋白表达高于组Ⅱ、组Ⅳ,组Ⅰ和组Ⅲ组间并无明显差异.结论:携带VEGF基因的自体骨髓基质细胞移植治疗缺血性心脏病具有明显的优越性,移植细胞成活率高,局部血液循环和心功能改善明显.     

SPA单结构域突变体组合噬菌体文库的构建及体外进化筛选

目的 使用人免疫球蛋白G( IgG)对金黄色葡萄球菌蛋白A( SPA)单结构域突变体组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同突变体组合的特异结合优势,探索优势组合分子结构与功能间的关系. 方法 通过 Overlap PCR获得SPA中A和C单结构域突变体片段组合构成的噬菌体文库,再使用人IgG对文库进行体外亲和筛选,期望通过对特定结合分子的定向改造及体外进化获得具有高结合优势的组合分子. 结果 成功构建符合体外筛选要求的SPA单结构域A在29、30位氨基酸定点突变文库( A1 )、SPA单结构域C在36、37位定点突变文库( C1 )和SPA单结构域A在37位后插入3个氨基酸随机肽( AI37 )、SPA单结构域C在20位后插入3个随机连接肽( CI20 ) ,将A1、C1随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库A1C1,将AI37、CI20随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库AI37 CI20. 两个文库各自经过4、5轮亲和筛选,文库进化完全.Phage-ELISA高光密度值的单克隆,测序结果分析为A(Q29K30) A(I29I30)和AI-TQS A. 结论 通过定向改造技术获得了高结合能力的定点突变分子A(Q29K30) A(I29I30)和插入突变分子AI37-TQS A,为Ig结合分子的定向改造及具有新的Ig结合特性的重组Ig结合分子的进一步研究奠定了基础.     

从噬菌体展示随机肽库中筛选豌豆凝集素的结合肽

目的:从噬菌体展示随机肽库中筛选能与豌豆凝集素(PSA)特异结合的短肽.方法:①用豌豆凝集素(PSA)作为靶蛋白,对噬菌体展示的随机六肽库进行亲和筛选;②α-甲基-D-甘露糖苷对筛选出的噬菌体和PSA结合的影响实验(点印迹法); ③选择性地合成了3条6肽ARMWSF、RYDYSY、LRLRQL,用不同浓度的6肽对PSA、ConA与HRP的结合进行竞争抑制实验.结果:经过三轮筛选后,这些噬菌体展示肽有明显的富集,从第三轮挑选的22个克隆的插入氨基酸序列可分为三大类;点印迹结果表明,这些噬菌体展示肽能与PSA特异结合,而α-甲基-D-甘露糖苷不同程度地抑制这种结合; LRLRQL不溶于水,ARMWSF和RYDYSY对PSA和HRP的结合有抑制,而对ConA和HRP的结合没有明显抑制.结论:人工合成的2条6肽和PSA的结合部位与α-甲基-D-甘露糖苷和PSA结合的部位并非相同.     

不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体文库的体外进化研究

目的判断不同亚类小鼠IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点,采用不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体展示文库进行亲和筛选。方法不同亚类小鼠IgG对噬菌体文库进行亲和筛选,获得具有结合优势的单结构域排列组合,噬菌体ELISA法来比较其与不同亚类小鼠IgG的结合特性,优势组合分子经原核表达蛋白,HRP标记后,ELISA法进一步来比较其与小鼠不同亚类IgG的结合特性。结果小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3分别经过5、4、5和5轮亲和筛选后,其文库的展示片段大小均为2个domain,表明进化完全。测序分析显示：小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3筛选得到的具有结合优势组合分子分别是D-D、D-D、A-C和D-C。噬菌体 ELISA验证结合优势组合分子对小鼠不同亚类IgG的结合能力;蛋白经HRP标记后的ELISA结果和筛选不完全一致,但其结合强弱具有一致性,均为：IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。结论得到3种不存在于天然SpA、SpG分子中,分别与不同亚类小鼠IgG具有较强结合作用的新型组合分子D-D、A-C和D-C,为进一步研究IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点提供了新的参考分子。     

噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽

目的：利用噬茵体7肽库筛选高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM表面转移相关分子结合肽。方法：利用噬茵体展示技术体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective inter-activeligands,BRASIL）卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选14个噬茵体单克隆进行DNA测序,并进行ELISA、噬茵体竞争结合实验验证阳性噬茵体的亲和性。结果：噬菌体克隆Z3（短肽LRLRNTR）对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高的亲和性。结论：噬茵体展示技术筛选的短肽LRLRNTR可望为卵巢肿瘤早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。     

反复呼吸道感染患儿免疫球蛋白及IgG亚类的水平

目的：探讨反复呼吸道感染（RRTI）与免疫球蛋白、IgG亚类的关系,为治疗RRTI提供理论依据。方法：采用免疫散射比浊法,检测28例RRTI患儿IgG、IgA、IgM及IgG亚类水平并与对照组比较。结果：RRTI患儿血清IgG、IgA水平与对照组相比差异无显著性,血清IgM水平与对照组相比明显降低（t=-2．524,P〈0．05）;RRTI组血清IgG2和IgG。水平比对照组明显降低（t=-2．107,-2．72;P〈0．05或P〈0．01）。结论：RRTI患儿存在一定程度的免疫功能紊乱,检测血清总免疫球蛋白和IgG亚类可提高RRTI的诊断率。     

构建SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库

目的 构建免疫球蛋白结合分子金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)和链球菌蛋白G(SPG)单结构域随机组合噬菌体展示文库,为研究其分子功能与结构的关系奠定基础.方法 PCR扩增制备SPA的A、B、C 、D、 E结构域和SPG的B2结构域核苷酸片段,在片段两端通过引物引入XbaⅠ酶切位点和保护碱基,3′端引入3个氨基酸大小的随机连接肽核苷酸序列,各结构域核苷酸片段经XbaⅠ酶消化,在T4连接酶作用下随机相互连接并克隆于噬菌体展示载体pCANTAB5S,克隆产物转化E.coli DH5α,提取原代库质粒转化E.coli TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库.结果 该噬菌体展示文库库容量为1.87×107 cfu,滴度为1.3×1014 TU/ml,文库的片段插入率近100%,其中插入多个结构域的阳性克隆占21.7%,序列分析显示各结构域之间的连接和随机连接肽序列具有随机性.结论 成功地构建了SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库,该文库在库容量、多样性和随机性方面满足体外分子进化研究的要求.     

人胸腺素原α的克隆、表达和活性初步研究

目的:构建由免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合的噬菌体展示文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选研究打下基础.方法:PCR扩增制备分别编码Protein A的A、D结构域、Protein G的B2结构域和Protein L的B3结构域的序列片段,片段两端引入Xba Ⅰ酶切位点,3′端引入分别编码0、1、2、3个氨基酸大小随机连接肽的序列,并克隆于pMD-18T载体构建重组质粒.以上述16种重组质粒为模板,PCR扩增分别制备各种单结构域片段及两端部分T载体序列,XbaⅠ酶切,各种酶切片段混合后连接,并克隆于噬菌体展示载体pCANTAB5S,构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库,挑取单克隆进行序列测定,评价文库的随机性.结果:噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库库容量为2×107,滴度为1.3×1011;文库中含77%以上的阳性克隆,其中由2个以上单结构域组成的阳性克隆占24%;序列分析显示组合文库包含上述4种单结构域序列,连接方式符合随机连接的特点,随机连接肽的编码核酸也呈随机分布.结论:成功构建了免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库,该文库库容、多样性和随机性完全可满足进行体外分子进化研究的要求.     

丝状噬菌体随机呈现肽库的构建与鉴定

目的：构建一个随机２０个氨基酸的丝状噬菌体肽库。方法：扩增随机合成ＤＮＡ模板,经限制性内切酶ＸｈｏⅠ＋ ＳｐｅⅠ酶切后克隆进噬菌粒ｐＴＭＢ２,构建随机丝状噬菌体肽库并检验其库容及随机性。结果：完成丝状噬菌体随机肽库的构建,其库容为２．１×１０８,其氨基酸分布于理论频数无显著差异。结论：丝状噬菌体随机肽库被成功构建。     

正常人天然IgG抗体噬菌体呈现库的构建

目的 建立一个正常人天然ＩｇＧ抗体委员长 菌体呈现库。方法：从一献血员取５０ｍＬ新鲜血液,分离淋巴细胞。提取ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ,依次将ＰＣＲ产物插入载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ相应位点。以点印迹检测噬菌体表面Ｆａｂ的表达,结果 所有４个ＩｇＧ亚类的重链Ｆｄ片段、部分κ轻链和λ轻链ｃＤＮＡ得到扩增。先期插入的重链Ｆｄ的实际库容达１．１×１０＾６,插入率２０％。后期插入的     

噬菌体展示随机十五肽库的构建

为了满足药物筛选的需要,本实验以pCANTAB 5E噬菌粒为载体,构建表达于丝状噬菌体尾丝蛋白P3N末端的随机十五肽库。通过自行设计引物与模板,人工合成编码随机十五肽的寡核苷酸片段及含有酶切位点的引物。通过PCR技术进行模板扩增获得编码随机十五肽的基因。将扩增后的目的基因经过Sfi Ι,Not Ι两个限制性内切酶双酶切后,与经同样双酶切的5′去磷酸化的噬菌粒载体连接,将重组产物电转入大肠埃希菌TG1感受态细胞。集合菌落后进行库容和多样性检验。所建肽库库容可达5×10⁸。随机挑取20个克隆测序,其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机。成功构建了库容量与多样性都满足筛选要求的噬菌体展示随机十五肽库。     

大库容量人源性天然单链抗体库的构建

目的：构建一个大库容量（＞10^8）的人类天然单链抗体库。方法：从正常人400mL外周血分离林巴细胞,提取mRNA后反转录出cDNA第一链, 行半套式PCR扩增VH和VL基因片段,依次插入含Loxp和Loxp511序列的pDNA5,电转化TG1大肠杆菌,构建初级库进一步用初级库感染BS1365使其VH,VL发生重组从而获得次级库。结果：所有VH,VL亚类基因都得到了扩增,scFv克隆效率为99．9％,重组效率为每个单克隆BS1365中含至少8种不同的scFv基因。初级库容量为10^7,次级库容量至少为10^11。结论：我们采用细胞内重组的方法构建了10^11的人类天然抗体库。     

应用噬菌体肽库筛选胃癌相关抗原模拟表位

目的 利用噬菌体递呈随机肽库筛选技术,进行胃癌相关抗原ＭＧ７Ａｇ模拟表位的研究,方法 应用离子交换层析法从小鼠腹水中纯化抗胃癌单克隆抗体ＭＧ７Ａｂ,细胞ＥＬＩＳＡ方法检测其活性,以ＭＧ７ｍＡｂ作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈随机７肽库,经３次淘洗后将筛选所得的噬菌体克隆进行ＤＮＡ测序,递呈随机７肽氨基酸序列同源性分析,结果 对阳性噬菌体进行递呈肽氨基酸序理分析,获得一侯选模拟表位（ＫＰＨＸＨＸ     

人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建

目的　利用噬菌体表面展示技术 ,构建人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .方法　从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总 RNA,反转录成 c DNA后 ,用PCR扩增人 Ig G1Fd段及κ轻链 ,并克隆至噬菌粒载体p COMB3中 ,转化宿主菌株 XL 1- Blue,以辅助噬菌体M13K0 7超感染噬菌粒文库 ,构建成人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .结果　得到一个含克隆数为 1.2× 10 6 ,实际滴度约为 2 .5 6× 10 1 5 pfu· L- 1的 Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库 .结论　Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建 ,为下一步利用亲和富集筛选技术 ,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础