VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达

目的 构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,并检测其在人胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达.方法 以人脐血单核细胞的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因,并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中,构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA.经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后,用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞,转染后24 h和48 h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达.结果 pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带,测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致.在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞,并在其中得到了表达.结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础.     

人血管内皮生长因子受体3胞外1-3区基因的克隆与表达载体的构建

目的构建人血管内皮生长因子受体(VEGFR)-3胞外1-3区基因原核表达体系。方法提取人胎盘组织上总RNA,经反转录制备cDNA;从Genebank获取该基因序列,设计引物进行聚合酶链反应(PCR)以扩增VEGFR-3胞外1-3区基因片段,回收和纯化PCR产物并将其插入pMD18T载体中进行克隆;测序正确后,将目的基因克隆入原核表达载体pBV220,对获得的原核表达质粒进行初步鉴定。结果构建了pBV220-VEGFR-3质粒表达载体,经DNA测序鉴定序列正确。结论应用基因工程技术,成功构建了VEGFR-3原核表达载体。     

Narcotrend监测在手术患者全身麻醉中的应用

目的研究Narcotrend（NT）监测在手术患者全身麻醉中应用的可行性和优越性。方法选择腹腔镜胆囊切除术（LC）全麻患者60例,采用抽签的方法将所有患者随机分为NT监测组（N组,n=30）和常规监测对照组（C组,n=30）。术中,C组全麻药用量依据患者的血压、心率等生命体征及平时用药经验进行调控;N组全麻药用量依据麻醉趋势指数（NTI）进行调控。记录麻醉时间、手术时间、苏醒时间、拔管时间及麻醉后监测治疗室（PACU）驻留时间;记录术中全麻药用量和患者围术期相关并发症的发生率。结果与C组比较,N组患者的苏醒时间、拔管时间及PACU驻留时间明显缩短（P〈0.05）;全麻药丙泊酚的用量显著减少（P〈0.01）;全麻药咪唑安定、舒芬太尼及罗库溴铵用量差异无统计学意义（P〉0.05）;围术期相关并发症的发生率差异亦无统计学意义（P〉0.05）。结论全麻患者使用NT行麻醉深度监测,能减少全麻药用量,缩短苏醒时间,减少PACU驻留时间,加快手术患者全麻后恢复。     

HBx-siRNA 下调 HepG2．2．15细胞中血管内皮生长因子的表达

目的：研究 HBx干扰质粒pSIHBV/X对肝癌细胞HepG2．2．15中VEGF表达的影响。方法将针对HBx基因的干扰质粒载体pSIHBV/X转染HepG2．2．15细胞,用Real-time PCR检测转染前后细胞 HBx、VEGF基因 mRNA 表达,Western blot法检测细胞 VEGF蛋白表达。结果Real-time PCR检测结果显示,转染后24 h、48 h、72 h实验组 HepG2．2．15细胞中 HBx基因mRNA相对表达水平分别为（121．13±8．72）、（83．17±7．930）、（56．33±6．17）;24 h、48 h、72 h实验组HepG2．2．15细胞中 VEGF基因 mRNA 相对表达水平分别为（76．26±7．16）、（59．17±6．420）、（42．17±4．33）;Western blot检测结果显示,24 h、48 h实验组 HepG2．2．15细胞中VEGF蛋白相对表达水平分别为（0．357±0．025）、（0．218±0．051）。Western blot及RT-PCR结果显示,与对照组相比实验组中VEGF mRNA 及蛋白的表达量明显下调,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论靶向HBx的siRNA干扰质粒能抑制 HepG2．2．15细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达。     

贝伐单抗在中晚期宫颈癌中的应用

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤。早期宫颈癌可通过手术根治,但中晚期宫颈癌患者5年生存率较低,且生活质量不甚理想。靶向治疗是继传统治疗方法以外的一种有效的新型治疗方法。贝伐单抗是以抑制血管内皮生长因子为作用机制的分子靶向治疗药物。该文综述了有关贝伐单抗在宫颈癌中的临床应用及研究进展。     

麻醉深度指数在全身麻醉手术中监测麻醉深度的应用

目的：通过临床观察手术期间全身麻醉麻醉深度指数（CSI）的变化来调整麻醉药用量，评价CSI在监测麻醉深度方面的实用性。方法：随机选择拟施气管内插管的全麻患者50例，ASA-Ⅱ～Ⅲ，分为CSI组和对照组，每组25例，其中，CSI组，CSI监测数据判断麻醉深度并调整用药；对照组，麻醉医师根据临床经验判断麻醉深度并调整用药。监测记录患者入室10min（T0）、插管前1min（T1）、插管后3min（T2）、切皮时（T3）、手术刺激最强时（T4）、拔管前（T5）、出手术室（T6）等各时点的SBP、DBP、HR、SpO2、CSI值，记录两组患者苏醒时间、苏醒状态、术后24h内随访是否存在术中知晓、是否发生疼痛不适。结果：CSI组，术中维持CSI值在50±5范围内，各项指标均较平稳，麻醉药用量也较对照组少，苏醒时间较短，苏醒过程平稳，无术中知晓现象发生；对照组，术中各项指标均下降明显，术中波动也较大，而且苏醒时间较长，存在知晓、恶心、呕吐、躁动、嗜睡等现象。结论：术中根据麻醉深度指数调整麻醉药用量可以保证患者生命指征平稳，减少麻醉药用量，缩短苏醒时间，使苏醒过程更加平稳、安全。     

VEGF-C及其受体Flt-4在人宫颈癌组织中的表达及与淋巴结转移的关系

目的 探讨血管内皮生长因子C(VEGF-C)及其受体Flt-4在人宫颈癌组织中的表达及其与淋巴结转移等临床病理特征的关系.方法 采用免疫组化S-P法检测60例宫颈癌原发灶组织、10例癌旁组织、8例伴有宫颈癌转移的淋巴结组织中VEGF-C、Flt-4的表达,并将结果与宫颈癌的临床病理特征进行分析.结果 VEGF-C和Flt-4在转移的淋巴结癌细胞中、宫颈癌和癌旁组织中的表达各组间差异有显著性意义(均P＜0.01);宫颈癌中Flt-4阳性微脉管数在淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组,差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论 在宫颈癌组织中VEGF-C水平上调,是由宫颈癌细胞分泌,并通过自分泌方式作用于细胞膜上的Flt-4受体,与宫颈癌的发生有一定关系;VEGF-C与宫颈癌中淋巴管的生成及淋巴结转移密切相关.     

生存素在宫颈癌组织中的表达及其意义

目的：探讨生存素在宫颈癌组织中的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学法检测生存素在46例宫颈癌组织及20例正常宫颈组织中的表达。结果：生存素在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达率分别为29例（63．04％）和2例（10％），差异有统计学意义（χ^2=15．75，P〈0．01）。结论：生存素在宫颈癌组织中的异常表达可能对宫颈癌的发生起着重要作用。     

腺相关病毒载体介导的VEGF121基因的构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达

目的 研究腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子基因(AAV-VEGF121)的体外促血管内皮细胞生长作用.方法 RT-PCR法获取人VEGF121基因,克隆入pAAV-MCS载体中,构建成pAAV-VEGF121(处理组),以空白载体克隆入pAAV-MCS病毒(对照组);两组分别在AAV-293细胞中包装成pAAV-VEGF121病毒颗粒和空白病毒颗粒.相同条件下,两组分别感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),半定量RT-PCR检测细胞内VEGF121基因mRNA的表达;CCK-8法测取OD450nm值,绘制细胞增殖曲线;电子显微镜观察细胞超微结构的改变.结果 成功构建AAV-VEGF121;半定量RT-PCR显示处理组细胞内VEGF121的mRNA表达水平高于对照组(P＜0.01);细胞增殖曲线显示处理组细胞增殖能力明显高于对照组;透射电镜显示处理组细胞内与蛋白质合成有关的细胞器增生明显活跃.结论 AAV-VEGF121基因对血管内皮细胞的生成具有促进作用.     

麻醉护理在全身麻醉手术患者中的应用研究

目的研究麻醉护理在全身麻醉手术患者中的应用效果。方法选取2018年1月至2018年7月前来我院接受全身麻醉手术治疗的82例患者,采用均衡分组法分为对比组和研究组,各41例。对比组采用常规护理,研究组采用麻醉护理,术后1个月后开展随访观察疗效。结果研究组术中应激反应发生率2.44%低于对比组的26.83%,研究组麻醉评分高于对比组,护理后,研究组心率指标高于对比组和护理前,对比有统计学意义(P <0.05)。结论麻醉护理在全身麻醉手术患者中的应用效果显著,能够减少术中应激反应发生的同时,稳定其心率指标,具有较高临床推广价值。     

泮托拉唑肠溶片的健康人体生物等效性研究

目的建立测定人血浆中泮托拉唑的高效液效液相色谱法（HPLC）,研究泮托拉唑肠溶片在男性健康志愿者体内的药动学行为,评价其人体相对生物利用度和生物等效性。方法 18例健康男性志愿者随机分组自身交叉对照试验设计,单剂量口服泮托拉唑肠溶片受试制剂和参比制剂40 mg,HPLC法测定服药后12 h内不同时间血浆中泮托拉唑的浓度,BAPP药动学程序计算相对生物利用度并评价2种制剂生物等效性。结果受制剂试和参比制剂的主要药动学参数：Tmax分别为（3.4±0.6）h和（3.3±0.4）h;Tmax为（3 435.11±1 101.72）μg.L-1和（3 312.37±987.50）μg.L-1;T1/2分别为（1.60±0.31）h和（1.73±0.47）h,药时曲线下面积AUC（0→36 h）分别为（7 805.88±2 390.66）μg.h-1.L-1和（7 459.61±2 641.25）μg.h-1.L-1。受试制剂与参比制剂的相对生物利用度为（107.30±20.20）%。结论建立的分析方法准确灵敏,测得的数据可靠,统计学分析表明2种制剂生物等效。     

两种盐酸特拉唑嗪片的人体生物等效性研究

目的 评价单剂量口服国产和进口盐酸特拉唑嗪片的人体生物等效性。 方法 采用单中心、随机、开放、双周期交叉试验设计,21名受试者在不同周期分别空腹口服国产和进口盐酸特拉唑嗪片2 mg,于给药前0 h及给药后60 h内不同时间点采集静脉血4 ml,采用液-质联用(LC-MS/MS)法测定受试者血浆中特拉唑嗪的浓度。 结果 国产和进口盐酸特拉唑嗪片的t_1/2分别为(13.2±2.39)和(12.5±1.93) h;t_max分别为(1.01±0.83)和(1.08±0.69) h;C_max分别为(40.1±10.6)和(37.3±9.57) ng/ml;AUC_0-∞分别为(428±82.1)和(426±85.2) ng·h/ml。国产盐酸特拉唑嗪片的相对生物利用度为(101.2±14.7)%。国产与进口盐酸特拉唑嗪片AUC_0-t和C_max几何均值比的90%置信区间(CI)均落在80%~125%之间。 结论 国产和进口盐酸特拉唑嗪片具有生物等效性。     

Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒的构建和制备

目的:以pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统为载体构建用于实验动物模型基因治疗的Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒。方法:采用RT-PCR方法从人心肌组织中扩增获得VEGF121、VEGF165cDNA片段,分别插入pUCm-T载体构成pUC-VEGFs;限制性内切酶SalⅠ、KpnⅠ切下目的基因片段,插入pAdTrack-CMV载体相应的多克隆位点构成pAdTrack-CMV-VEGFs。电转法将被PmeⅠ切成线性的pAdTrack-CMV-VEGFs转入E coli BJ5183,与其中的pAdEasy-1同源重组成pAdEasy-VEGFs。阳离子脂质体法将被PacⅠ线性化的重组子转染293T细胞进行腺病毒包装。转染后7～11d可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(GFP)呈彗星状,收集细胞反复冻融获得含重组腺病毒的上清液。感染293T细胞3～4次,待细胞出现细胞病变效应(CPE)时收获腺病毒(Ad-VEGFs),并用CsCl密度梯度超速离心进行纯化。结果:重组腺病毒在电镜下呈多面体,形态完整;Ad-VEGF121和Ad-VEGF165病毒滴度分别达到1.155×1012和1.281 5×1012 V.P/mL。结论:利用pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统构建携带目的基因的重组腺病毒方法较简便,易掌握。获得的重组腺病毒纯度高、滴度高,适用于实验动物模型和体外培养细胞的基因治疗。     

单剂量盐酸左西替利嗪片人体生物等效性研究

目的:研究盐酸左西替利嗪片(受试制剂)与已上市的盐酸左西替利嗪片(参比制剂)的相对生物利用度和生物等效性。方法:健康男性志愿者18例,采用双周期两制剂交叉试验设计,分别口服受试制剂或参比制剂10 mg,用HPLC法测定血药浓度,DAS软件处理计算药动学参数和相对生物利用度。结果:受试制剂与参比制剂的t_(1／2)Ke分别为(5．4±1．2)和(4．9±1．5)h;C_(max)分别为(424．4±89．2)和(415．3±65．0)ng·mL~(-1)。T_(max)分别为(1．2±0．8)和(1．1±0．5)h。AUC_(0-24h)分别为(3 223．3±612．3)和(3 216．5±654．8)ng·h·mL~(-1)。相对生物利用度为(103．5±26．8)%。AUC_(0-24h)90%置信区间为0．9326～1．0821,C_(max)190%置信区间为0．9482～1．0821,T_(max)经非参数法检验,差异无统计意义。结论:2种制剂生物等效。     

盐酸普拉克索片在中国健康受试者的生物等效性试验

目的:研究盐酸普拉克索片与原研制剂森福罗的人体生物等效性。方法:24例健康受试者参加空腹试验,24例健康受试者参加餐后试验,均采用随机开放两周期交叉试验设计,分别于每周期单剂量口服0.25 mg盐酸普拉克索片受试制剂(T)或参比制剂(R)。采用液相色谱-串联质谱分析方法(LC-MS/MS)测定血浆中普拉克索浓度。用Phoenix WinNonlin 6.4计算药代动力学参数,其他统计分析工作使用SAS 9.3软件分析。结果:空腹组健康受试者口服受试制剂和参比制剂后的主要药代动力学参数(n=20):C_max分别为(481.15±102.21)、(497.25±133.31)pg/mL,T_max分别为1.77(0.5,5)、1.50(0.5,5)h,AUC_0-t分别为(6.18±1.49)、(6.20±1.28)pg·mL^-1·h,AUC_0-∞分别为(6.41±1.55)、(6.42±1.31)pg·mL^-1·h,T 1/2分别为(9.18±1.29)、(9.02±1.14)h。受试制剂C_max、AUC_0-t、AUC_0-∞几何均数的90%置信区间分别落在参比制剂相应参数的92.20%~103.10%、94.06%~104.35%、94.17%~104.07%,均在80.00%~125.00%范围之间,符合生物等效性规定要求。高脂餐组健康受试者口服受试制剂和参比制剂后的主要药代动力学参数(n=22):C_max分别为(515.36±83.28)、(500.05±64.12)pg/mL,T_max分别为2.00(1,4)、1.75(1,4)h,AUC_0-t分别为(5.94±1.36)、(5.67±1.05)pg·mL^-1·h,AUC_0-∞分别为(6.16±1.43)、(5.88±1.11)pg·mL^-1·h,T 1/2分别为(8.92±2.00)、(8.85±1.98)h。受试制剂C_max、AUC_0-t、AUC_0-∞几何均数的90%置信区间分别落在参比制剂相应参数的97.84%~107.41%、99.03%~108.79%、99.12%~108.68%,均在80.00%~125.00%范围内,符合生物等效性规定要求。结论:盐酸普拉克索片受试制剂和参比制剂在健康受试者体内具有生物等效性。     

盐酸阿夫唑嗪缓释片人体内生物利用度

目的:比较盐酸阿呋唑嗪缓释片和进口阿呋唑嗪普通片的人体生物利用度和生物等效性。方法:20名男性健康受试者自身交叉口服单剂量盐酸阿呋唑嗪缓释片和进口普通片5mg,用高效液相色谱(HPLC)法测定人血浆中盐酸阿呋唑嗪的浓度,计算药动学参数,以方差分析与双向单侧t检验进行统计学分析。结果:盐酸阿呋唑嗪缓释片和进口普通片的Cmax分别为(28.9±9.6)μg.L-1和(32.9±10.2)μg.L-1,tmax分别为(2.7±0.6)h和(1.4±1.0)h,AUC0→∞分别为(221.1±59.5)μg.L-1.h和(245.7±67.2)μg.L-1.h。两药各药动学参数间均无统计学差异。盐酸阿呋唑嗪缓释片的相对生物利用度为(92.2±13.2)%。结论:两种制剂具有生物等效性。     

UV法测定盐酸二甲双胍肠溶片的释放度和含量

目的：建立盐酸二甲双胍肠溶片的质量标准。方法：采用UV法测定盐酸二甲双胍肠溶片在酸及缓冲液中的释放度及含量。结果：在选定的波长外,辅料及肠溶衣剂对测定无干扰,释放度平均回收率99．0％,含量平均回收率99．9％。结论： 测定方法简便、结果可靠,可作为该制剂质量控制标准.     

盐酸伐昔洛韦片的人体生物等效性

目的研究2种盐酸伐昔洛韦片的生物等效性。方法18名健康受试者单剂量交叉口服500和600 mg 2种规格的盐酸伐昔洛韦片,采用HPLC-UV检测法测定血药浓度。数据经DAS软件处理。结果盐酸伐昔洛韦供试制剂600 mg片与参比制剂500 mg片的主要药动学参数如下:AUC0→Tn分别是(11.15±2.05)、(9.82±2.09)mg.h.L-1;AUC0→∞分别为(11.80±2.24)、(10.51±2.20)mg.h.L-1;ρmax分别是(2.85±0.62)、(2.40±0.51)mg.L-1;tmax分别是(2.19±0.30)、(2.19±0.25)h;t21分别是(2.51±0.45)、(2.80±0.35)h。将两制剂主要药动学参数AUC0→Tn、AUC0→∞、ρmax经剂量校正后对数转化,作生物等效性分析,按AUC0→Tn计算,受试片的相对生物利用度为(94.30±8.62)%。tmax经非参数秩和检验,两制剂差异无统计学意义。结论2种规格的盐酸伐昔洛韦生物等效。     

基因重组hVEGF165腺相关病毒载体的包装和鉴定

目的:采用rAAV Helper free System构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒,并初步鉴定其感染情况。方法:采用AAV-Helper free system包装系,构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒载体质粒,应用电穿孔方法质粒共转染HEK293细胞,分离纯化后获得rAAV-hVEGF165和rAAV-EGFP,AVSachTMELISA法测定rAAV颗粒滴度,并鉴定其对HEK293细胞的感染情况。结果:包装纯化后获得病毒滴度可达到2×1011,电镜观察病毒颗粒均匀,病毒大小20～25nm,呈多面体形态。结论:成功包装hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒。