还原性多肽共载基因和化学治疗药载体的构建与体外评价

目的 制备一种应用于共载基因和化疗药的硫辛酸（LA）修饰的非内吞机制进入细胞的固有无序正常蛋白-细胞质定位的内化肽6（CL）的纳米复合物(LA-CL),并考察其对HEK293细胞的转染效率、胞摄取情况,以及体外释放规律。方法 以不同比例（2.5%、5%、10%、20%）半胱氨酸作为交联剂,合成四种不同交联度的LA-CLss (LA-CLss1, LA-CLss2,LA-CLss3, LA-CLss4),利用1H-NMR和凝胶色谱鉴定合成的LA-CLss。取增强绿色荧光蛋白质粒(plasmid Enhanced Green Fluorescent Protein, pEGFP) 和LA-CLss以不同氮磷比（N/P）（2.5, 5, 10, 20, 40, 80）自组装形成纳米复合物,粒度测定仪测定复合物的粒径和zeta电位,琼脂糖凝胶电泳测定载体LA-CLss对pEGFP的包裹能力以及保护作用。用超声乳化法制备载多西他赛的载药胶束,并用芘荧光探针法测定其临界胶束浓度。用LA-CLss/ pEGFP纳米复合物与人胚肾HEK293细胞共同培养,考察不同交联度复合物的细胞转染情况。结果 通过核磁结果确定LA-CLss合成成功;在N/P=40时,HEK293细胞对LA-CLss3/ pEGFP的转染效率高于其他四种 复合物(LA-CLss, LA-CLss1,LA-CLss2, LA-CLss4)。超声乳化法制备的载药胶束包封率为85.25 ± 0.04%,载药量为8.81 ± 0.02%。细胞摄取结果表明该载体可以有效地将基因递送进细胞内。体外释放实验结果表明该多肽胶束具有还原性条件敏感释药行为。结论 制备的LA-CLss纳米复合物有望成为一种高效的共载基因和化疗药的载体。     

尿刊酸修饰壳聚糖载基因纳米复合物的制备及体外性质

制备新型壳聚糖衍生物——尿刊酸修饰壳聚糖（UAC)/质粒DNA（pDNA）纳米复合物,采用凝胶电泳阻滞实验评价UAC包裹pDNA的能力;通过对各种影响因素（包括pH、渗透压、脱氧核糖核酸酶及肝素）的考察,对该纳米复合物的稳定性进行评价;利用激光粒度仪测定该纳米复合物的粒径和Zeta电位,透射电镜对其进行形态学观察。研究结果表明,高取代度（50.0%）的载体UAC在氮磷比（N/P）≥3时将pDNA完全包裹形成纳米复合物;N/P越高,该纳米复合物对碱性环境、高渗透压、DNaseⅠ、肝素的稳定性越好;低相对分子质量壳聚糖（20 kD）的UAC能够更有效地保护pDNA免受DNaseⅠ的降解,且形成的纳米复合物较容易被肝素解聚;N/P为30的纳米复合物的粒径为125.2 nm,Zeta电位为+37.9 mV,呈类球形结构。因此,高取代度、低相对分子质量壳聚糖的载体UAC与pDNA形成高N/P的纳米复合物能够具有良好的特性,适合进行细胞转染实验,有望成为一种新型载基因纳米复合物。     

聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递

 【目的】研究非病毒基因载体聚乙二醇（PEG）-聚乙烯亚胺（PEI）共聚物的组成对体外介导基因传递的影响。【方法】将含PEG不同分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物,与DNA形成复合物。考察带正电荷的PEI与带负电荷的DNA的相互作用,测定了PEG-PEI/DNA复合物的粒径和Zeta电位,及对Hela细胞的毒性和转染率。【结果】PEG侧链并未明显影响PEI与DNA形成复合物的能力;连接PEG5000能够明显降低复合物的粒径;复合物的Zeta电位随着PEG接枝量的增加而降低;细胞毒性不依赖于PEG的分子量的变化,而是取决于PEG的接枝量;共聚物PEG-PEI（2-25-1）被证实为较有效的介导体外基因传递的复合物。【结论】共聚物的结构组成对DNA复合物的理化性质、毒性和转染率都产生较大的影响。     

聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递

【目的】研究非病毒基因载体聚乙二醇（PEG）-聚乙烯亚胺（PEI）共聚物的组成对体外介导基因传递的影响。【方法】将含PEG不同分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物,与DNA形成复合物。考察带正电荷的PEI与带负电荷的DNA的相互作用,测定了PEG-PEI/DNA复合物的粒径和Zeta电位,及对Hela细胞的毒性和转染率。【结果】PEG侧链并未明显影响PEI与DNA形成复合物的能力;连接PEG5000能够明显降低复合物的粒径;复合物的Zeta电位随着PEG接枝量的增加而降低;细胞毒性不依赖于PEG的分子量的变化,而是取决于PEG的接枝量;共聚物PEG-PEI（2-25-1）被证实为较有效的介导体外基因传递的复合物。【结论】共聚物的结构组成对DNA复合物的理化性质、毒性和转染率都产生较大的影响。     

PPI-DNA复合物的制备和PPI载体的细胞毒性研究

目的研究2．0代聚丙烯亚胺树状物（2．0G PPI）和单甲氧基聚乙二醇（mPEG）的修饰物（PPI—PEG）与DNA的复合物的制备和PPI的细胞毒性。方法用丁二酸酐和琥珀酰亚胺两步活化的mPEG耦联到PPI的氨基上,得到PPI—PEG,应用现代渡谱等技术对中间体和最终产物进行表征。采用绿色荧光蛋白基因质粒pEGFP—N1为DNA模型,凝胶点用法研究了PPI和PPI—PEG与DNA的复合,并且采用MTT法测定它们的细胞毒性。结果凝胶电泳数据显示PPI阻滞了DNA在琼脂糖凝胶中电泳,MTY数据显示PPI对细胞具有一定毒性。结论PPI作为基因载体可以与DNA形成复合物,且PPI偶联上PEG后毒性降低。     

双嵌段磷酸胆碱基聚合物作为c-myc AS-ODN基因运输载体研究

目的 探讨双嵌段磷酸胆碱基聚合物MPC30-DEA70 作为反义寡核苷酸（AS-ODN）运输载体的安全性和有效性.方法 将载体MPC30-DEA70（N）与c-myc AS-ODN（P）在不同N/P比值的条件下复合,应用DNA凝胶电泳法、荧光显微镜、流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法对复合物溶液进行检测,观察复合物在HeLa细胞中的转染情况.结果 c-myc AS-ODN能与载体MPC30-DEA70电性中和,N/P比值越大复合物正电性越强;MPC30-DEA70/AS-ODN复合物能够进入细胞,转染效率随着N/P比值增大而增大;同时随着N/P比值增大复合物对细胞的增殖抑制作用显著增强.结论 MPC30-DEA70可以有效负载和运输c-myc AS-ODN,抑制HeLa细胞增殖,是一种新型的、安全有效的非病毒类转基因载体.     

聚乙烯亚胺/DNA复合物处方工艺优化及体外转染效率

目的:考察聚乙烯亚胺(PEI)相对分子质量、氮磷比(N/P比)、溶剂、离子强度等对PEI/DNA复合物形成、表面性质以及细胞转染效率的影响。方法:制备不同相对分子质量PEI/DNA复合物,通过凝胶电泳和紫外吸收检测确定PEI与DNA的复合能力(N/P比),测定不同溶剂、离子强度下的粒径和Zeta电位,考察复合物在HepG2细胞中的转染情况。结果:PEI与DNA的复合能力与PEI的相对分子质量呈正相关,不同溶剂、离子强度会影响复合物的表面性质,以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂、PEI(25kD)为载体、N/P比为12～15时,PEI/DNA复合物细胞转染效率明显优于质粒DNA,仅略低于阳性对照组。结论:经优化的PEI/DNA复合物可显著提高DNA在细胞中的转染效率。     

聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的接枝率对其纳米胶束自组装特性的影响

目的研究合成产物聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖(m PEG-g-CS)中聚乙二醇接枝率对其纳米胶束自组装特性的影响,为自组装纳米胶束作为药物载体的研究提供理论依据。方法按5种不同的壳聚糖(CS)与聚乙二醇单甲醚(m PEG)的投料质量比(CS/m PEG分别为1∶1、1∶3、1∶6、1∶9、1∶12),通过甲醛连接法合成不同接枝率的m PEG-g-CS。采用稳态荧光探针法荧光分光光度计测定其荧光强度计算m PEG-g-CS临界胶束浓度,并通过粒径分析仪分析自组装纳米胶束粒径分布。比较接枝率不同的聚合物对其临界胶束浓度及粒径大小的影响。结果 CS质量一定的情况下,随着m PEG投料质量比增加(CS/m PEG分别为1∶1、1∶3、1∶6、1∶9),聚合物接枝率和临界胶束浓度均依次增高(P<0.05)。其中投料质量比为1∶1组自组装纳米胶束平均粒径最大,投料比为1∶6组平均粒径最小;除投料比为1∶9组与1∶12组平均粒径比较差异无统计学意义(P>0.05)以外,其余各组平均粒径比较差异均有统计学意义(P<0.05)。CS/m PEG 1∶1组和1∶3组粒径分布出现双峰,1∶6组、1∶9组、1∶12组粒径分布呈现均一单峰分布。结论通过控制m PEG和CS的投料质量比可获得不同接枝率的m PEG-g-CS样品,m PEG-g-CS能自组装成纳米胶束,且接枝率不同的聚合物其纳米胶束自组装特性和粒径分布亦出现差异。根据其胶束的稳定性和粒径分布,投料比为1∶6和1∶9的聚合物有望作为纳米药物载体。     

MPEG-PLGA纳米胶囊在真核质粒转染细胞中的应用

目的验证MPEG-PLGA纳米胶囊在真核质粒转染细胞中应用的可行性。方法利用直接溶解法将MPEG-PLGA溶解于4℃双蒸水中,加入绿色荧光载体混匀后静置于37℃恒温箱中30 min制成MPEG-PLGA/pEGFP-C3纳米胶囊复合物,检测复合物粒径大小并转染机体细胞,通过对机体细胞绿色荧光的表达判断复合物的转染效率。结果 MPEG-PLGA/pEGFP-C3粒径为28.3 nm,细胞绿色荧光显示复合物组转染率远大于裸质粒对照组。结论 MPEG-PLGA/pEGFP-C3纳米胶囊复合物可有效提高质粒的转染率,可作为一种新型跨膜载体在临床与研究中应用。     

新型低相对分子质量聚乙烯亚胺耦联载体(PEI-Bu)对大鼠原代骨髓间充质干细胞的基因转染效率及毒性评价

目的 构建新型低相对分子质量聚乙烯亚胺(PEI)耦联载体,评估其对原代大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞毒性及转染效率。方法 利用可降解的氨基甲酸酯化学键耦联相对分子质量为800的PEI 制备低相对分子质量的PEI （PEI 800）衍生物纳米非病毒载体,命名为PEI-Bu;进一步对PEI-Bu压缩DNA的能力、体外降解效率及对原代BMSCs的细胞毒性和基因转染效率进行生物学评价。结果 PEI-Bu能有效压缩质粒DNA并形成稳定的复合物,所形成的复合物粒径约50 nm。与实验室常用的已商品化的相对分子质量为25 000 的PEI （PEI 25 000）相比,PEI-Bu对大鼠原代BMSCs的细胞毒性较小,且基因转染效率更高。结论 作为一种新型的非病毒纳米载体,PEI-Bu能有效转染BMSCs,且安全性较高,具有进一步研发的价值。     

壳糖体外介导血管平滑肌细胞内皮型一氧化氮合酶基因转移的初步研究

目的探讨壳糖作为非病毒载体介导质粒体外转染哺乳动物平滑肌细胞的可行性、转染效率及影响转染效率的因素。方法用壳糖包被携带绿色荧光蛋白(GFP)基因和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的质粒PAdTrack-CMV-eNOS,制备壳糖/质粒复合体(CPC-eNOS),在不同条件下将其和Wistar大鼠血管平滑肌细胞孵育,通过检测靶细胞是否表达GFP和eNOS,评价壳糖介导质粒转染的效率。并以裸质粒PAdTrack-CMV- eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS分别作为对照。结果荧光显微镜下472nm观察,CPC-eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS孵育的血管平滑肌细胞均观察到绿色荧光,Western印迹法检测均有eNOS蛋白表达,但裸质粒PAdTrack-CMV-eNOS组均为阴性。CPC-eNOS中氨基/磷酸基比值(N/P比值)为5、pH值为7.0时,对平滑肌细胞的转染效率最高。结论CPC-eNOS能够体外介导转染哺乳动物的血管平滑肌细胞。转染效率与CPC-eNOS的N/P比值和转染介质pH值有关。     

新型纳米载体SuperfectTM最适转染条件的研究

目的:对新型纳米转染载体SuperfectTM的转染效率和细胞毒性进行初步研究,以探讨其最适的转染条件。方法:以50%融汇率的小鼠黑色素瘤细胞为靶细胞,在不同条件下将,报告基因质粒pEGFP-C1与载体Super-fectTM混合为复合物进行转染。各实验组:不同的质粒剂量(0.25μg,0.50μg)、不同的N/P(N:载体分子表面胺基的数量,P:DNA中磷酸基团的数量)比(2∶1,5∶1,10∶1)及复合物与细胞的孵育时间(3 h,6 h)。各对照组:裸质粒转染组、载体转染组,非转染组为对照。转染72 h后,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测细胞毒性。结果:在不同条件下,SuperfectTM的转染效率有显著性差异(P<0.05),其细胞毒性与载体剂量和孵育时间相关。当质粒剂量为0.5μg,N/P比为5∶1,复合物与细胞孵育3 h时,SuperfectTM不仅具有较高的转染效率,而且表现出较低的细胞毒性。结论:SuperfectTM是一种高效低毒的转染载体,其最适转染条件主要与N/P比及复合物与细胞的孵育时间相关。SuperfectTM在基因治疗领域将具有良好的应用前景。     

单端羧基聚乙二醇／鱼精蛋白系统介导HSV-TK基因在官颈癌细胞中的体外研究

目的研究非病毒载体MPEG-C-鱼精蛋白系统的制备方法、其对不同剂量鱼精蛋白与单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV．TK）的结合能力以及对HeLa细胞的影响。方法将一定量的MPEG-C-和不同量的鱼精蛋白混合后与DNA室温孵育,得到MPEG-C-鱼精蛋白／DNA复合物;用琼脂糖电泳实验测定不同N／P比形成复合物时对HSV-TK的阻滞情况;用结合沉淀试验比较不同量鱼精蛋白对包裹HSV-TK的能力的影响;MTF法检测MPEG-C-鱼精蛋白对HeLa宫颈癌细胞的毒性作用及其复合物对HeLa细胞的转染率。结果MPEG-C-鱼精蛋白复合物包裹HSV-TK的能力随N／P比增大而增强：粒径随N／P比增大而减小,可达200nm左右;复合物的Zeta电位随N／P比增大而增强;与单独鱼精蛋白复合物相比．细胞转染率有所降低。结论MPEG-C-鱼精蛋白是一种制备工艺简单、对HSV．TK包裹能力高、细胞毒性小、具有一定价值的非病毒载体。     

用于基因递送的普朗尼克化聚酰胺-胺树状聚合物研究

目的合成P123修饰的聚酰胺-胺(PAMAM)聚合物,并研究其作为基因递送载体的可行性。方法合成及表征了普朗尼克P123修饰的PAMAM树状聚合物,选择A375、293T及HepG2细胞对其进行毒性实验(MTT法),选择HepG2细胞对其与质粒DNA形成的复合物进行转染实验,并与聚乙烯亚胺(PEI)以及未修饰的PAMAM进行比较。结果聚合物有较高的纯度,粒径电位结果表明复合物符合基因递送的要求,P123修饰PAMAM可以降低细胞毒性,增加细胞体外转染效率。结论 P123修饰的PAMAM是一种适用于基因递送的新型的聚合物载体。     

可降解非病毒基因载体PEG-b-(PG-g-PEI)的合成与表征

目的结合重组低分子量PEI 和PEG结构修饰两种手段合成出新型可生物降解的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨
酸-g-聚乙烯亚胺)。方法用相对分子质量600 的聚乙烯亚胺氨解嵌段聚合物PEG-b-PBLG,合成非病毒基因载体聚乙二
醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);利用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱、激光粒度分析仪、zeta电位仪和凝胶电泳对载体及其与DNA
复合物进行了表征,并通过体外细胞实验考察了载体的细胞毒性与转染效率。结果我们成功合成出窄分布的非病毒基因载体
聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);凝胶电泳测定结果表明当N/P比大于5时载体能很好地包裹DNA;载体与DNA形成的
复合物粒径为120 nm,zeta电位25 mV;通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和
很高的转染效率。结论聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)有望作为非病毒基因传递载体。
     

含RGD肽CP9修饰的聚乙烯亚胺复合物的理化特性及其转基因功能的研究

目的：构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽CP9修饰的聚乙烯亚胺（PEI），观察其理化特性和转基因功能。方法：通过琥珀酰亚胺-3-（2-嘧啶二硫）丙酸酯（N-Succinimidyl-3-（2-pyridyldithio）]propionate，SPDP）将CP9偶联到PEI上，合成新型转基因载体CP9-PEI。用^1H-NMR和FT-IR验证CP9的偶联；用凝胶电泳阻滞实验、电镜和粒径检测，观察CP9-PEI浓缩质粒DNA的能力以及浓缩质粒DNA后形成的转染颗粒形态和粒径；通过CP9-PEI在人肝癌细胞株HepG2中的转染实验来验证CP9对PEI的转染效率的影响；通过游离CP9肽的竞争抑制实验验证CP9-PEI的整合素靶向功能。结果：CP9成功偶联到PEI上；CP9-PEI能有效浓缩质粒DNA，形成的转染颗粒形态为圆形或类圆形，在N／P比为10时，粒径约为200nm。CP9-PEI的转染效率是PEI的2倍，游离CP9肽能抑制CP9-PEI的转染效率。结论：修饰了CP9的PEI能有效增加转染效率，具有整合素的靶向能力，是一种具有应用前景的转基因载体。     

Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。