乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

HBV共价闭合环状脱氧核糖核酸（cccDNA）是嗜肝 DNA病毒基因组的复制中间体,是嗜肝 DNA 病毒部分基因的mRNA和前基因组 RNA的合成模板,在 HBV感染初期即能检测到,且长期存在于细胞核中。其在 HBV 复制过程中起着关键的作用,它的长期存在也是乙型病毒性肝炎慢性化的主要原因之一。HBV cccDNA肝细胞中持续感染及抗病毒治疗复发之间的关系受到广泛的关注与肯定,现就 HBV cccDNA 常用检测方法及其临床意义作一综述。     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的特异性检测

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)是一种具有独特结构的嗜肝病毒。ＨＢＶ感染发生后 ,病毒被转运到肝细胞核 ,并在核内从松弛环状ＤＮＡ(ＲＣＤＮＡ)转化为共价闭合环状ＤＮＡ(ｃｃｃＤＮＡ) ,并以ｃｃｃＤＮＡ为模板开始一系列的病毒复制过程 ,因此ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的存在是ＨＢＶ复制的一个重要指标。ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的检测为了解病毒复制状态 ,特别是评价抗病毒药物的效果 ,具有重要的意义。本文介绍应用ＰＣＲ方法 ,特异性检测ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的技术。材料与方法一、引物设计与合成在血循环中 ,ＨＢＶ基因组为松弛型、环状和不完全双链的…     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究进展

共价闭合环状DNA(covalently dosed circular DNA,cccDNA)在HBV的复制及感染状态的建立过程中起着非常重要的作用,现将cccDNA的研究进展总结如下. 一、HBV cccDNA的检测方法 1.PCR法:PCR法包括普通PCR和定量PCR.由于松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)在负链和正链上存在缺口,我们可以设计一对跨越两个缺口的引物,由于cccDNA有完整的双链,可以被有选择地扩增.但起始模板量不能太高,否则rcDNA也有可能被扩增,Kock等[1]发现,每个PCR反应管中HBV DNA量在6×105拷贝/ml时能达到最佳的灵敏度与选择性.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测的临床应用

HBV共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA,cccDNA)是HBV复制的初始模板.近年来,随着以选择性实时荧光PCR技术为代表的各类cccDNA检测技术日渐成熟,以及临床医生对cccDNA检测临床意义认识的不断提高,cccDNA检测已从基础研究逐渐进入到临床应用.     

再谈乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的检测

HBV共价闭合环状DNA(hepatitis B viruscovalently closed circular DNA,HBV CCCDNA)检测技术的研发以及应用价值的探讨一直是相关领域所关注的热点,虽已积累了大量研究资料,但仍存在不少有待完善的问题.笔者从事HBVeceDNA的基础和临床研究工作多年,取得了一些结果并较为深入地思考了一些问题,现阐述如下.     

乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的检测

目的 检测不同肝脏病变程度的乙型肝炎患者外周血中的HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA),评价其相关的影响因素和临床意义.方法 共观察57例乙型肝炎患者,其中轻度慢性乙型肝炎患者26例,重型乙型肝炎患者31例.患者入院后行PT、肝功能、肝炎病毒血清标志物等常规检测,并进行总HBV DNA和HBV cccDNA检测.Logistic逐步回归分析影响血清HBVcecDNA检出率的相关因素.结果重型乙型肝炎组13份血清标本HBV cccDNA为阳性,轻度慢性乙型肝炎组仅1份血清标本HBV cccDNA为阳性,血清HBV cccDNA的含量为1.25×103～4.88×104拷贝/mL,两组患者血清HBV cccDNA检出率差异有统计学意义(P=0.0014).血清HBV cccDNA检测诊断重型乙型肝炎患者的灵敏度和特异度分别为41.94%和96.15%.Logistic逐步回归分析显示,血清HBV ccvDNA的检出率与PT有关(X<'2>=7.2192,P=0.0072),而与患者的年龄、性别、血清总HBV DNA、TBil和ALT水平无相关性.结论 部分乙型肝炎患者特别是重型肝炎患者外周血中可以检测出HBV cccDNA,血清HBV cccDNA的检出可作为支持重型乙型肝炎诊断的指标之一.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA形成机制的研究进展

乙型肝炎病毒(HBV )慢性感染是我国慢性病毒性肝炎、肝硬化及相关肝癌的主要致病因素,我国77％ 的肝硬化和84％的肝细胞癌(HCC)与之有关[1].抗病毒治疗可明显减缓慢性乙型肝炎(CHB)的疾病进展,使我国近年来 HBV相关肝硬化和肝纤维化的死亡率有所下降,但 HBV相关肝癌的死亡率并未有明显改变[2 ].已有足够...     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA和松弛环状DNA耐药突变检测及比较

目的 建立检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)逆转录酶区(RT)耐药位点的方法,并分析HBV cccDNA与松弛环状DNA(rcDNA)RT区耐药位点及耐药突变率的差异. 方法利用滚环扩增法(RCA)同时扩增20例慢性乙型肝炎患者肝组织中HBVcccDNA和HBV载量为108拷贝/ml血清中的rcDNA,再以该扩增产物为模板,以跨缺口引物扩增HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区;巢式PCR直接扩增同一患者血清中HBV rcDNA RT区.HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区扩增片段经测序后采用Vector NTI Suite8.0及chromaslite201分析其耐药突变位点;采用x2检验比较rcDNA和cccDNA RT区的耐药突变率. 结果以RCA产物为模板用跨缺口引物成功扩增并获得肝组织cccDNA RT区片段,阴性对照组及HBV载量为108拷贝/ml血清rcDNA组均无扩增产物;巢式PCR.直接扩增获得同一患者血清中HBV rcDNART区片段.序列测定结果显示,本组试验中10例有抗病毒史的慢性乙型肝炎患者发生rcDNA RT区耐药者有6例,突变率为60%,1例发生cccDNA RT区突变,突变率为10%,两者比较,P=0.019,差异有统计学意义.10例无抗病毒史的慢性乙型肝炎患者有2例发生rcDNA耐药,耐药突变率为20%,1例发生cccDNA耐药突变,突变率为10%,两者比较,P=0.531,差异无统计学意义.产生耐药突变的患者其cccDNA与rcDNA RT区耐药突变位点均不相同.结论 RCA可用于HBV cccDNA RT区耐药突变位点检测;有抗病毒史的患者的rcDNA与cccDNA RT区耐药突变不同步.在辅助临床治疗中,对HBV cccDNA进行耐药监测比对HBV rcDNA耐药监测更有意义.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立及应用

HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)主要位于受感染的肝细胞核内,微量HBV cccDNA在肝细胞内的持续存在,是导致HBV持续感染、抗病毒药物停用后乙型肝炎复发的主要原因[1].本研究旨在建立一种特异性较强、灵敏度较高、重复性较好的荧光定量PCR方法,真正实现对血清HBVcccDNA的检测.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的扩增与清除动力学

HBV基因组是一种松弛环状的双链DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)分子,其两条链均不闭合,在病毒的复制过程中,病毒DNA进入宿主细胞核,两条链的缺口被补齐,形成超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently dosed circular DNA,cccDNA).cccDNA是HBV在肝内进行复制的原始模板,虽然其含量较少,但对病毒在宿主细胞内感染状态的建立以及维持病毒在细胞内的复制过程具有十分重要的意义.     

应用滚环扩增技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究

目的 应用滚环扩增(RCA)技术检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA),观察该方法的特异性和敏感性.方法 以HBV全基因质粒为模板,经酶切、连接、浓缩、胶回收纯化等步骤,构建和制备HBV cccDNA标准品.抽提7例慢性乙型肝炎患者肝组织总DNA,进行滚环扩增.用HBV cccDNA标准品、3.2 kb线性HBV DNA、健康肝组织总DNA及15例慢性乙型肝炎患者血清总DNA作为对照,验证此方法的特异性.将HBV cccDNA标准品进行系列稀释,了解该方法的敏感性.结果 成功构建了HBV cccDNA,并可用RCA方法进行扩增.RCA方法可从2 mg的慢性乙型肝炎患者肝组织中检测到HBV cccDNA,并可检测低至1×102拷贝/μL的HBV cccDNA.RCA方法不能检测3.2 kb线性HBV DNA,在健康肝组织及15例慢性乙型肝炎患者血清中亦检测不到HBV cccDNA.结论 RCA方法操作较方便,具有很高的特异性和敏感性.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与松弛环状DNA对核苷(酸)类药物耐药变异的比较

目的 了解肝细胞内HBV共价闭合环状DNA( HBV cccDNA)核苷(酸)类药物耐药变异的情况,并比较其与松弛环状DNA(rcDNA)耐药变异的异同.方法 取40例慢性HBV感染肝移植患者的部分肝组织,采用十二烷基硫酸钠-蛋白质沉淀法结合DNA提取试剂盒分离提取肝内的HBV cccDNA和rcDNA.将抽提产物用不降解质粒的ATP依赖DNA酶酶切纯化后,用跨HBV基因组双链缺口并涵盖常见核苷类耐药位点(rt169～rt250)的引物行单轮PCR或套式PCR选择性扩增cccDNA.另用不跨双缺口的引物PCR扩增肝组织内的HBV rcDNA和患者肝移植术前的血清HBV rcDNA.用直接测序法对上述扩增产物进行基因测序并分析核苷(酸)类药物耐药位点的检出情况.结果 40例患者中,31例肝组织内检测到HBV cccDNA,35例肝组织检测到HBV rcDNA,21例肝移植术前血清中检测到HBV rcDNA.测序结果显示,2例肝组织内cccDNA、rcDNA和血清rcDNA均检测到rtM204Ⅰ变异;有2例患者肝内cccDNA、rcDNA分别存在rtM204Ⅰ、rtQ215H变异,而血清rcDNA未检测到相应变异;3例血清中分别存在rtM204V、rtM204V、rtV173L+ rtL180M+rtM204V变异,而肝内cccDNA和rcDNA未检测到相应变异.结论 慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA可出现核苷(酸)类药物耐药变异,且肝组织内的cccDNA、rcDNA耐药变异株与血清中的rcDNA耐药变异株不完全一致.     

乙型肝炎病毒基因YMDD自然变异的检测及意义

近来,国内外有报道HBV基因存在YMDD自然变异,本研究对未经拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD热点变异L528M、M552I/V位点进行检测,并分析其与临床的关系.……     

抗病毒药物对肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的影响

目的 探讨抗病毒药物对肝组织HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的影响.方法 71例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者分别接受48周的拉米夫定-干扰素序贯治疗、单用拉米夫定治疗和24周的干扰素治疗,随访24周.检测治疗前、后肝组织HBV DNA和cccDNA水平;检测治疗前、后及停药24周时的血清HBV DNA和ALT水平.比较C、B基因型HBV感染患者肝组织HBV DNA和cccDNA水平.结果 治疗结束时,序贯治疗、拉米夫定治疗和干扰素治疗组患者肝组织HBV DNA分别为(4.7±1.1)log10、(4.6±1.5)log10和(5.6±1.5)log10,均低于治疗前水平(P＜0.05);cccDNA分别为(3.4±1.3)log10、(3.8±1.1)log10和(5.0±1.5)log10,均低于治疗前水平(P＜0.05).17例患者出现了HBeAg血清学转换,其肝组织cccDNA下降幅度明显大于HBeAg阳性患者(3.0 log10比1.6 log10,P＜0.05).停药24周,18例患者获得持续病毒学应答,其cccDNA基线值明显低于停药后出现病毒反跳患者(P＜0.05).肝组织cccDNA的变化与肝组织HBV DNA的改变正相关(P＜0.05);治疗结束时,肝组织cccDNA水平与血清HBeAg滴度正相关(P＜0.01).C基因型与B基因型HBV感染患者治疗前、后肝组织HBV DNA和cccDNA的变化无统计学意义(P＞0.05).结论 48周的拉米夫定-干扰素序贯治疗和拉米夫定治疗对肝组织cccDNA抑制作用强于24周的干扰素治疗.肝组织cccDNA低水平患者易获得较好的抗病毒疗效.HBV基因型对肝组织cccDNA含量无明显影响.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA在慢性乙型肝炎治疗中的分子生物学研究进展

在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染过程中,共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒复制产生的所有RNA和新病毒颗粒合成的模板,而当前的治疗方法很难彻底清除cccDNA.在cccDNA的产生过程中,由病毒前基因组RNA反转录合成松弛环状(relaxed circular,r c)DNA的细节目前已经比较明确,而对rcDNA转变为cccDNA的过程人们还知之甚少.最近的研究把cccDNA的形成和细胞DNA修复联系起来,并表明此过程是病毒与细胞相互作用的关键环节.本文将综述cccDNA的分子生物学研究进展,分析当前研究中遇到的障碍,并讨论把cccDNA作为治疗慢性乙型肝炎的靶点的前景.     

乙型肝炎病毒总DNA、共价闭合环状DNA和HBsAg在各种慢性乙型肝炎病毒感染者中的定量检测

目的 定量检测慢性乙型肝炎(CHB)、乙型肝炎肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)患者HBV总DNA(tDNA)、HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)和HBsAg,并探讨其特点.方法 荧光定量PCR检测21例CHB、23例LC和25例HCC患者外周血和肝组织标本HBV tDNA、HBVcccDNA,化学发光法定量检测外周血HBsAg.正态数据采用ANOVA分析和t检验,相关性分析采用Pearson检验,非正态数据采用秩和检验.结果 在CHB、LC和HCC患者中,外周血HBVtDNA分别为(5.38±2.08)、(4.96±1.65)和(4.18±0.91)lg拷贝/mL,肝组织HBV tDNA分别为(7.18±1.91)、(6.51±1.87)和(5.87±1.47)lg拷贝/μg,肝组织HBV cccDNA分别为(3.53±2.03)、(2.63±2.13)和(0.58±1.40)lg拷贝/μg,外周血H BsAg分别为(3.30±0.65)、(3.12±0.52)和(2.60±1.03)lg IU/mL,CHB与HCC患者比较,差异均有统计学意义(t=2.446,P=0.013;t=2.562,P=0.014;t=5.799,P＜0.01;t=2.709,P=0.003),LC与HCC患者肝组织HBVcccDNA及HBsAg定量比较,差异有统计学意义(t=-3.894,P＜0.01;t=-2.237,P=0.023).外周血均未检出HBV cccDNA.HBsAg定量与外周血HBV tDNA(r=-0.290,P=0.016)、肝组织HBV tDNA(r=0.372,P=0.002)及肝组织HBV cccDNA(r=0.378,P=0.001)均有关.结论 HBV tDNA、HBV cccDNA、HBsAg在CHB、LC、HCC患者呈逐渐降低趋势,HBsAg定量与外周血HBV tDNA、肝组织HBV tDNA及肝组织HBV cccDNA有关.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA荧光定量聚合酶链反应法的建立及应用

乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的合成模板，是HBV持续感染的关键。近期研究表明，cccDNA也是抗病毒治疗结束后乙型肝炎复发的主要原因。本研究旨在建立和应用荧光定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）检测慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA水平。     

54例慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与血清HBsAg定量检测结果分析

目的 检测慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)和血清HBsAg,分析两种定量指标之间及其与血清HBV DNA载量的相关性.方法 应用PSAD消化+滚环扩增+跨缺口实时荧光PCR方法,定量检测54例慢性乙型肝炎患者甲醛固定石蜡包埋肝组织HBV cccDNA水平;用化学发光试剂定量检测患者血清HBsAg.用Pearson检验及直线回归分析方法 对数据进行分析.结果 患者肝组织HBV cccDNA与血清HBsAg定量水平之间呈正相关(r=0.459,P＜0.01),但与血清HBV DNA载量相关性无统计学意义;血清HBsAg定量水平与血清HBV DNA载量呈正相关(r=0.328,P＜ 0.05),与病毒复制效率呈负相关(r=-0.373,P＜0.05).结论 慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA载量与血清HBsAg定量水平相关,结合血清HBVDNA定量检测,可以更全面的反映HBV的复制水平,评价抗病毒疗效.     

乙型肝炎病毒基因型与YMDD变异的关系

目的:了解乙型肝炎病毒(HBV)基因型与YMDD变异之间的关系.方法:多对型特异性引物PCR扩增法对238例经拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者进行HBV基因分型,直接序列分析;采用基因芯片检测YMDD及前C/BCP区变异.结果:238例患者中,检测出B基因型190例(79.8%),C基因型41例(17.2%),BC混合型7例(3.0%);发生YMDD变异44例,变异率为18.5%,其中B基因型33例,变异率为17.4%,C基因型8例,变异率为19.5%,BC混合型3例,变异率为42.4%,C基因型YMDD变异的发生率与B基因型相比,差异无显著性意义(P＞0.05).44例YMDD变异者中,30例同时存在L528M变异,7例联合前C区(nt 1 896)变异,13例联合BCP区(nt 1 762/1 764)双重突变.结论:本地区慢性乙型肝炎患者中,优势基因型为B型和C型,经拉米夫定治疗后YMDD变异的发生率在B型和C型差异无显著性意义,同时伴有L528M及前C/BCP区多重变异.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA套式-实时荧光定量聚合酶链反应的建立

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的套式一实时荧光定量PCR法.方法 根据HBV cccDNA与松环DNA(rcDNA)结构上的差异,设计2对跨缺口的特异引物及1条位于负链缺口下游的特异TaqMan荧光探针.根据Plasmid-SafeTM ATP-Dependent Dnasc(PSAD)对rcDNA与cccDNA作用的不同,对模板DNA进行酶切纯化,降解reDNA,再进行套式PCR扩增,先用外引物和模板进行第一轮常规PCR,再用内引物、荧光探针和第一轮PCR产物进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照标准品,得出待检标本定量值.结果 检测阳性参照标准品.得出该方法灵敏度可达2 lg拷贝/mL.用上述方法检测34份乙型肝炎患者血清HBV DNA阳性标本,25份血清HBVcccDNA阳性,28份外周血单个核细胞HBV cccDNA阳性.27份健康对照者血清HBV DNA阴性标本,6份HBV cccDNA阳性.对5份HBV cccDNA阳性标本扩增产物进行克隆测序,无碱基缺失、突变.与HBV不同基因型序列(A～G)比较,同源性为90.6%～99.1%,其中,与B、C基因型同源性为95.3%～99.1%,验证了方法的特异度.结论 套式-实时定量PCR法可检测乙型肝炎患者血清、PBMC中的HBV CCCDNA,且具有敏感、特异性.