肠道病毒性脑膜炎基因诊断的研究

肠道病毒（ＥＶＳ）感染是无菌性脑膜炎和脑炎常见的病因之一，由于其临床表现及脑脊液（ＣＳＦ）检查无特异性，故临床难与其它细菌性或病毒性感染相鉴别。本文用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测了临床诊断的２４例病毒性脑膜炎及２０例其它神经疾病（ＯＮＤ）对照组患者的ＣＳＦ中ＥＶｓ－ＲＮＡ。所用的引物选自ＥＶｓ基因组中高度保守的５＇－非编码区（５＇－ＮＣＲ），这些引物已被证明能够检测出ＥＶｓ广泛的型别。结果在２４例病毒性脑膜炎患者ＣＳＦ中检出ＥＶｓ－ＲＮＡ阳性者７例，而对照组全部阴性。提示经ＲＴ－ＰＣＲ的早期诊断有助于对ＥＶｓ脑膜炎采取早期特异的抗病毒治疗。     

黑龙江省克山病病区内外环境硒水平及人群柯萨奇B组病毒感染现况调查

目的 了解黑龙江省克山病病区内外环境硒水平及柯萨奇B组病毒(CVB)人群感染情况,为采取有针对性的防治措施提供依据.方法 在克山病病区设立病区病例组和病区对照组,在非病区设立非病区对照组,采集血液样品用于检测血硒及CVB IgM抗体,同时采集病区和非病区土壤、粮食用于硒测定;硒的测定采用氢化物发生原子荧光光度法.CVB IgM抗体采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测.结果 病区土壤、玉米、小麦、大豆含硒量[(0.092±0.011)、(0.003±0.001)、(0.005±0.003)、(0.006±0.001)mg/kg]均低于非病区[(0.198±0.016)、(0.012±0.004)、(0.037±0.007)、(0.037±0.008)mg/kg],二者比较差异均有统计学意义(t值分别为17.007、8.551、15.842、12.109,P<0.01).病区病例组血硒[(34.803±13.302)μg/L]低于病区对照组[(41.235 ±13.571)μg/L],二者比较差异有统计学意义(P<0.05);病区病例组、病区对照组、非病区对照组的CVB感染阳性率分别为90.0%(36/40)、68.3%(41/46)、45.8%(22/48),病区和非病区CVB感染的比值比(OR)为3.957,95%可信区间为1.898～8.246;病区病例组和病区对照组CVB感染的OR值为4.171,95%可信区间为1.298～13.404;CVB感染组与未感染组血硒水平比较,差异无统计学意义(t=1.179,P>0.05).结论 黑龙江省克山病病区仍存在低硒及CVB感染情况.     

上海地区2009年上半年手足口病患儿肠道病毒71病毒壳体蛋白VP1基因的检测与亚型分析

目的 了解2009年4月至5月肠道病毒(EV)71在上海地区儿童手足口病(HFMD)中的分子流行病学特点.方法 收集2009年4月至5月在复旦大学附属儿科医院临床诊断为HFMD的95例住院患儿咽拭子标本73份与粪便标本38份,采用TaqMan实时RT-PCR及套式RT-PCR进行EV71病毒壳体蛋白VP1基因检测,并进行基因测序分析.结果 73份咽拭子标本中,EV71阳性6份,检出率为8.2%;38份粪便标本中,EV71阳性24份,检出率为63.2%.28份套式RT-PCR阳性标本基因测序分析结果显示,27株为C4亚型,为绝对优势流行株,另有一株为C2亚型株;1例死亡患儿分离株为C4亚型,其VP1基因序列未见明显变异.结论 EV71是上海地区2009年4月至5月儿童HFMD的重要病原体,C4亚型株占绝对优势地位,同时伴有C2亚型株的流行.     

柯萨奇B1病毒VP1基因DNA免疫的研究

目的：构建柯萨奇B1病毒（CVB1）的DNA疫苗，评价其免疫学性状。方法：将重组质粒pMD18-T-VPI中的CVB1 VP1基因亚克隆至pCEP4载体,构建真核表达系统pCEP4－VP1作为DNA疫苗，经酶切、PCR和测序后鉴定后转染至HeLa细胞，用间接免疫荧光法检测CVB1抗原的体外表达。提纯制备pCEP4－VP1接种BALB／C小鼠，取血清用ELISA法检测抗CVB1IgM和IgG，用^51Cr释放法测定CTL反应。结果：酶切、PCR和测序证明了VP1 DNA疫苗构建正确，转染pCEP4－VP1的HeLa细胞中可见到荧光标记，提示表达了VP1蛋白，接种pCEP4－VP1的小鼠可检测到抗CVB1的IgM的IgM和IgG，并能产生较强的特异性CTL反应。结论：pCEP4-VP1可作为DNA疫苗诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答。     

柯萨奇B组病毒感染与云南省地方性猝死的关系

目的探讨柯萨奇B组病毒(CoxsackievirusB,CVB)感染与云南省地方性猝死的关系。方法根据流行病学现场调查和临床检查资料,在病区设立病例组和内对照组,在非病区设立外对照组。酶联免疫法(ELISA)检测3组人群近期CVB感染情况及CVB阳性患者CVB1～6型的分布。结果CVB非特异性IgM抗体阳性率在内对照组为88.5%,外对照组为29.2%,两组之间差异有统计学意义(χ2=33.975,P<0.01);病区CVB非特异性IgM抗体阳性率在病例组为92.0%,内对照组为88.5%,两组之间差异无统计学意义(χ2=0.248,P>0.05)。CVB阳性患者亚型分布,在病区内以CVB5(53.3%)、CVB6(34.8%)为主,CVB3未检出,CVB1(2.2%)、CVB2(1.1%)、CVB4阳性患者(8.7%)有少量检出;在非病区内以CVB1(42.9%)为主,CVB3、CVB5未检出。结论CVB感染与云南省地方性猝死有一定的关联,CVB感染是云南省地方性猝死的可疑危险因素。     

原位逆转录PCR法检测心肌组织中的柯萨奇B3病毒RNA

目的　探讨柯萨奇B3病毒感染与心肌炎及扩张型心肌病的病原学关系。方法　应用生物素标记的核苷酸直接掺入法 ,建立了原位逆转录PCR反应技术 ,检测心肌炎、扩张型心肌病患者的心肌活检标本及正常心肌的尸检标本中的柯萨奇B3病毒。结果　 16例病理学及临床诊断为心肌炎患者的心肌组织中 ,7例检测到柯萨奇B3病毒RNA ;14例病理学及临床诊断为扩张型心肌病的患者心肌组织中 ,5例检测到柯萨奇B3病毒RNA ;16例正常心肌标本中检测结果均为阴性。结论　部分心肌炎及扩张型心肌病患者心肌组织中存在柯萨奇B3病毒RNA ,提示柯萨奇B3病毒感染与部分心肌炎及扩张型心肌病的发病有关。     

人类偏肺病毒与呼吸道合胞病毒呼吸道感染的临床研究

目的 了解福州地区人类偏肺病毒(HMPV)感染情况,比较HMPV与呼吸道合胞病毒(RSV)引起呼吸道感染的临床特征及流行特点.方法 采集2005年至2007年连续两个冬春季节153份福建省立医院就诊呼吸道感染患者痰标本或咽拭子标本,RT-PCR和套式RT-PCR分别检测RSV和HMPV,部分阳性PCR产物测序,DNAMAN软件分析;结合临床资料,比较两种病毒所引起的呼吸道感染临床症状、体征和流行特点.结果 153份鼻咽分泌物标本中,32份HMPV阳性,阳性率为20.9%;26份RSV阳性,阳性率为17.0%,8份HMPV和RSV均阳性.随机抽取3份标本,HMPV核苷酸序列一致,登载NCBI基因库(序列号DQ887758),基因进化树分析为单一基因型,属A基因型,但发生部分变异.2005年至2006年冬春HMPV阳性26份,阳性率为26.7%,2006年至2007年冬春HMPV阳性6份,阳性率为10.7%,而RSV检出情况与HMPV相反.儿童RSV感染平均年龄为(2.65±2.65)岁,HMPV为(4.58±3.35)岁.两种病毒引起呼吸道感染症状均以咳嗽、咽痛,发热为主.结论 HMPV与RSV均是福州地区冬春季节呼吸道病毒感染的主要病原体,两者可合并感染;HMPV主要感染年龄较大儿童,HMPV与RSV的临床特征相似.本研究期间福州地区发现的HMPV为单一基因型.     

山东省部分地区肠道病毒71型的RT-PCR检测及基因特征分析

目的采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测2008年山东省部分地区手足口病（HFMD）患者肠道病毒71型（EV71）,对毒株进行诊断及基因特征初步分析。方法以肠道病毒特异引物对EV71进行RT-PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性标本,纯化后与pGEM-T载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,筛选后测序,所得序列与我国阜阳、深圳、台湾株及美国EV71标准流行株的核苷酸序列在线进行BLAST比对,分析其同源性。结果42份标本中检出EV71 33例（78.57%）,所得序列经种系进化分析,与阜阳2008年HFMD暴发分离株同源性为98.7%99.1%,与深圳1998年HFMD散发分离的EV71毒株同源性为93.4%93.8%,与台湾1998年HFMD病例分离毒株同源性为91.2%91.6%,与美国EV71毒株同源性为79.2%79.7%。有9株EV71的563位苏氨酸（T）替代了EU703813的异亮氨酸（I）。结论EV71 C4亚型是2008年山东省部分地区HFMD暴发流行的病原,同源性分析表明山东省部分地区EV71分离株与阜阳、深圳及台湾地区分离株有较高的同源性,提示该病毒在中国大陆有较广泛的传播。     

糖尿病患者人巨细胞病毒、柯萨奇B组病毒和胰岛细胞抗体、谷氨酸脱羧酶抗体及空腹血糖水平的变化及其临床意义

目的 探讨人巨细胞病毒(HCMV)、柯萨奇B组病毒(CVB)及ICA、GADAb、FPG检测多因素与糖尿病的关系. 方法 选取我院2011～2013年住院或门诊糖尿病患者100例,其中,T1DM(T1DM组)、T2DM(T2DM组)患者各50例.另选取健康对照(NC组)者50名.检测各组ICA、GADAb、人巨细胞病毒lgM抗体(HCMV-lgM)、人巨细胞病毒IgG抗体(HCMV-IgG)、柯萨奇B组病毒IgM抗体(CVB-IgM)及FPG水平. 结果 抗HCMV-IgM、抗HCMV-IgG、抗CVB-IgM、ICA、GADA阳性例数(阳性率)T1DM组分别为16(32％)、36(72％)、22 (44％)、29(58％)、13(26％),T2DM组分别为3(6％)、21(42％)、4(8％)、12(24％)、1(2％),NC组分别为1(2％)、11(22％)、1(2％)、1(2％)、0(0％)(P＜0.05).与NC组比较,T2DM组抗HCMV-IgG、ICA抗体检测阳性结果差异有统计学意义(P＜0.05).3组FPG水平比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 联合检测HCMV、CVB抗体及ICA、GAD-Ab、FPG对糖尿病患者的诊疗具有重要价值.     

一起由星状病毒1型引起的新生儿腹泻暴发的病原确证

目的 对一起新生儿急性胃肠炎暴发事件进行病原确证.方法 2008年12月至2009年2月,内蒙古自治区某妇幼医院新生儿室发生腹泻流行,高峰期采集38例患儿的45份粪标本,ELISA法检测轮状病毒、腺病毒和星状病毒病原,RT-PCR法检测星状病毒核酸,其中13份星状病毒核酸阳性标本进行测序分析和进化树分析,4份星状病毒及病毒核酸均阳性的标本进行免疫电子显微镜观察.结果 45份粪标本中,轮状病毒、腺病毒病原检测均阴性.30份标本ELISA检测星状病毒病原阳性,阳性率为66.7%;31份标本星状病毒核酸阳性,阳性率为68.9%.采用星状病毒分型引物进行分型,均为星状病毒1型.选择13株与GenBank中星状病毒1型参考株进行比较,其核苷酸序列同源性为90.9%～96.3%.13株星状病毒1型株彼此间核苷酸序列同源性为94.7%～100.0%.随机选择的4份阳性标本,免疫电子显微镜下2份有大量星状病毒颗粒.结论 此起新生儿腹泻暴发由星状病毒1型引起.     

成人手足口病四例患者肠道病毒71型的检测及核苷酸序列分析

目的 了解成人手足口病的病原体,并分析肠道病毒71型(EV71)核苷酸序列特征.方法 RT-PCR技术对4例成人手足口病患者标本进行肠道病毒基因检测,并测定EV71核苷酸序列,所得序列通过BLAST程序作EV71序列的进一步确认,与基因库中不同基因型EV71核苷酸序列进行比对分析、同源性分析,并构建种系进化树.结果 4例患者肠道病毒通用引物和EV71特异性引物RT-PCR检测均阳性.经BLAST分析,测序所得4条核苷酸序列(分别命名为GZl9610、GZ99310、GZ99355和GZ46477)与EV71毒株序列同源.序列分析表明,4条核苷酸序列之间的同源性为96.O%～99.1%,与2008年初我国安徽省阜阳市暴发的手足口病疫情所分离的EV71毒株同源性最高.EV71序列遗传进化分析确定其均为EV71基因亚型C4,与阜阳、深圳、重庆、上海地区及2004年我国台湾地区流行毒株基因型一致,且距离最近.结论 成人也可感染EV71引起手足口病,与我国现在及既往流行病毒株相比,此次4例成人手足几病患者感染的EV71未发生大的变异;应加强对成人手足口病患者的隔离治疗,以免其传播病毒引起疾病更大的流行.     

Toll样受体4在慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞中的表达及意义

目的了解慢性乙型肝炎、肝硬化、重型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）中Toll样受体4（TLR4）的作用。方法采用流式细胞术及反转录-PCR方法分别检测37例慢性乙型肝炎，28例肝硬化，31例慢性重型肝炎患者及27例健康对照者PBMCTLR4蛋白及mRNA的表达；同时检测患者肝功能、凝血酶原活动度（PTA）、血常规及HBVDNA滴度。结果各实验组TLR4蛋白及mRNA的表达均明显高于健康对照组（P〈0．05）；TLR4蛋白的表达水平与TLR4mRNA的表达量显著正相关（r=0．897，P〈0．01），且与患者的ALT、AST、TBil及中性粒细胞百分比之间呈正相关性（r值分别为0．475、0．558、0．924、0．443），而与Alb、PTA及HBVDNA之间呈负相关（r值分别为-0．927、-0．902、-0．272）。结论慢性HBV感染患者外周血TLR4蛋白及mRNA表达的增高与患者的肝脏损害密切相关。     

腺苷酸环化酶相关蛋白2在肝癌组织中的表达及其意义

有关腺苷酸环化酶相关蛋白(adenylate cyclase-associated protein,CAP)2在肝癌中的生物学作用机制尚不明确.本研究应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学技术检测CAP2在人正常肝脏、肝硬化和肝癌组织中的表达,探讨CAP2在肝癌发生发展过程中的作用.     

睡眠剥夺对大鼠心脏的影响及其致心律失常机制研究

目的：以Sprague-Dawley大鼠为研究对象，观察经过1d、3d、5d及7d睡眠剥夺（SleepDeprivation，SD）大鼠心电图及其心室肌组织Kv2．1钾离子通道水平，探索SD致心律失常的发生机制。方法：以改良多平台睡眠剥夺法（MMPM）建立睡眠剥夺模型，设笼养对照组，大平台对照组，睡眠剥夺1d、3d、5d、7d组，实时PCR定量监测各组大鼠心肌组织Kv2．1钾离子通道基因mRNA水平随SD时间变化趋势。结果：SD后大鼠心电图改变以心律失常为主，心肌组织Kv2．1钾离子通道的水平随SD时间的延长持续下调（笼养对照组，大平台对照组，睡眠剥夺1d，3d，5d．7d组的2^-△△ct值依次为1，0．84，0．60，0．35，0．1，0．06，各睡眠剥夺组的较两对照组显著下降（P〈0．05）。结论：SD可致大鼠发生心律失常，心肌组织Kv2．1钾离子通道水平的下调可能是SD致心律失常的机制之一。     

染料法实时荧光聚合酶链反应检测人外周血αβT淋巴细胞克隆的条件优化及初步应用

目的 探讨实时荧光PCR检测人外周血αβT淋巴细胞克隆性扩增的反应条件及在监测慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者外周血克隆特异性T淋巴细胞上的初步应用.方法 染料法(SYBR Green Ⅰ)实时荧光PCR对6例健康献血者外周血单个核细胞(PBMC)来源的T淋巴细胞受体β链可变区(TCRBV)基因进行扩增,分别就退火温度、引物浓度、循环数等进行比较研究.优化后PCR检测12例慢乙肝患者PBMC来源的TCRBV的24个基因家族,作PCR产物的熔解曲线峰形图,并分析T淋巴细胞克隆性扩增情况.结果 染料法实时荧光PCR检测 TCRBV基因家族的最佳退火温度为60.6℃,引物终浓度为0.5 μmol/L,循环数为40个,且熔解曲线分析起始温度80℃优于75℃.PCR产物熔解曲线峰形图上发现,慢乙肝患者某些TCRBV基因家族表现为单峰,测序结果表明其为单克隆PCR产物.结论 本研究优化了染料法实时荧光PCR检测TCRBV基因家族方法,熔解曲线峰形图可用于检测人外周血T淋巴细胞的克隆性扩增,并可能用于检测慢乙肝患者外周血克隆特异性T淋巴细胞.