人参AGO1基因的克隆及序列分析

目的: 从人参叶片中克隆Argonaute 1(PgAGO1)的全长基因,并利用生物信息学方法进行分析。 方法: 根据人参EST序列设计特异性引物,采用RACE方法克隆PgAGO1的cDNA全长,并对PgAGO1蛋白的结构进行预测、氨基酸序列多重比对以及构建系统进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测PgAGO1基因在人参不同组织根、茎、叶、花和愈伤中表达水平。 结果: 克隆的PgAGO1全长cDNA为3 776 bp,其中包括5'UTR 204 bp,3'UTR 254 bp,基因内部包含完整的开放阅读框,可编码1 105个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为122.22 kDa,理论等电点pI 9.71;实时定量PCR检测结果表明PgAGO1基因在人参花中的表达量最高,在根中最低。 结论: 从人参叶片中克隆得到PgAGO1的全长cDNA,为进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础。     

阳春砂二酮辅酶A合成酶的基因克隆及序列分析

目的 对阳春砂姜黄素生物合成途径的关键酶二酮辅酶A合成酶（diketide CoA synthase,DCS）基因的编码cDNA序列进行克隆,为研究阳春砂姜黄素生物合成与基因调控奠定基础。方法 结合阳春砂的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR方法克隆阳春砂DCS基因的编码区cDNA。结果 PCR扩增了一个长1 170 bp的基因片段,该片段编码由389个氨基酸组成的DCS。同源性比对结果显示基因编码蛋白与姜黄的DCS具有氨基酸一致性达96%,与水仙等植物的查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）氨基酸一致性达66%～69%。进化树分析结果显示,与姜黄Curcumae Longae具有较近的亲缘关系。结论 首次从阳春砂中克隆DCS基因获得其编码区序列,为分析基因表达特性及其在姜黄素生物合成中的功能奠定基础。     

金龙胆草3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 对金龙胆草Conyza blinii 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因进行克隆及序列分析,并检测其是否可作为金龙胆草的内参基因。方法 采用RACE技术克隆金龙胆草GAPDH基因的cDNA全长序列,利用DNAMAN、BLAST、MEGA等工具对序列进行生物信息学分析,并以其为内参进行半定量RT-PCR。结果 克隆获得了1个全长1 418 bp的GAPDH基因,完整开放阅读框1 020 bp,编码340个氨基酸,命名为GLGAPDH。序列比对结果显示,金龙胆草的GAPDH基因与紫背天葵的同源序列相似性达到96%,与薇甘菊的同源序列相似性为93%。通过系统进化树分析发现其与紫背天葵的亲缘关系最近。半定量RT-PCR分析GLGAPDH作为内参基因在不同组织中表达稳定,扩增效果良好,重现性强。结论 首次克隆了金龙胆草GAPDH基因的全长cDNA序列,并通过半定量实验验证了其可作为内参基因用于基因表达量分析,为金龙胆草次生代谢物合成过程中关键酶表达分析及调控机制的研究奠定了基础。     

滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆滇重楼鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因(PpSQS),对该基因进行序列分析及原核表达。 方法: 采用同源克隆和RACE技术获得PpSQS的cDNA,并对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-PpSQS,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达。 结果: PpSQS基因cDNA全长1 498 bp,包含1个1 212 bp的开放阅读框(ORF),可编码403个氨基酸;PpSQS理论标准分子质量为46.36 kDa,等电点为pI 6.83;SDS-PAGE分析表明,经1 mmol·L^-1 IPTG诱导后,重组PpSQS蛋白在大肠杆菌中获得表达。 结论: 首次获得了滇重楼PpSQS基因cDNA全长序列,该基因编码产物具有植物SQS同源蛋白的典型特征,实现重组PpSQS在大肠杆菌中的表达。     

白木香乙酰乙酰基辅酶A硫解酶基因(AsAACT)的克隆与表达分析

目的：对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.）Gilg乙酰辅酶A酰基转移酶（acetyl-CoA C-acetyl transferase,AACT）基因AsAACT全长进行克隆并展开生物信息学分析和表达分析,为解析沉香萜类次生代谢产物的生物合成机制奠定基础。方法：根据获得的白木香转录组数据库AACT部分转录本序列设计引物,采用RT-PCR及RACE技术,以白木香茎cDNA为模板,克隆获得AsAACT全长,进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR,以GADPH为内参,分析白木香愈伤组织受不同伤害胁迫AsAACT的表达模式。结果：AsAACT开放阅读框（opening reading frame,ORF）为1 236 bp,编码411个氨基酸残基,酶命名为AsAACT;白木香愈伤受物理伤害（切割）后表达量没有明显变化,但受化学伤害（MeJA）后4 h表达量升高了5.5倍,说明该基因对MeJA诱导的化学伤害较敏感,且能够在早期响应伤害胁迫。结论：通过AsAACT基因的全长cDNA克隆和表达特性分析,为后续深入研究其在沉香倍半萜合成途径的功能奠定基础。     

金银花类药用植物IspE和IspH基因克隆和生物信息学分析

目的:克隆金银花类药用植物4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase,IspE)和4-羟基-3-甲基-2-邻苯基二磷酸还原酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase,IspH)基因,并对其基因序列、蛋白特性和转录活性进行分析、比较.方法:从忍冬Lonicera japonica转录组测序结果中分析获得了IspE,IspH基因.分别以忍冬、红白忍冬L.japonica var.chinensis、红腺忍冬L.hypoglauca和水忍冬L.dasystyla新鲜花蕾为材料,利用RT-PCR技术克隆获得了4种金银花类药用植物IspE和IspH基因的全长cDNA.运用生物信息学分析软件,预测编码蛋白的结构和功能,并通过RT-PCR检测IspE和IspH在忍冬、红白忍冬、红腺忍冬、水忍冬花蕾中的转录情况.结果:金银花类药用植物IspE基因含有1个完整的开放阅读框,长度为1 221 bp,编码406个氨基酸;IspH含有一个完整的开放阅读框,长度为1 380 bp,编码459个氨基酸.IspE和IspH均为非分泌蛋白,均定位于叶绿体中.RT-PCR分析结果表明在忍冬、红腺忍冬和水忍冬的花蕾中IspE,IspH基因的转录水平没有显著差异,但红白忍冬花蕾中IspE,IspH基因的转录水平均显著高于忍冬.结论:克隆获得忍冬、红白忍冬、红腺忍冬和水忍冬中IspE,IspH基因,并证实了其在不同金银花类药用植物中的表达,为进一步研究IspE,IspH基因对萜类化合物生物合成和花香气以及颜色的影响奠定了基础.     

芍药肌动蛋白基因组DNA的克隆及分析

目的 克隆芍药Paeonia lactiflora肌动蛋白（Actin）基因组DNA序列并解析基因结构,分析Actin基因在芍药不同组织中的表达情况。方法 根据本课题组报道的芍药Actin基因cDNA序列（JX310002）设计特异性引物,以芍药栽培品种“桃花飞雪”总DNA为模板,用KOD-Plus高保真DNA聚合酶扩增芍药Actin基因组基因,克隆PCR产物并进行测序。应用生物信息学软件预测芍药Actin基因的外显子及内含子,基于Blastn程序分析芍药Actin基因在核苷酸水平上的同源性,应用MEGA5.0软件构建分子系统进化树;设计跨越内含子的半定量RT-PCR扩增引物,分析芍药Actin基因在芍药根、茎、叶、花中的表达情况。结果 测序结果表明芍药Actin基因组DNA序列全长1 405 bp,含4个外显子和3个内含子,3个内含子中共6个剪接位点均遵循高等真核生物5’端供位GU与3’端受位AG模式;共编码377个氨基酸,GenBank登录号为KF363830。设计了一对半定量RT-PCR扩增引物,其中上游引物跨越了芍药Actin基因的第1个内含子,可有效防止由DNA 污染而造成RT-PCR扩增的假阳性;半定量RT-PCR分析结果表明Actin基因在芍药根、茎、叶、花等不同组织中的表达量保持恒定。结论 首次克隆了芍药Actin基因组DNA序列并明确了其基因结构,半定量RT-PCR分析结果表明Actin基因可以作为芍药功能基因表达分析的内标基因。     

金荞麦花青素合酶基因的克隆及其表达与花青素量的相关性研究

目的 获取金荞麦花青素合成途径关键酶花青素合成酶（anthocyanins synthase,ANS）基因的全长序列,并进行序列分析;对花期金荞麦ANS基因在各组织中表达水平与花青素量的相关性进行分析。方法 利用同源克隆技术获得ANS基因cDNA序列;采用半定量RT-PCR对ANS表达量进行分析;采用分光光度法测量花青素量。结果 金荞麦ANS基因cDNA包含一个1 077 bp的ORF,编码358个氨基酸,命名为FdANS。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白与其他植物ANS蛋白氨基酸序列同源率较高。FdANS在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明,其表达量花＞叶＞茎＞根,花青素量为花＞叶＞茎＞根。结论 在金荞麦中首次获得ANS基因的cDNA序列,编码蛋白具有ANS同源蛋白的典型特征。FdANS基因在金荞麦根、茎、叶和花中的表达量与花青素量具有相关性。     

铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析

目的: 揭示铁皮石斛热激蛋白HSP70基因冷胁迫表达,为耐低温品系选育提供分子生物学基础。 方法: 根据已获得的HSP70基因片段序列,采用RACE方法从铁皮石斛中克隆到HSP70基因全长cDNA序列。预测其编码蛋白的结构与功能,并运用实时定量PCR进行冷胁迫下表达分析。 结果: 核苷酸序列分析表明该基因全长2 296 bp,包含一完整的1 944 bp的开放阅读框,编码647个氨基酸。氨基酸序列具有典型的HSP70特征并且与其他植物的HSP70有很高的同源性。冷胁迫表达分析说明该基因确实能被低温诱导表达。 结论: 首次克隆获得受低温诱导表达的铁皮石斛HSP70基因,为进一步研究铁皮石斛健康栽培与抗寒品系的选育奠定基础。     

金银花组蛋白甲基转移酶基因生物信息学及表达分析

该研究从金银花转录组数据库中获得23个组蛋白甲基转移酶基因,分别对其核苷酸特性、蛋白理化性质、亚细胞定位、二级结构及保守域、系统进化和基因表达情况进行分析。其中系统进化分析结果表明,23个金银花组蛋白甲基转移酶可以分为2类:赖氨酸甲基转移酶和精氨酸甲基转移酶。基因表达分析结果表明金银花组蛋白甲基转移酶基因具有明显的种间表达偏好性和器官表达偏好性,即23个组蛋白甲基转移酶基因在金银花花蕾中表达量均高于红金银花,但在金银花叶中表达量均低于红金银花,并获得8个花蕾特异性表达基因,为进一步了解金银花类药用植物中组蛋白甲基转移酶的功能以及活性成分表观调控提供依据。     

全基因组水平金银花TCP基因家族的鉴定及表达模式分析

目的 对金银花Lonicera japonica TCP（LjTCP）基因家族进行鉴定分析,以期为进一步研究LjTCPs的功能机制奠定基础。方法 以金银花基因组数据为基础,通过生物信息学系统分析TCP基因家族在染色体上的分布、系统进化、基因结构、启动子元件及其表达模式。结果 共鉴定出17个LjTCPs,其中16个LjTCPs分布在9条染色体上,LjTCP17未定位到染色体上,基于系统进化树和多重序列比对,LjTCP基因家族可以分为PCF、CIN和CYC/TB1 3个亚家族,分别包含9、6、2个LjTCPs。基因组内共线性分析表明,全基因组复制和片段性复制在LjTCP基因家族进化中发挥了重要作用。LjTCP基因家族启动子包含许多与植物生长发育、激素响应,以及非生物和生物胁迫相关的调控元件。表达模式分析表明,LjTCP基因在金银花花发育初期表达量较高,随着发育进程表达量呈现下降趋势,并且LjTCP05、LjTCP13、LjTCP14、LjTCP16和LjTCP17基因在花青素含量不同的品种中表达量存在差异。对6个具有低温响应元件的LjTCPs在冷胁迫下的基因表达研究表明,大部分基因在冷处理后基因表达呈现上升趋势。结论 金银花TCP基因家族包含17个成员,各成员的分子特征和表达模式存在差异。     

忍冬种质资源遗传多样性的AFLP分析

目的:研究国内主产区忍冬种质资源的遗传多样性,探讨它们之间的亲缘关系,并为新品种选育提供参考。方法:选用6对引物组合对13个忍冬种质进行AFLP分析,利用DPS V3.01软件计算各品种的遗传距离,按UPGMA法进行聚类分析。结果:共获得435条扩增带,其中191条具有多态性,平均多态检出率为43.9%。聚类结果表明,同一道地产区的栽培品种亲缘关系较近,山东种质基于AFLP标记的分类结果与形态特征基本一致。结论:AFLP分子标记揭示出忍冬种内存在丰富的遗传多样性,为忍冬种质资源的合理利用及品种选育提供了分子水平的理论依据。     

黄连软化与切制工艺优选

目的:优化黄连的软化与切制工艺.方法:以盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量为指标,采用单因素试验和正交试验优选黄连的软化和切制工艺,HPLC测定指标成分含量.结果:黄连的最佳软化方法为淋法,一般在室温下,每100 kg药材用60 L水软化48 h.黄连的最佳切制工艺为切成1～2 mm的顶头片.结论:优选的软化和切制工艺切实可行,可推广使用.     

基于matK基因的几种重要重楼属植物遗传关系分析

目的:利用叶绿体matK基因序列探讨重楼属植物的10个样品系统发育及分子鉴定,为重楼的保护和合理利用提基本供理论依据。方法:从分布于湖南省、云南省和吉林省的10个重要的重楼类群样品中提取总DNA,经扩增纯化后,利用PCR产物直接测序。结果:测定了10个重要的重楼类群样品的matK基因序列,序列长度为1 039 bp,比较了该基因的差异,构建了基于matK基因序列的遗传进化树。结论:这10个重楼属植物样品可以划分为4个组群,matK基因序列的结果不支持长药隔重楼、滇重楼、短梗重楼、七叶一枝花成为独立的变种,建议作为多叶重楼的变型处理。     

接骨草HMGR基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆接骨草Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用RT-PCR方法获得HMGR基因c DNA序列,并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三级结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测HMGR基因在接骨草的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因c DNA全长为1 626 bp,编码593个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在接骨草的花和地上茎中表达较高,其他器官表达相对较低。结论首次从接骨草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在接骨草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

红花bZIP20转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建

目的克隆红花花瓣中b ZIP20(Basic region/leucine zipper motif)基因,研究其在不同组织中的表达量并构建其植物表达载体。方法根据红花转录组测序结果挑选b ZIP基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增b ZIP20基因开放阅读框(ORF)片段,利用RT-PCR法分析在红花不同组织以及尖孢镰刀菌侵染后红花根部b ZIP20基因的表达量,同时构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。结果 b ZIP20基因ORF长981 bp,编码326个氨基酸(Gen Bank登录号为KT692605)。红花b ZIP20与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其与芝麻、野茶树的氨基酸序列相似性高达85.41%和83.99%。实时荧光定量PCR分析表明,b ZIP20基因在不同组织中的表达水平具有显著差异,在花中呈现高表达,而在其他组织中低表达。接种尖孢镰刀菌的红花根部组织中b ZIP20基因的表达显著上调。结论成功地对b ZIP20基因进行克隆及表达分析,并构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。     

金荞麦苯丙氨酸解氨酶基因FdPAL 的克隆及原核表达

目的:克隆金荞麦苯丙氨酸解氨酶(FdPAL)基因DNA和全长cDNA序列,对该基因进行序列分析,原核表达及其活性相关研究.方法:采用同源克隆和RT-PCR技术扩增苯丙氨酸解氨酶基因的DNA序列和全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析;构建PAL原核表达载体pET30b(+)-FdPAL,在大肠杆菌Escherich coli BL21( DE3)中进行诱导表达,使用分光光度计法定量测定其酶活,使用薄层色谱法鉴定其催化活性.结果:金养麦PAL基因DNA序列全长2 583 bp,由2个外显子,1个内含子构成(命名为FdPAL,GenBank登录号为HM628904);cDNA序列包含1个2 169 bp的开放阅读框(ORF),编码722个氨基酸,理论相对标准分子质量78.31 kDa,等电点5.94.SDS-PAGE分析表明,诱导后的新生蛋白质相对标准分子质量为75.37 kDa;诱导4h后,表达产物的苯丙氨酸解氨酶比活力最高,达到4 386 nmol·g-1·min-;薄层色谱结果表明,诱导表达产物具有催化苯丙氨酸转化为肉桂酸的活性.结论:首次从金荞麦中克隆到PAL基因,该基因具有植物PAL同源基因的典型特征;重组的金荞麦PAL基因表达载体[pET30b(+)-FdPAL]能有效地在大肠杆菌Ecoli BL21 (DE3)中表达,并形成具有一定催化功能的酶.     

断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究

目的: 研究断肠草与金银花类药材水提液的DNA分子鉴别方法。方法: 采集不同产地的断肠草药材13份、金银花32份、山银花21份和水银花5份,所有样品提取总DNA,并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取。通过对断肠草psbA-trnH片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的中金银花类药材基原植物psbA-trnH序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。结果: 通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现断肠草可扩增出97 bp片段,而金银花类药材则不能扩增出条带。结论: 通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别。