加减大柴胡汤对胆固醇结石湿热证小鼠的作用机制

目的 研究加减大柴胡汤对胆固醇结石（CS）湿热证小鼠胆固醇-胆汁酸代谢相关因子的影响，探讨其作用机制。方法 将48只SPF级小鼠随机分为空白组、模型组、大柴胡汤组和熊去氧胆酸组，每组12只；空白组作为对照，其他3组采用“内湿+外湿+高胆固醇致石饲料”的模式造模12周，建立CS湿热证小鼠模型。造模成功后大柴胡汤组和熊去氧胆酸组分别给予加减大柴胡汤和熊去氧胆酸灌胃，模型组和空白组给予等量的生理盐水灌胃，连续干预4周。观察各组小鼠的结石及一般情况，进行旷场实验，NPP底物-AMP缓冲液法、GCNA底物法与钒盐酸氧化法分别检测血清碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷 氨酰基转移酶（GGT）、总胆红素（TBIL）含量，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测胆汁中总胆固醇（TC）、总胆汁酸（TBA）含量；实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测小鼠回肠组织中法尼酯衍生物X受体（FXR）、成纤维细胞生长因子15（FGF15）和肝脏组织中成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）、细胞外信号调节激酶（ERK）1/2、c-Jun氨基末端激酶（JNK） mRNA及蛋白表达水平。结果 与空白组比较，模型组小鼠胆囊结石状况及湿热证候表现明显，胆汁TC增多、TBA减少（P<0.01），肝功能指标（ALP、GGT、TBIL）均显著升高（P<0.01），肝脏组织明显的脂肪样变性，回肠结构完整性被破坏，回肠FXR、FGF15与肝脏FGFR4、ERK1/2、JNK mRNA及蛋白表达均显著升高（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，大柴胡汤组小鼠胆囊结石状况、肝脏和回肠组织病理形态以及湿热证候表现改善明显；大柴胡汤组和熊去氧胆酸组小鼠胆汁内TC含量均显著降低（P<0.01）、TBA含量均显著增高（P<0.01），血清ALP、GGT、TBIL含量均显著降低（P<0.01）。与熊去氧胆酸组比较，大柴胡汤组血清肝功能指标和胆汁成分改善更显著（P<0.01）。与模型组比较，两用药组小鼠FXR、FGF15、FGFR4、ERK1/2、JNK mRNA和蛋白表达均呈下调趋势，其中大柴胡汤组小鼠回肠组织FXR、FGF15及肝脏组织FGFR4、ERK1/2、JNK mRNA相对表达量均显著降低（P<0.05，P<0.01）；大柴胡汤组小鼠回肠FXR蛋白表达显著下调（P<0.01）、肝脏p-JNK蛋白表达明显下调（P<0.05）。结论 加减大柴胡汤可通过调节FXR/FGF15/FGFR4通路相关因子的表达，调控胆固醇-胆汁酸代谢，发挥清热利湿、利胆消石之效。     

交泰丸不同配比组方降糖作用及相关机制探讨

目的:研究交泰丸中黄连、肉桂不同配伍比例(10∶1,10∶3,10∶6)对db/db小鼠的降糖作用及其相关机制。方法:12周龄db/db糖尿病小鼠随机分为黄连-肉桂10∶1组,10∶3组,10∶6组(相当于生药8.4,10,12.3 g·kg-1),阳性药物组(二甲双胍,0.25 g·kg-1),模型组,同月龄db/m小鼠作为正常。正常组和模型组以生理盐水灌胃,阳性药物组以二甲双胍混悬液灌胃,不同配伍比例交泰丸以相应中药水煎剂灌胃,每天1次。5周后,观察小鼠饮水量、进食量、体重的变化,检测空腹血糖(FBG),并进行腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)和胰岛素耐量实验(IPITT);胰岛素免疫组化染色以及电子显微镜观察胰岛β细胞形态及超微结构的变化;蛋白质免疫印迹法(Western blot)分析肝脏、腹部脂肪与肌肉组织中的AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)与磷酸化AMPK(p-AMPK)的表达,以及脂肪和肌肉组织中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达的变化。结果:与正常组比较,模型小鼠体重、饮水量、进食量增加(P0.01),FBG显著升高(P0.01),糖耐量与胰岛素耐量各时间点血糖显著升高(P0.01),胰岛β细胞数量及细胞内分泌颗粒数量减少,肝脏、脂肪和肌肉组织中p-AMPK表达降低(P0.05),脂肪和肌肉组织中GLUT4表达降低(P0.01,P0.05);与模型组比较,交泰丸3个不同配比组FBG均明显降低(P0.05),IPGTT和IPITT明显改善,胰岛β细胞数量和分泌颗粒较模型组明显增多,其中以黄连-肉桂10∶1组方的作用最为明显;交泰丸10∶1组能明显增加肝脏、脂肪和肌肉中的p-AMPK水平(P0.05),增加脂肪和肌肉组织中GLUT4的表达(P0.01,P0.05)。结论:黄连-肉桂10∶1,10∶3,10∶6不同配比的交泰丸对db/db小鼠均具有一定降血糖作用,但以10∶1比例效果最好,其作用机制与激活AMPK,增加GLUT4的表达有关。     

通心络超微粉联合津力达颗粒对糖尿病肾病大鼠Akt/mTOR信号转导通路的影响

目的:探讨通心络超微粉联合津力达颗粒对糖尿病肾病(DN)大鼠蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号转导通路的影响。方法:将SD大鼠80只大鼠分为正常组,模型组,厄贝沙坦组(25 mg·kg~(-1)·d~(-1)),通心络超微粉组(0.8 g·kg~(-1)·d~(-1)),津力达颗粒组(1.5 g·kg~(-1)·d~(-1)),通心络超微粉加津力达颗粒组(0.8+1.5 g·kg~(-1)·d~(-1)),共6组;尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病(DM)动物模型;采用免疫组化SP法测定肾组织中的血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达;采用Western blot检测Akt/m TOR信号转导通路中Akt,m TOR蛋白及相应磷酸化蛋白p-Akt与p-m TOR的表达水平。结果:与正常组比较,模型组中VEGF蛋白的表达升高;各给药组中VEGF蛋白的表达与模型组比较均有不同程度降低,其中通心络超微粉加津力达颗粒组更接近于正常组;各组Akt及其下游分子m TOR的总蛋白表达水平无统计学差异,与正常组比较,模型组中p-Akt与p-m TOR蛋白的表达明显升高(P0.01),与模型组比较,各给药组则显著降低(P0.01)。结论:通心络超微粉联合津力达颗粒可抑制DN大鼠Akt/m TOR信号转导通路的活化,并致相关蛋白VEGF表达水平的降低。     

秦苓液对尿酸性肾病大鼠肾组织AMPK/iNOS信号途径的影响

目的观察秦苓液对尿酸性肾病大鼠肾组织AMPK/iNOS信号途径的影响，探讨其对尿酸性肾病肾脏损伤的保护机制。方法采用腺嘌呤灌胃配合酵母饲料喂养的方法制备高尿酸肾病大鼠模型，将成模大鼠随机分为模型组，别嘌呤醇组［23.33 mg/（kg·d）］，秦苓液大、中、小剂量组［剂量分别为：36.4、18.2、9.1 g/（kg·d）］，每组12只，予对应药物干预。6周和8周时处死各组1/2大鼠，取肾脏组织。RT-PCR检测AMPKα1、iNOS mRNA表达水平，Western Blot检测AMPKα1、p-AMPKα1、iNOS蛋白表达水平。结果与正常组比较，6周及8周模型组AMPKα1 mRNA和蛋白表达、p-AMPKα1蛋白表达降低，iNOS mRNA及蛋白表达升高（P<0.01， P<0.05）。与模型组比较，6周时秦苓液各组AMPKα1 mRNA表达升高，p-AMPK蛋白表达升高，iNOS蛋白表达降低，秦苓液大、小剂量组AMPKα1 蛋白表达升高（P<0.01， P<0.05）；8周时秦苓液小剂量组AMPKα1 mRNA表达升高，中、小剂量组AMPKα1、p-AMPKα1蛋白表达升高，iNOS mRNA及蛋白表达降低（P<0.01， P<0.05）。结论秦苓液可能通过调节AMPK/iNOS信号途径改善代谢，抑制炎性损伤，减轻尿酸性肾病大鼠的肾脏损伤。     

虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr~(-/-)小鼠非酒精性脂肪肝炎的作用及机制研究

目的探讨虎杖苷对高脂喂养的中年低密度脂蛋白受体基因敲除(low-density lipoprotein receptor knockout,LDLr~(-/-))小鼠非酒精性脂肪肝炎的保护作用及机制。方法 12月龄雄性LDLr~(-/-)小鼠随机分为对照组、模型组、白藜芦醇(200 mg/kg)组和虎杖苷低、高剂量(100、200 mg/kg)组,对照组给予常规饲料喂养,其余各组给予高脂饲料喂养;同时给予虎杖苷和白藜芦醇干预12周后,检测各组小鼠血清代谢参数;采用油红O染色、苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色考察各组小鼠肝脏组织病理变化;采用试剂盒检测各组小鼠肝脏中三酰甘油(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin 6,IL-6)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)水平及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH)活性;采用免疫共沉淀法检测各组小鼠肝脏组织中乙酰化肝激酶B1 (liver kinase Bl,LKB1)表达情况;采用Western blotting法检测各组小鼠肝脏组织中氧化应激、纤维化及sirtuin l (SIRT1)信号通路相关蛋白表达情况。结果虎杖苷显著改善高脂喂养的中年LDLr-/小鼠代谢基础特征(P0.05),抑制肝脏脂肪变性和肝纤维化;显著降低肝脏组织中TC、TG、TNF-α、IL-6、MDA和HYP水平(P0.05);显著升高SOD、GSH和CAT活性(P0.05);显著降低肝脏中脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶 1 (stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)、转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白表达水平(P0.05),显著升高过氧化物酶体增殖激活受体α (peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα)和肉毒碱棕榈酰基转移酶 1α (carnitine palmitoyltransferasela,CPT1α)蛋白表达水平(P0.05);显著增加核因子E2相关因子(nuclear factor E2-:related factor2,Nrf2)入核表达(P0.05);显著升高SIRT1蛋白表达水平(P0.05),降低SIRT1靶蛋白肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1乙酰化水平(P0.05);显著升高p-LKB1/LKB1和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)/AMPK 蛋白表达水平(P0.05),显著降低p65乙酰化水平和p65入核表达(P0.05)。结论虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr~(-/-)小鼠非酒精性脂肪肝炎具有保护作用,且与SIRT1的激活有关。     

益气养阴方对2型糖尿病大鼠脂代谢的影响

目的:观察药食同源益气养阴方对高脂饲料联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立的2型糖尿病(T2DM)大鼠模型脂代谢的影响,探讨其在调控脂代谢方面的作用机制。方法:高脂饲料喂养大鼠4周,腹腔注射STZ制备T2DM大鼠模型。糖尿病大鼠随机分为模型组、益气养阴高、中、低剂量组(9.00,4.50,2.25 g·kg^-1)和二甲双胍组(0.20 g·kg^-1),另设正常组。益气养阴方高、中、低剂量组分别给予口服不同剂量的益气养阴方颗粒,二甲双胍组给予二甲双胍,模型组、正常组均给予同体积生理盐水干预。连续灌胃3周,测定体质量、血糖,全自动生化分析仪检测甘油三酯(TG),总胆固醇(TC),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),丙氨酸氨基转移酶(ALT),碱性磷酸酶(ALP),总蛋白(TP)的含量;苏木素-伊红(HE)染色观察各组肝脏组织病理变化情况;PAS染色观察肝脏组织肝糖原病理变化情况;油红O染色观察肝脏组织脂质变化情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)观察肝脏组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)/乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)/过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)通路蛋白表达情况。结果:与正常组比较,模型组TG,TC,LDL-C,AST,ALT,ALP含量明显升高,HDL-C含量明显降低(P<0.05,P<0.01),与模型组比较,益气养阴方各组可显著降低大鼠血清中TG,LDL-C含量(P<0.05,P<0.01),显著增加HDL-C含量(P<0.05);组织形态学检测显示,益气养阴方对肝脏中肝细胞胞间空泡、脂肪变性程度显著减轻,肝脏组织脂质区域显著缩小;与正常组比较,模型组肝脏组织中p-AMPKα,PPARα,SREBP-1(浆)蛋白表达显著降低,p-ACC1,SREBP-1(核)蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,益气养阴方对肝脏组织中p-AMPKα,PPARα,SREBP-1(浆)蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01),p-ACC1,SREBP-1(核)蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:益气养阴方对高脂饲料联合STZ引起的T2DM大鼠血脂升高具有明显的降低作用;T2DM大鼠血脂的降低可能与影响大鼠肝脏AMPK/ACC1/SREBP-1/PPARα通路有关。     

津力达颗粒对高脂诱导胰岛素抵抗ApoE~(-/-)小鼠骨骼肌DGAT1的影响

目的:研究津力达颗粒对高脂诱导的胰岛素抵抗Apo E-/-小鼠骨骼肌甘油三酯相关基因的影响。方法:8只雄性C57BL/6J小鼠设为正常对照组(NF);40只雄性Apo E-/-小鼠高脂饮食喂养16 w后分为模型组、罗格列酮组及津力达颗粒低、中、高剂量组,开始灌胃给药,连续8 w。采用酶法、BCA蛋白浓度法测定骨骼肌TG含量;葡萄糖耐量实验(OGTT)评价小鼠胰岛素抵抗程度;实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)测定小鼠骨骼肌胰岛素受体底物(IRS-1)、二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)mRNA和蛋白表达。结果:津力达颗粒能够不同程度降低小鼠的空腹血糖(FBG)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA);下调空腹胰岛素(FIns)水平,提高胰岛素敏感指数(ISI),显著改善小鼠糖耐量异常;明显改善小鼠骨骼肌脂质沉积;不同程度上调小鼠IRS-1 mRNA和蛋白表达,下调DGAT1 mRNA和蛋白表达。结论:津力达颗粒能通过调节骨骼肌DGAT1基因和蛋白表达,改善高脂诱导的Apo E-/-小鼠的胰岛素抵抗。     

化瘀祛痰方调节AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路抑制炎症小体活化改善AS小鼠肝脏脂质沉积的机制研究

目的?探讨化瘀祛痰方调节腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1/过氧化酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（AMPK/SIRT1/PGC-1α）信号通路调控炎症小体活化对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠肝脏脂质沉积的影响及作用机制。方法?将24只ApoE-/-小鼠按随机数字表法分为模型组、辛伐他汀组、化瘀祛痰方组，8只C57BL/6J小鼠作为正常组对照。造模结束次日各组开始灌胃，正常组和模型组采用等容积生理盐水，辛伐他汀组采用辛伐他汀混悬液2.275 mg/（kg·d），化瘀祛痰方组采用化瘀祛痰方，生药量为20 g/（kg·d），每日1次，连续给药8周。采用全自动生化分析仪检测血清血脂水平；HE染色和油红O染色观察肝脏组织病理和脂质沉积情况；Western Blot法检测肝脏腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）、沉默信息调节因子1（SIRT1）、过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（PGC-1α）、线粒体转录因子A（Tfam）、含pyrin结构域NOD样受体家族3（NLRP3）蛋白表达；实时荧光定量PCR法检测肝脏线粒体DNA（mtDNA）水平；ELISA法检测血清IL-1β、IL-18水平。结果?与正常组比较，模型组甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白总胆固醇（LDL-C）水平显著升高（P<0.01）；肝脏细胞肿胀，排列紊乱，出现大量脂肪空泡，脂质沉积明显；p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、Tfam蛋白表达降低，NLRP3蛋白表达升高（P<0.05）； mtDNA相对表达量减少（P<0.01）；IL-1β、IL-18水平升高（P<0.01）。与模型组比较，辛伐他汀组和化瘀祛痰方组TG、TC、LDL-C水平降低（P<0.01）；肝细胞结构有所恢复，少见脂肪空泡，脂质沉积现象改善明显；两组p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、Tfam蛋白表达升高，NLRP3蛋白表达减少（P<0.05，P<0.01）；mtDNA相对表达量增加（P<0.01）；两组血清IL-1β、IL-18水平降低（P<0.01）。4组血清高密度脂蛋白总胆固醇（HDL-C）水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论?化瘀祛痰方可通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路调节线粒体功能，抑制炎症小体激活和炎性反应，改善肝脏脂质沉积。     

芹菜素对肥胖型小鼠脂肪组织AMPK信号通路的作用机制

目的:研究芹菜素对肥胖型db/db小鼠脂肪紊乱的作用及机制。方法:8周龄雄性db/db小鼠随机分为模型组、芹菜素组(50 mg·kg-1·d-1),雄性C57BL/6J小鼠为正常组,药物干预4周后,检测小鼠体质量、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),总胆固醇(total cholesterol,CHO),甘油三酯(total triglyceride,TG),游离脂肪酸(free fatty acids,FFA),天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST),血肌酐(serum creatinine,SCr),血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN);脂肪组织苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察脂肪细胞病理变化;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测胆固醇应答元件结合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein 1c,SREBP1c),脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS),过氧化物增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptorα,PPARα)基因表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)和乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)磷酸化水平。结果:与模型组比较,芹菜素组小鼠体质量,FBG,CHO,TG,FFA明显降低(P0.05,P0.01);HE染色脂肪细胞变小,脂质沉积减低;脂肪组织SREBP1c,FAS mRNA表达降低(P0.01),p-AMPKα,p-ACC蛋白表达升高(P0.05,P0.01)。结论:芹菜素可以改善db/db小鼠脂肪代谢紊乱,可能是通过上调脂肪组织AMPK,ACC磷酸化水平,下调SREBP1c,FAS mRNA表达实现。     

人参-三七-川芎提取物延缓高糖诱导的小鼠血管衰老的机制探讨

目的:从单磷酸腺苷活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)通路探讨人参-三七-川芎提取物对高糖诱导的小鼠血管衰老的保护作用。方法:130只雄性C57BL/6小鼠先随机分为空白组和高糖组,高糖组腹腔注射链脲佐菌素(STZ),并用高脂饮食连续性喂养7个月后再次随机分组,分为模型组、人参-三七-川芎提取物低剂量组(0.819 g·kg~(-1))、人参-三七-川芎提取物高剂量组(1.638 g·kg~(-1))及二甲双胍组(150 mg·kg~(-1)),灌胃给药,每天1次,连续9周,期间检测小鼠体质量和血糖变化。给药结束后,苏木素-伊红(HE)染色检测小鼠胸主动脉形态,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠胸主动脉周期蛋白依赖激酶抑制因子2A(p16),周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21),AMPK,p-AMPK,mTOR,pmTOR,肝激酶B1(LKB1),p-LKB1,核糖体蛋白s6激酶(p70s6k),p-p70s6k蛋白表达情况。结果:与空白组相比,模型组小鼠体质量显著降低、血糖显著升高(P0.01),在药物干预9周后,各给药组小鼠体质量无明显差异,血糖值较模型组明显下降(P0.05,P0.01)。与空白组相比,模型组内膜损伤严重且有增生,中膜明显增生且排列不整齐,给药各组内膜损伤不明显,中膜少量增生,p16,p21,mTOR,p-mTOR,p70s6k,p-p70s6k蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01),AMPK,p-AMPK,LKB1,p-LKB1蛋白表达明显下降(P0.05,P0.01)。药物干预后,各给药组p16,p21,mTOR,p-mTOR,p70s6k,p-p70s6k蛋白表达明显下降(P0.05,P0.01),AMPK,p-AMPK,LKB1,p-LKB1蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01)。结论:高糖能够诱导小鼠主动脉衰老,人参-三七-川芎提取物可能通过AMPK/mTOR通路改善由高糖诱导的小鼠主动脉衰老。     

电针通过调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对衰老小鼠肝脏自噬与氧化应激的影响

目的:观察电针对衰老小鼠体力及肝脏AMP活化的蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、Atg5、Atg7、Atg13和Beclin1表达的影响,探索其通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路延缓衰老的机制.方法:将30周龄雄性SAMP8小鼠随机分为模型组、雷帕...     

肝豆汤对Wilson病模型高铜诱导的SH-SY5Y细胞自噬效应的影响及其作用机制

目的:研究肝豆汤对高铜诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞自噬效应的影响及其作用机制,为中医药防治脑型Wilson病(Wilson disease,WD)提供新的治疗靶点和研究思路。方法:噻唑蓝(MTT)比色法筛选硫酸铜(CuSO_4)造模浓度(0,100,200,400,800,1 600μmol·L-1)及时间; MTT比色法筛选含药血清浓度(5%,10%,15%,20%)及时间;乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞LDH漏出率;流式细胞法检测细胞内活性氧(ROS)的含量;荧光染料JC-1检测细胞线粒体膜电位;流式细胞仪对自噬进行定量分析。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝激酶B1(LKB1),腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK),自噬微管相关蛋白轻链3A/B(LC3A/B),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),unc-51样激酶1(ULK1),磷酸化ULK(p-ULK),磷酸化AMPK(p-AMPK)蛋白的表达。结果:MTT结果显示,CuSO_4对细胞的损伤呈现一定的量效和时效关系(P 0. 01),随着CuSO_4作用浓度及时间的增加,细胞存活率呈现下降趋势; 10%含肝豆汤兔血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞死亡(P 0. 01)。LDH释放实验显示,与正常组比较,CuSO_4作用细胞后LDH漏出率显著增加(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清明显降低CuSO_4损伤细胞的LDH漏出率(P 0. 05)。DCFH-DA荧光染色显示,与正常组比较,CuSO_4可显著增加细胞内ROS生成(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞内ROS产生(P 0. 01)。JC-1染色结果显示,与正常组比较,CuSO_4诱导细胞线粒体膜电位Δψm显著降低(P 0. 01),与模型组比较,含肝豆汤兔血清明显抑制CuSO_4诱导的线粒体膜电位降低Δψm(P 0. 05)。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组细胞内LKB1,AMPK,LC3A/B,ULK1及p-AMPK蛋白的表达显著增加,mTOR及p-ULK蛋白的表达显著降低(P 0. 01)。与模型组比较,含肝豆汤兔血清组LKB1,AMPK,LC3A/B,ULK1及p-AMPK蛋白表达显著降低,mTOR及p-ULK蛋白表达显著增加(P 0. 01)。结论:高铜可通过诱导细胞内线粒体氧化应激,上调自噬相关蛋白LKB1,p-AMPK,AMPK,LC3A/B及ULK1的表达,下调自噬相关蛋白mTOR及p-ULK的表达,导致细胞发生自噬性死亡,而肝豆汤可通过调控LKB1/AMPK信号通路,下调自噬相关蛋白LKB1,p-AMPK,LC3A/B,ULK及AMPK的表达,上调自噬相关蛋白及基因mTOR及p-ULK的表达,抑制自噬的发生,阻断高铜诱导的神经元损伤,从而发挥神经保护作用。     

苓桂术甘汤对瘦素基因缺陷ob/ob小鼠肝FXR/FGF15/SHP途径的影响

目的:观察苓桂术甘汤对瘦素基因缺陷小鼠肝脏的影响,探讨其保护作用机制是否与其干预肝法尼醇X受体(FXR)/成纤维细胞生长因子15(FGF15)/小异源二聚体伴侣(SHP)途径有关。方法:将雌性C57小鼠和ob/ob小鼠随机分为正常组,模型组,苓桂术甘汤高、低剂量组(23.1,7.7 g·kg-1),阳性药组(立普妥,0.002 6 g·kg-1),每组各8只。治疗4周后处死小鼠,取小鼠肝脏组织,称量小鼠体质量和肝脏质量,计算肝脏指数;苏木素-伊红(HE)染色和油红O染色观察肝脏组织形态和脂质沉积情况,免疫荧光染色检测肝脏组织法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测成纤维细胞生长因子15(FGF15)和酪氨酸磷酸酶(SHP)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组体质量和肝脏指数显著增高(P0.01),肝脏脂质沉积严重,肝脏组织FXR,FGF15和SHP蛋白表达下调(P0.01);与模型组比较,苓桂术甘汤组小鼠体质量和肝脏指数降低(P0.05,P0.01),肝脏脂质沉积减少,上调肝脏组织FXR,FGF15和SHP蛋白表达(P0.05,P0.01)。结论:苓桂术甘汤能够抗瘦素基因缺陷模型小鼠的肝损伤,其作用机制可能与其干预肝FXR-FGF15-SHP途径有关。     

木犀草素含药血清对高糖诱导肾小球系膜细胞AMPK/SIRT-1/PGC-1α信号通路及凋亡的影响

目的:探讨木犀草素(Luteolin)含药血清对高糖诱导下肾小球系膜细胞(GMCs)凋亡及单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)/过氧化物酶增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)信号通路的影响。方法:将健康SPF级SD雄性大鼠分为正常组、Luteolin低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)剂量组、罗格列酮阳性组(0.36 mg/kg),每组10只,均灌胃给予相应剂量药物,1次/d,连续7 d后,经腹主动脉取血制备含药血清。取SV40 MES13型小鼠GMCs将其分为正常组、高糖模型组、Luteolin含药血清低、中、高剂量组、阳性含药血清组,各组细胞按相应剂量药物处理并培养24 h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及流式细胞仪检测各组GMCs存活率及凋亡率;以蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测各组细胞通路蛋白AMPK/SIRT-1/PGC-1α及凋亡相关蛋白脂肪酸合酶(Fas)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)表达。结果:与正常组相比,模型组GMCs细胞密度、胞质微丝样结构、胞核颗粒沉积等HE染色病理形态、存活率、Bcl-2蛋白表达均升高(P<0.05),凋亡率、pAMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α、Fas蛋白表达均降低(P<0.05)。与模型组相比,Luteolin含药血清低、中、高剂量组及阳性对照组细胞密度、胞质微丝样结构、胞核颗粒沉积等HE染色病理形态、存活率、Bcl-2蛋白表达均降低(P<0.05),凋亡率、pAMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α、Fas蛋白表达均升高(P<0.05),且Luteolin各剂量组呈剂量依赖性。阳性对照组与Luteolin含药血清高剂量组相比,上述指标无差异(P>0.05)。结论:Luteolin血清可能通过激活AMPK/SIRT-1/PGC-1α蛋白表达,抑制高糖诱导下GMCs过度增生,促进其凋亡。     

基于CaMkkβ/AMPK通路介导线粒体自噬探讨敛肝熄风止颤方的神经保护机制

目的:观察敛肝熄风止颤方对帕金森病(Parkinson Disease,PD)的影响,探讨其神经保护机制。方法:将60只SD大鼠分为假手术组10只,造模组50只,造模组大鼠接受PD模型制备,将成模的40只大鼠随机分为模型组10只、低剂量组(0.36 g/kg)10只、中剂量组(0.72 g/kg)及高剂量组(1.44 g/kg)10只,持续灌胃给药30 d,比较各组大鼠阿扑吗啡诱导旋转次数、圆筒实验,纹状体超微结构以及CaMkkβ、AMPK、p-AMPK水平的变化。结果:1)敛肝熄风止颤方可明显减少大鼠转圈以及肢体碰壁的次数,随着剂量增加次数减少更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。2)造模大鼠纹状体线粒体自噬现象减弱,敛肝熄风止颤方可明显促进脑组织线粒体自噬。3)中药干预后大鼠纹状体CaMkkβ、p-AMPK蛋白表达上调,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中高剂量组较低剂量组上调明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:敛肝熄风止颤方对帕金森病具有神经保护作用,其机制之一可能是通过激活CaMkk/AMPK通路活性促进线粒体自噬有关。     

灯盏花素通过调控LKB1/AMPK和Notch1/Jagged1通路改善高脂血症大鼠血脂水平及肝肾功能的作用机制研究＊

目的 基于LKB1/AMPK和Notch1/Jagged1通路探讨灯盏花素改善高脂血症大鼠血脂水平及肝肾功能的作用机制。方法 60只雄性SD大鼠随机为正常组、模型组、辛伐他汀组（20 mg·kg^-1）和灯盏花素低、中、高剂量组（6、12、24 mg·kg^-1），每组10只。采用先腹腔注射75%蛋黄乳液后饲喂高脂饲料的方式建立高脂血症模型，同时给药干预，1次/天，连续28d。采用ELISA法检测大鼠血清中T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、Cr、BUN水平；测定大鼠肝脏、肾脏系数；采用HE染色法观察肝肾组织病理学变化；采用免疫组化法检测肝组织p-AMPK、LKB1、HMGCR水平及肾组织Notch1、Jagged1、Hes1水平；采用RT-PCR法检测肝组织p-AMPK、LKB1、HMGCR水平mRNA水平及肾组织Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA水平。结果 与正常组比较，模型组大鼠血清TG、T-CHO、LDL-C、ALT、AST、Cr、BUN水平明显升高（P<0.05），HDL-C水平明显降低（P<0.05）；肝脏、肾脏系数明显增加（P<0.05）且出现病理变化；肝组织中p-AMPK、LKB1水平明显降低（P<0.05），HMGCR水平明显升高（P<0.05）；肾组织Notch1、Jagged1、Hes1水平明显升高（P<0.05）。与模型组比较，辛伐他汀组和灯盏花素低、中、高剂量组大鼠血清TG、T-CHO、LDL-C、ALT、AST、Cr、BUN水平明显降低（P<0.05），HDL-C水平明显升高（P<0.05）；肝脏、肾脏系数明显减小（P<0.05）且病变程度减轻；肝组织中p-AMPK、LKB1水平明显升高（P<0.05），HMGCR水平明显降低（P<0.05）；肾组织Notch1、Jagged1、Hes1水平明显降低（P<0.05）。结论 灯盏花素能够改善高脂血症大鼠血脂水平及肝肾功能，其机制与激活LKB1/AMPK通路及抑制Notch/Jagged1通路和HMGCR水平有关。     

当归多糖对糖尿病肾病KK-Ay小鼠肾脏AMPK信号通路及线粒体自噬的影响

目的 研究当归多糖对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）KK-Ay小鼠肾脏磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase,AMPK）信号通路及线粒体自噬的影响。方法 SPF级雄性KK-Ay小鼠用高糖高脂饲料喂养,随机分为模型组、厄贝沙坦（25 mg/kg）组和当归多糖高、中、低剂量（400、200、100 mg/kg）组,每组10只;将10只雄性C57BL/6J小鼠作为对照组。给予药物干预4周,观察小鼠一般情况,每周称定体质量并检测血糖;末次给药后,心脏取血并处死小鼠,分离血清检测尿微量白蛋白（urine microalbuminuria,U-ALB）、肌酐（creatinine,SCr）、尿素氮（urea nitrogen,BUN）;采用苏木素-伊红（HE）染色观察肾组织病理变化;采用Western blotting检测肾组织线粒体自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62、Nix]和线粒体裂变蛋白[线粒体动力相关蛋白1(dy...     

橙皮苷改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用机制研究

目的:研究橙皮苷对动脉粥样硬化的ApoE^-/-小鼠和LPS诱导的Raw 264.7巨噬细胞的保护作用及可能机制。方法:将60只ApoE^-/-小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组及橙皮苷低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组各10只。采用高脂饲料饲养16周造模,检测各组小鼠血清三酰甘油(triglycerides,TG)、总胆固醇(cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、重组人精氨酸酶1(Arginase-1,ARG1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10水平。使用分子对接程序AutoDock vina对橙皮苷与AMPK结合能力进行预测。将Raw 264.7巨噬细胞分为空白组、模型组和橙皮苷低浓度组、中浓度组、高浓度组(5μmol·L^-1、10μmol·L^-1、20μmol·L^-1),采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)进行造模。Western Blot法检测P-AMPK、PPAR-γ、P-P65、P65蛋白表达。结果:与模型组比较,橙皮苷中、高剂量组大鼠血清TG,TC和LDL-C水平降低HDL-C水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。油红O染色结果显示:橙皮苷高剂量组能抑制血管中脂质的累积,较模型组脂质区域明显减小。AutoDock vina预测结果提示,橙皮苷可与AMPK的ILE-46、GLN-109、ASN-111、ASN-110等残基形成氢键而结合,结合力为-10.158 kcal·mol^-1。橙皮苷上调LPS诱导的Raw 264.7巨噬细胞P-AMPK、PPAR-γ蛋白表达,下调P-P65表达(P<0.01)。结论:橙皮苷能够有效改善ApoE^-/-小鼠的动脉粥样硬化,其机制可能与调控巨噬细胞极化相关。