丹参素对肝星状细胞ERK1/2信号转导通路的影响

目的:观察丹参素对血小板衍生生长因子-BB（Plateletderivedgrowthfactor-BB,PDGF-BB）刺激大鼠肝星状细胞（Hepaticstellatecell,HSC）增殖、Ⅰ型胶原合成、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（Phosphorylatedextracellularsignal-regulatedkinase1/2,P-ERK1/2）表达的影响,探讨丹参素抗肝纤维化的分子机制。方法:四甲基偶氮唑盐法检测大鼠HSC增殖活性;免疫细胞化学染色法测定大鼠HSCⅠ型胶原合成的表达;Westernblot测定大鼠肝星状细胞P-ERK1/2的表达。结果:丹参素有抑制PDGF-BB刺激大鼠HSC增殖,Ⅰ型胶原表达,P-ERK1/2表达的作用。结论:丹参素可抑制PDGF-BB刺激的大鼠HSC增殖,Ⅰ型胶原合成,其机制可能与抑制ERK1/2信号转导通路有关。     

熊果酸(UA)对大鼠活化型肝星状细胞(HSC)的NADPH氧化酶(NOX)亚基及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路活化的影响

 目的  观察熊果酸(ursolic acid,UA)对大鼠活化型肝星状细胞-6 (hepatic stellate cell T6,HSC-T6) NADPH氧化酶(NAPDH oxidase,NOX)亚基及其调控的磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase/Akt,PI3K/Akt)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinase,P38MAPK)信号通路及其对基质金属蛋白酶组织抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基质金属蛋白酶-1(metal matrix proteinase -1,MMP-1)蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法  取对数生长期的HSC-T6细胞,随机分成6组:空白对照组、瘦素组(100 ng/mL)、UA干预组(UA 50 μmol/L+瘦素)、NOX抑制剂DPI干预组(DPI 20 μmol/L+瘦素)、P38MAPK抑制剂SB203580干预组(SB203580 10 μmol/L+瘦素)及PI3K抑制剂LY294002干预组(LY294002 10 μmol/L+瘦素)。采用Western blot法分别检测NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达;信号通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化及TIMP 1、MMP 1蛋白表达。结果  UA能显著抑制瘦素诱导的gp91phox、 p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达(P均<0.01),但UA对gp91phox、p67phox蛋白表达的抑制作用不及DPI和LY294002。UA能抑制瘦素诱导的PI3K蛋白表达及Akt、P38MAPK蛋白磷酸化(P均<0.01),与DPI及LY294002作用的差异无统计学意义。UA能抑制瘦素诱导的TIMP-1蛋白表达,同时促进MMP-1蛋白表达(P均<0.01)。结论  UA能抑制瘦素诱导的大鼠HSC T6细胞NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1表达及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的活化;其下调TIMP-1蛋白及上调MMP-1蛋白表达的机制可能与UA抑制NOX调控的PI3K/Akt及P38MAPK信号通路有关。     

内毒素对大鼠原代肝星状细胞ERK1/2信号转导通路的影响

目的研究内毒素对大鼠原代肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖活化过程中ERK1/2信号转导通路的影响及机制。方法用链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶以及密度梯度离心法分离培养大鼠原代HSCs,随机分为对照组、内毒素组和PDTC(Pyrrolidinedithiocarbamic acid,NF-κB抑制剂)组。在培养至第5d时,内毒素组和PDTC组加入终浓度为lμg/ml的内毒素刺激细胞,PDTC组同时加入终浓度为15μmol/L的PDTC,30min后收集各孔HSCs,提取细胞总蛋白,Western Blot检测P-ERK1/2水平。结果内毒素刺激原代培养HSCs后,与对照组相比P-ERK1/2水平明显上升(P<0.01),NF-κB抑制剂PDTC能显著降低该变化。结论内毒素可直接刺激大鼠原代HSCs引起胞内ERK1/2信号传导通路活化,NF-κB信号通路可能是内毒素刺激的原代HSCs所导致ERK1/2信号转导通路活化的重要途径之一。     

姜黄素对大鼠肝星状细胞中TGF-β调节的NADPH氧化酶4的激活及Smad信号通路的影响

目的：研究姜黄素潜在的抗纤维化作用,以及转化生长因子β( TGF-β)诱导大鼠肝星状细胞( HSC-T6)激活的机制。方法不同浓度的姜黄素(0、5、10、20、40μmol/L)处理HSC-T6后,用MTT法测定其对HSC-T6增殖作用的影响;用RT-PCR法检测其mRNA水平的表达;用Westem blot法检测表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞外基质主要成分α1I胶原(Col1α1)、NADPH氧化酶4(NOX 4)、 Smad 2、Smad 3及其磷酸化的水平。结果40μmol/L的姜黄素组刺激HSC-T648 h后,其抑制率达到最大,显著低于仅TGF-β1刺激组、5、10及20μmol/L姜黄素组( P<0．05)。姜黄素可显著降低激活型HSC-T6的α-SMA、α1I胶原mRNA与蛋白表达,从而可以降低细胞外基质的沉积;有效降低了NOX 4的蛋白水平,减少了活性氧的水平;还明显降低Smad 2、Smad 3的磷酸化程度,呈浓度依赖性。结论姜黄素在体外能够明显地抑制HSC-T6激活,对肝纤维化的发生发展具有一定抑制作用,其机制可能与抑制TGF-β诱导的NOX4的激活及Smad信号通路有关。     

大蒜素对大鼠肝星状细胞单胺氧化酶表达的影响

目的观察大蒜素对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖及细胞外基质合成酶-单胺氧化酶(MAO)的影响,探讨大蒜素抗肝纤维化的作用及其机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6。以MTT法检测大蒜素作用下对大鼠肝星状细胞增殖的影响,real time RT-PCR检测肝星状细胞的MAO m RNA的表达水平、Western blot检测肝星状细胞的MAO蛋白的表达水平。结果 HSC-T6大蒜素处理组与空白对照组比较,增殖抑制率明显提高,差异有统计学意义(P0.05);MAO的m RNA及蛋白表达水平均明显下调,并且大蒜素浓度增高时,MAO的m RNA及蛋白表达水平则逐渐下调,DATS高浓度实验组(24μg/ml)对MAO的抑制作用明显强于溶剂对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论大蒜素对HSC-T6的增殖和MAO的表达均有抑制作用,且对MAO的表达抑制作用具有剂量依赖性,可为临床开发抗肝纤维化的新药物提供理论基础。     

槲皮素对糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶p47phox亚基表达的影响

目的探讨槲皮素干预对糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶p47phox亚基表达的影响及意义。方法采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)方法构建糖尿病模型,32只大鼠分为正常对照组、糖尿病未治疗组、槲皮素小剂量干预组及槲皮素大剂量干预组,12周后称体质量、肾重,计算肾重指数,Western blot检测各组肾脏p47phox、NF-κb、FN和ColIV的表达,应用流式细胞仪检测组织中活性氧簇(ROS)的表达。结果糖尿病未治疗组肾重指数增高(P<0.01);p47phox、NF-κb、FN、ColIV及ROS表达显著上调(P均<0.01)。槲皮素干预能降低肾重指数(P<0.01);减少糖尿病大鼠肾脏p47phox、NF-κb、FN、ColIV及ROS的表达(P均<0.01),以上效应具有剂量依赖性。结论槲皮素干预可以减轻糖尿病大鼠肾病病变,p47phox表达下调导致氧化应激减弱可能是其作用机制之一。     

葫芦茶苷通过调控Nrf2/HO-1信号通路抑制肝星状细胞增殖活化的作用

目的 分析葫芦茶苷对肝星状细胞(HSC)增殖活化的抑制作用,并基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号通路探讨其可能的作用机制。方法 将人肝星状细胞系LX-2细胞分为空白对照组、模型组和葫芦茶苷不同剂量组。除空白对照组外,其余各组加入含转化生长因子β1(TGF-β1)的培养液使细胞增殖活化;刺激24 h后,葫芦茶苷不同剂量组加入相应剂量的葫芦茶苷干预24 h。检测各组LX-2细胞的增殖情况,细胞上清液Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平,以及细胞中α-SMA、ColⅠ、Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果 (1)与空白对照组比较,模型组细胞增殖明显(P<0.05);与模型组比较,葫芦茶苷各剂量组LX-2细胞的增殖均受到抑制,且随着药物剂量的增加抑制效果越明显(均P<0.05)。选取抑制率适宜的剂量20、40、80μg/mL(葫芦茶苷低、中、高剂量组)进行后续实验。(2)与空白对照组比较,模型组细胞上清液ColⅠ、ColⅢ和α-SMA表达水平升高,α-SMA和ColⅠ的mRNA和...     

商陆皂苷甲对IL-1β诱导的肾小球系膜细胞ERK1/2-AP-1通路活化的影响

目的 观察商陆皂苷甲(EsA)含药血清对大鼠肾小球系膜细胞(rGMC)增殖及其对IL-1β诱导rGMC的ERK1/2-AP-1通路活化的影响.方法 用不同剂量EsA(5、10、20、40 mg/kg)将SD大鼠灌胃后获取含药血清,并设对照组(0.5％羧甲基纤维素钠灌胃);用上述各组浓度的EsA含药血清处理rGMC,并设对照组血清组.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组EsA含药血清对rGMC增殖的影响;将rGMC分为空白对照组、IL-1β单独作用组、IL-1ββ+ EsA双重作用组、IL-1β+U016双重作用组、IL-1β+U0126+EsA共同作用组,同步化后培养48 h,Western Blot法检测p-ERK1/2、AP-1的表达并成像分析.结果 EsA(5～10 mg/kg)含药血清抑制了细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01);ILqβ组促进了rGMC的p-ERK1/2、AP-1表达(P＜0.05),IL-1β+EsA组、IL-1β+ U0126组,IL-1β+U0126+EsA组作用rGMC后,其p-ERK1/2、AP-1表达均降低(P＜0.05).结论 EsA含药血清(5～10 mg/kg)显著抑制了rGMC的增殖;EsA通过下调p-ERK1/2、AP-1表达,抑制了IL-1β诱导的rGMC增殖,EsA作用于ERK1/2-AP-1通路是其抑制rGMC增殖的机制之一.     

丹防胶囊对肝星状细胞PDGF-B和ERK1/2表达的影响

目的:探讨大鼠丹防胶囊含药血清对肝星状细胞合成血小板源性生长因子-B(PDGF-B)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的影响.方法:将大鼠分为3组,分别经丹防胶囊、复方鳖甲软肝片及生理盐水灌胃后股动脉取血制备大鼠丹防胶囊含药血清、鳖甲含药血清及生理盐水血清,3组血清分别干预肝星状细胞(HSC-T6),免疫细胞化学法、蛋白印迹法检测PDGF-B及ERK1/2表达的水平.结果:丹防胶囊血清组HSC-T6中PDGF-B及ERK1/2蛋白表达强度均较生理盐水血清组明显降低(P＜0.01),与鳖甲血清组相当(P＞0.05).结论:丹防胶囊大鼠含药血清对肝星状细胞合成PDGF-B及ERK1/2有明显的抑制作用,提示丹防胶囊可能对大鼠肝星状细胞的增殖具有抑制效应.     

AcSDKP对大鼠活化HSCs增殖及分泌细胞外基质的影响

目的通过N-乙酰基-丝氨酸-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)干预,观察其对活化肝星状细胞(HSCs)的增殖以及合成和分泌细胞外基质(ECM)的影响。方法大鼠原代HSCs分离、培养和鉴定后,分别给予0.01、0.1、1、10、100nmol/LAcSDKP进行干预,设立空白对照组。MTT法检测AcSDKP干预对HSCs增殖的影响;RT-PCR技术检测活化HSCsⅠ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)mRNA表达;酶联免疫法检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量。结果与空白对照组相比,1、10nmol/LAcSDKP干预显著抑制活化HSCs的增殖;1、10nmol/L及0.1～100nmol/LAcSDKP的干预,分别显著抑制HSCsColⅠmRNA和ColⅢmRNA表达;0.1、1、10nmol/L和0.1、1nmol/LAcSDKP干预可分别显著抑制培养上清液HA和LN的表达。结论本实验发现,AcSDKP可抑制活化HSCs合成和分泌ECM,并呈现一定的剂量依赖性,以浓度为1nmol/L时作用最为显著。其作用机制可能与抑制HSCs增殖而使合成和分泌ECM的HSCs数量减少有关。     

大蒜素对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶抑制剂-1表达的影响

目的 观察大蒜素对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）增殖及细胞外基质降解酶-金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的影响,探讨大蒜素抗肝纤维化的作用及其机制.方法 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6.MTT法检测大蒜素作用下对大鼠肝星状细胞增殖的影响、Real-time RT-PCR检测肝星状细胞的TIMP-1mRNA水平、Western blot检测肝星状细胞的TIMP-1蛋白的表达水平.结果 HSC-T6大蒜素处理组与空白对照组比较,增殖抑制率明显提高,差异有统计学意义（P ＜0.01）;TIMP-1的mRNA及蛋白表达水平均明显下降,并且大蒜素浓度增高时,TIMP-1的mRNA及蛋白表达水平则逐渐下降,大蒜素高浓度（24μg/mL）组对TIMP-1的抑制作用明显高于空白对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 大蒜素对HSC-T6增殖和TIMP-1的表达均有抑制作用,为临床开发抗肝纤维化的新药物提供了理论基础.     

Effect of ursodeoxycholic acid on TGF beta1/Smad signaling pathway in rat hepatic stellate cells

Background Hepatic fibrosis is the key stage of the pathological progress from hepatic injury to cirrhosis. Ursodeoxycholic acid （UDCA） has been known as having significant clinical therapeutic effects on chronic liver diseases. Our research aimed to study the effect of UDCA on the signaling pathway of transforming growth factor beta1 （TGFβ1）/Smad and discuss its possible molecular mechanisms of inhibiting hepatic fibrosis.
Methods Rat hepatic stellate cells were cultured in vitro and randomly assigned to 4 groups. Group A was control group with only DMEM culture medium applied, and groups B, C, D were experimental groups, with different doses of UDCA （1.0 mmol/L, 0.5 mmol/L and 0.25 mmol/L respectively） added into their DMEM culture medium for further culture of 24 hours and 48 hours. The protein expressions of TGFβ1, TGF type 1 receptor, Smad3, Smad4 and Smad7 were measured by Western blotting, as well as the expressions of TGFβ1, Smad3, Smad7 and cAMP response element （CREB） binding protein （CBP） mRNA by real-time PCR. SPSS 11.5 statistical package was adopted for data analyses.
Results Compared with control group, the mRNA expressions of TGFβ1 in the high and middle UDCA dose groups for 24 hours and 48 hours significantly decreased （P 〈0.05）, the protein expressions of TGFβ1 in the two above groups for 48 hours and in the high dose group for 24 hours significantly decreased （P 〈0.05）. The protein and mRNA expressions of Smad3 in each UDCA dose group for 24 hours and 48 hours significantly decreased, with significant difference among different UDCA dose groups and between that of 24 hours and 48 hours observed （P 〈0.05）. The protein and mRNA expressions of Smad7 in the high and middle UDCA dose groups for 24 hours and 48 hours significantly increased. The CBP mRNA expression in each UDCA dose group for 24 hours and 48 hours significantly decreased （P 〈0.05）, with significant difference among different UDCA dose groups observed （P 〈0.05）.
Conclusion UDCA could curb the development of hepatic fibrosis through affecting the signaling pathway of TGFβ1/Smad by inhibiting the expressions of TGFβ1, Smad3 and CBP and increasing the expression of Smad7.     

海仁藻酸致痫大鼠肾脏ERK1/2表达的检测及意义

目的：研究海仁藻酸(KA)致痫大鼠肾脏细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）表达情况,阐明癫痫引起肾损伤的可能机制。方法：健康雄性Wistar大鼠70只,随机分为致痫组和正常对照组,每组35只。采用立体定位仪下杏仁核内注射KA方法制备癫痫动物模型,在大鼠癫痫发作后0、2、6、12和24 h制备肾脏组织标本,采用免疫组织化学法检测正常对照组和致痫组大鼠癫痫发作后不同时间肾脏组织ERK1/2表达水平,并与对照组对比。结果： 致痫组大鼠肾脏组织ERK1/2表达水平于癫痫发作后逐渐增加,6 h肾组织ERK1/2的表达达到高峰,高于癫痫发作后0 h（P<0.01）,随后逐渐下降;至癫痫发作24 h,肾脏ERK1／2表达恢复至致痫0 h的表达水平（P>0.05）。致痫组大鼠肾脏HE染色显示,肾小管、肾小球均无明显形态学改变。结论：ERK1/2　活化可能在癫痫所引起的肾脏损伤中具有重要的作用,抑制ERK1/2活化对肾脏起到保护作用。     

核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响

目的：探讨核心蛋白聚糖（ｄｅｃｏｒｉｎ）在肝纤维化形成机制中的作用。方法：在正常人肝细胞株Ｌ－０２及大鼠肝星形细胞株ＨＳＣ－Ｔ６体外培养体系中,分别加入不同质量浓度（０．０１,５,１０μｇ／ｍｌ）ｄｅｃｏｒｉｎ共培养不同时间后,进行细胞计数以及＾３Ｈ－ＴｄＲ和＾３Ｈ－Ｌｅｕ掺入量测定。结果：实验组经０．０１μｇ／ｍｌ ｄｅｃｏｒｉｎ作用４ｄ或６ｄ后,ＨＳＣ－Ｔ６和Ｌ－０２细胞增殖数量以及＾３Ｈ－Ｔ     

缺氧肝细胞对肝星状细胞基质金属蛋白酶-2表达及活性水平的影响

目的:探讨缺氧肝细胞对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达及其活性的影响。方法:缺氧培养肝细胞BRL-3A(氧浓度5%)12 h后取其培养上清作为条件培养基,培养肝星状细胞HSC-T6,设6、12、24 h 3个时间点,RT-PCR、酶图法分别检测HSC-T6 MMP-2 mRNA表达及其酶活性。以无血清DMEM培养肝星状细胞作为对照组。结果:随条件培养时间的延长,缺氧条件培养组HSC-T6 MMP-2活性均升高(30.74±8.22、31.71±8.10、49.79±13.61),且高于对照组(18.58±1.62、25.98±2.73、32.14±3.76),但扣除本底后缺氧条件培养基组HSC-T6 MMP-2活性(12.99±2.05、14.01±2.00、29.44±3.62)均低于相应对照组,在6 h和12 h时间点差异有统计学意义(P6 h=0.039,P12 h=0.007),缺氧条件培养基组HSC-T6 MMP-2 mRNA表达量(0.44±0.07、3.66±1.10、4.29±0.99)高于相应对照组(0.61±0.07、2.50±0.27、0.52±0.16),差异具有统计...     

p38MAPK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的观察用特异性p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法体外培养大鼠HSC株,用SB203580(浓度为5、10、20μmol/L)对乙醛(浓度200μmol/L)刺激的大鼠HSC进行干预,分别以酶标仪及流式细胞仪检测HSC增殖、凋亡及周期的变化。结果不同浓度SB203580对HSC增殖有抑制作用,增殖抑制率分别为21.6%、27.0%、31.5%,与乙醛对照组有显著差异(P<0.05),且呈剂量效应关系;对HSC凋亡有促进作用,凋亡率分别为(13.7±0.3)%、(14.9±0.2)%、(16.1±0.2)%,凋亡率逐渐增加,与乙醛对照组有显著差异(P<0.05),且呈剂量效应关系;可以明显阻滞乙醛刺激的HSC由G1期进入S期,G1/G0期细胞比例逐渐增高[(29.1±1.9)%、(35.5±3.4)%、(46.0±2.6)%],S期细胞比例逐渐降低[(53.4±2.6)%、(48.4±3.6)%、(43.8±1.1)%],与乙醛对照组有显著差异(P<0.05),呈...     

胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞增殖和ERK表达的影响

目的: 观察胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响. 方法: 体外培养人正常食管黏膜上皮细胞,分别在含有6种不同胆酸(250 μmol/L)的培养液中培养3～60 min,并设对照(培养液不含胆酸)进行比较. 采用MTT法和流式细胞技术测定细胞增殖状态. 免疫印迹法测定磷酸化ERK1/2蛋白表达. 结果: 胆酸的短时间(3～12 min)作用使细胞增殖比大于1,S期细胞比率升高,磷酸化ERK1/2蛋白表达增加. 当作用时间大于20 min时,细胞增殖比和S期细胞比率下降. 结论: 胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖,与ERK表达上调有关.     

损伤上皮细胞ERK1/2通路活化并诱导上皮下成纤维细胞增殖

目的:探讨气道上皮损伤过程中ERK1/2信号通路的活化及其病理意义。方法:将原代培养的人支气管上皮细胞给予机械性损伤和(或)加入ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059,采纳免疫组化、Western blotting或Zymog-raphy方法检测气道上皮细胞经机械损伤后ERK1/2的激活及MMP-2活性的变化;将损伤或加入MMP-2抑制剂的损伤上皮细胞上清刺激上皮下成纤维细胞,应用BrdU免疫组化检测成纤维细胞增殖的变化。结果:损伤诱导了上皮细胞ERK1/2信号通路的活化并促进活性MMP-2的释放,阻断ERK1/2信号通路减弱了损伤诱导的活性MMP-2水平;损伤上皮上清促进了成纤维细胞增殖,MMP-2抑制剂可阻断损伤上皮细胞上清的促增殖效应。结论:ERK1/2信号是损伤气道上皮高表达MMP-2进而诱导上皮下纤维化的一条重要信号通路。