氨甲喋呤对映体诱导白血病BALL-1、CCRF-CEM细胞系耐药后EGFR信号通路相关基因表达分析

目的建立耐氨甲蝶呤(MTX)对映体的人白血病BALL-1和CCRF-CEM细胞,观察其生物学特性,分析不同MTX对映体耐药细胞表皮生长因子受体(EGFR)信号通路相关基因的表达。方法用浓度递增结合低剂量持续诱导的方法建立L-(+)-MTX、D-(-)-MTX耐药细胞并绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,用RT-PCR法检测各细胞EGFR、KRAS、TGF、PI3K mRNA的表达情况。结果 L-(+)-MTX、D-(-)-MTX耐药细胞自第4日增殖速度明显较亲本细胞慢,而L-(-)-MTX耐药细胞增殖速度明显较D-(+)-MTX耐药细胞慢。与亲本细胞BALL-1、CCRF-CEM相比,两种耐药细胞周期分布中G0/G1期所占比例增加,S期细胞所占比例减少。L-(+)-MTX/BALL-1、D-(-)-MTX/BALL-1间EGFR、K-Ras mRNA差异有统计学意义(P均0.05)。L-(+)-MTX/CCRF-CEM、D-(-)-MTX/CCRF-CEM组间EGFR、K-Ras mRNA差异有统计学意义(P均0.05)。BALL-1细胞组、CCRF-CEM细胞TGF mRNA表达水平差异均无统计学意义(P均0.05),而两种细胞均无PI3K mRNA表达。结论耐D-(-)-MTX细胞增殖能力大于L-(-)-MTX细胞;耐L-(-)-MTX、D-(-)-MTX细胞EGFR、K-Ras mRNA表达存在差异。     

Luminex液相芯片技术测定氨甲喋呤对映体耐药A549细胞株中磷酸化酪氨酸激酶受体

目的 探讨氨甲喋呤(MTX)对映体诱导的耐药A549细胞株中磷酸化酪氨酸激酶受体(RTKs)的表达差异及受体间的相关性.方法 用MTX对映体浓度递增结合低剂量持续诱导肺腺癌A549细胞株,用Luminex液相芯片技术检测L-(+)-MTX/A549细胞、D-(-)-MTX/A549细胞和亲本A549细胞3组细胞中7种磷...     

实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达

目的 建立实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中FPGS mRNA表达的方法,研究MTX对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药细胞株中FPGS的基因表达差异,并用于观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGS mRNA表达水平的变化.方法 用SYBR Green Ⅰ为荧光染料,以β-actin作参照,建立检测FPGS mRNA的实时荧光定量PCR方法.根据Ct值、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价.并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的14例白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达.结果 建立的标准曲线Ct值与模板浓度有良好的线性关系,FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0.996 8和0.998 7,斜率分别为-3.595和-3.740,批内CV为1.27%～2.95%,批间CV为3.82%;熔解曲线均呈单个特异峰,扩增效率相似(斜率为0.021 7);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞中FPGS mRNA相对含量分别为(3.51±0.66)和(0.16±0.01),A549亲本细胞(S)中FPGS mRNA相对含量为(1.00±0.31),差异有统计学意义(F=64.45,P＜0.01);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞间FPGS mRNA相对含量差异有统计学意义(q=9.29,P＜0.01).白血病患者应用MTX治疗耐药后,FPGS mRNA表达水平为(0.35±0.04),用药前为(1.00±0.44),差异有统计学意义(t=8.83,P＜0.01).结论 建立的实时荧光定量PCR检测FPGS mRNA的方法重复性好、特异度高,可用于FPGSmRNA含量分析.MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA表达发生了变化,MTX 2种对映体形式在细胞耐药机制中可能发挥了不同的作用.     

MTX对映体耐药A549细胞株中EGFR基因mRNA的表达分析

【摘要】目的探讨表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）在氨甲喋呤（methotrexate，MTX）对映体L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX耐药A549细胞株中的表达。方法采用RT-PCR方法测定肺癌A549敏感细胞株和15p,moUL、35p,mol／L、55p,mol／L的L-（＋）-MTX和D-（-）-MTXA549耐药细胞株中EGFRmRNA表达情况。结果15μmol／L、35μmol／L、55μmol／LL-（＋）-MTXA549耐药细胞株中EGFR基因表达的mRNA相对含量分别为肺癌A549敏感细胞株的（1．55±0．26）倍、（1．86±0．13）倍、（1．20~0．05）倍。RT—PCR结果显示，A549敏感细胞株和L-（＋）-MTX各浓度A549耐药株均扩增出315bp条带，有EGFR基因表达，而3种浓度的D-（-）-MTX耐药细胞株中EGFR基因不表达。结论MTX诱导耐药后A549细胞株中EGFRmRNA发生变化，且在3种浓度两种对映体细胞株间具有明显的手性差异，MTX可能通过改变EGFR基因启动子的甲基化状态，影响EGFR的表达。     

毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术测定甲氨蝶呤对映体耐药A549细胞株中叶酰聚谷氨酸合成酶

目的 为观察甲氨蝶呤(MTX)对映体诱导肺癌A549细胞株耐药后叶酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase,FPGS)含量变化,建立一种用毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术(CEIA-LIF)测定FPGS的方法,以便为深入探讨肿瘤耐药机制提供新的实验手段.方法 实验分别选用耐药浓度为25 μmol/L的L-(+)-MTX和D-(-)-MTX肺癌A549耐药细胞株,以MTX敏感的细胞株作对照,培养获取上述3株细胞,并粗提取FIGS做CEIA-LIF和免疫印迹(WB)实验;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记FPGS抗体,与提取的FPGS进行免疫反应;然后采用CEIA-LIF,根据不同分子量蛋白具有不同的迁移时间,分离检测标记蛋白,检测L广(+)-MTX和D-(-)-MTX作用耐药前后3株肺癌A549细胞株中FPGS表达含量;同时用WB作对照,以评价CEIA-LIF的特异性和FPGs定量的准确性.结果 CEIA-LIF分离标记FPGS抗体与免疫复合物的分离时间分别为7.1、8.9 min,分离度(R)=4.5,在10 min内即完成蛋白的分离和检测.经WB鉴定3株细胞液氮冻融裂解后离心提取液中组分与FPGS抗体无非特异性条带出现.CEIA-LIF测定敏感细胞株的检测下限为0.68 mg/μl细胞;而其检测25 μmol/L L(+)-MTX和25 μmol/L D-(-)-MTX诱导耐药细胞中FPGS的表达含量分别为对照组敏感细胞的46.59%和48.36%.结论 本研究建立的CEIA-LIF检测FPGS法具有高效快速的特点,且具与WB类似的特异性;同时提高了检测的敏感度.L-(+)-MTX和D-(-)-MTX诱导耐药后细胞株中FPGS表达含量较敏感细胞株明显减少,证明MTX耐药细胞株FPGS表达含量受损.     

氨甲喋呤对映体对急性淋巴细胞白血病的不同抑制效应

目的探讨氨甲喋呤单体[L-(+)MTX、D-(-)MTX]及其不同比例对映体混合体[(±)MTX,D∶L=1∶9~9∶1]对急性淋巴细胞白血病细胞系(BALL-1、CCRF-CEM)抑制作用的差异。方法用氨甲喋呤单体及其混合体作用于BALL-1和CCRF-CEM细胞,MTT比色法分析其细胞增殖抑制率;荧光显微镜观察细胞形态学变化;碘化丙啶(PI)单染流式细胞术检测细胞周期;DNA梯度电泳检测其细胞凋亡水平。结果与对照组相比,MTX对映体对BALL-1、CCRF-CEM细胞的抑制生长呈现浓度和时间依赖性,其抑制强度依次为(±)MTX(D∶L=1∶9~2∶8)L-(+)MTXD-(-)MTX;细胞周期出现S期的阻滞,DNA梯度电泳检测出现凋亡条带;亲本BALL-1、L-(+)MTX/BALL-1、D-(-)MTX/BALL-1间差异有统计学意义(P0.01)。亲本CCRF-CEM、L-(+)MTX/CCRF-CEM、D-(-)MTX/CCRF-CEM的细胞周期间差异亦有统计学意义(P0.01)。结论 MTX对映体对BALL-1、CCRF-CEM细胞的增殖抑制作用具有化学结构的立体选择性。     

氨甲蝶呤对映体获得性耐药A549细胞株二氢叶酸还原酶基因表达分析

摘要：目的：研究氨甲蝶呤(MTX)对映体［L-(＋)-MTX和D-(-)-MTX］耐药与二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达的关系。 方法：用浓度递增结合低剂量持续诱导法获得A549细胞对不同构型及不同浓度的MTX对映体的耐药细胞株,荧光定量PCR检测耐药细胞株中DHFR基因的相对含量。 结果：对两种不同对映体的获得性耐药存在差异,D型耐药细胞耐药指数高于L型;对映体各浓度耐药细胞间耐药指数也有差异。15 μmol/L L型、D型MTX首次诱导耐药细胞的DHFR相对含量低于亲本细胞,对该浓度对映体耐药的各细胞组间没有差别（P＞0.05）。35~45 μmol/L浓度耐药细胞的DHFR相对含量增加,45 μmol/L D型耐药细胞DHFR相对含量高于对应浓度L型耐药细胞,差异有显著性(P<0.05)。 结论：首次诱导MTX耐药以抑制DHFR基因为主。DHFR基因表达具有手性差异。DHFR基因的检测有望作为肿瘤治疗监测的指标。     

亲和毛细管电泳法测定甲氨蝶呤对映体与二氢叶酸还原酶反应动力学参数

目的 建立一种测定氨甲蝶呤(MTX)两种对映体与二氢叶酸还原酶(DHFR)结合反应动力学参数的方法.方法 建立DHFR反应体系,采取亲和毛细管电泳技术,以含0.2%Brij-35的pH 9.50的50mmol/L硼砂为电泳缓冲液,检测波长为254 nm,在25 kV的电压下,分离反应体系中各组分.观察酶反应前后的电泳图谱并根据反应生成物峰面积的变化计算相关反应动力学参数,将不同浓度的氨甲蝶呤两种对映体L-(+)-MTX和D-(-)-MTX分别作用于所建立的DHFR反应体系,测定两种对映体的半数抑制浓度(IC50).结果 建立了亲和毛细管电泳法对氨甲蝶呤对映体与DHFR反应动力学参数的测定方法,在30 min内实现DHFR反应体系中反应物和生成物的分离,并根据反应生成物峰面积的变化计算得出D-(-)-MTX的IC50为3.17×10-7mol/L,L-(+)-MTX的IC50为2.48×10-8mol/L,两者相差13倍左右.结论 亲和毛细管电泳的方法可以快速准确地用于DHFR反应动力学参数的研究,通过检测MTX对映体对DHFR的抑制能力的差异,首次发现MTX对映体对DHFR有立体选择性作用.     

缺氧诱导因子-1α对A549细胞株中生存素表达及其生物学特性的影响

目的观察非小细胞肺癌细胞株A549中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对生存素转录的调控作用及对A549细胞增殖、凋亡及迁移的影响。方法用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测生存素启动子序列与核蛋白结合的情况。EMSA实验分为阴性对照反应组、结合反应组、探针冷竞争反应组、突变探针的冷竞争反应组和特异性抗体反应组。应用脂质体将载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA HIF-1α质粒和阴性(错义链)、内参(β-肌动蛋白)微小RNA(miRNA)质粒转染A549细胞。转染分为未处理组(正常A549细胞)、HIF-1α沉默组(转染HIF-1αmiRNA质粒)、阴性对照组和内参组。杀稻瘟菌素筛选阳性克隆扩大培养;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法筛选出对A549细胞干扰效果最佳的miRNA HIF-1α干扰载体;常氧、缺氧条件下检测各组中HIF-1α、生存素在mRNA和蛋白水平的变化;用细胞计数法、流式细胞术和转移小室迁移试验检测各组细胞增殖、凋亡及迁移细胞数。结果 (1)γ-32P标记的生存素启动子序列-26^-9 bp与A549细胞核蛋白作用,该条带可与HIF-1α抗体结合产生特异性抗体结合条带;(2)常氧下HIF-1α沉默组的HIF-1α和生存素mRNA分别为0.313±0.051和0.060±0.008,明显低于未处理组的1.042±0.036和1.071±0.016(F=436.433,0.002,均P<0.05);HIF-1α和生存素的蛋白含量分别为0.559±0.051和0.051±0.003,未处理组分别是1.452±0.146和0.194±0.007,两组比较差异有统计学意义(F值为53.525和331.646,均P<0.05)。缺氧条件下HIF-1α沉默组中HIF-1α、生存素的mRNA和蛋白分别为0.604±0.040、0.394±0.018、0.997±0.026、0.172±0.006,明显受到抑制(mRNA的t值分别为7.809和-28.936,均P<0.01;蛋白的t值分别为13.523和-14.202,均P<0.01);常氧条件下,转染miRNA后A549细胞增殖(24 h为0.273±0.008)无明显变化,但迁移细胞数(30±6)比未处理组(121±17)减少;缺氧条件下,转染miRNA后,A549细胞生长速度(24 h为0.273±0.008)减慢,细胞体外的迁移细胞数(75±4)减少(均P<0.05)。结论 A549细胞中生存素核心启动子上存在HIF-1α结合位点;miRNA沉默A549细胞HIF-1α表达后,可有效下调生存素基因表达,常氧条件下仅抑制细胞迁移,缺氧条件下不仅促进细胞凋亡,还可抑制细胞增殖和迁移。     

氨甲喋呤对映体体外诱导BALL-1和 CCRF-CEM细胞系蛋白质表达差异

目的探讨氨甲喋呤对映体(methotrexate,MTX)体外诱导急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞系BALL-1和CCRF-CEM蛋白质表达的差异性。方法通过浓度递增及低剂量持续性诱导构建耐受30μmol MTX对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]的CCRF-CEM和BALL-1细胞系。提取耐药细胞、非耐药细胞及不加药时两种细胞的总蛋白质,利用双向凝胶电泳技术获得亲本细胞和耐药细胞的电泳结果,选择差异倍数在2倍以上且边界比较清晰的蛋白质点,经胶内原位酶解,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定肽质量指纹图(PMF),将所得的结果进行生物学信息分析。结果共发现12个蛋白质点有生物学功能,包括4个热休克相关蛋白(HPSA5、HPSA8、HSPD1和DNAJA1/4)、5个与细胞增殖有关联的蛋白质(PCNA、NPM1、CORO1A、CALR和DYNC1I2)以及2个分子伴侣相关蛋白(CCT6A/B和VCP),另1个蛋白质为EON1/2,并证实其与细胞的新陈代谢有关联。结论 MTX对映体诱导耐药后细胞系蛋白质表达发生变化,可能在耐药过程中具有重要的作用。     

Super enhancer‐LncRNA SENCR promoted cisplatin resistance and growth of NSCLC through upregulating FLI1

BackgroundSuper enhancer‐lncRNA smooth muscle and endothelial cell‐enriched migration/differentiation‐associated lncRNA (SENCR) were highly overexpressed in cisplatin‐resistant A549/DDP cells, while the mechanism was unclear.MethodsSE‐lncRNA SENCR and FLI1 mRNA expression in A549/DDP cell, LAD tissues were detected. SENCR knockdown of A549/DDP cell and SENCR overexpression of cisplatin‐sensitive A549 cell were constructed. Experiments of cell‐confirmed function of SENCR and the correlation between SENCR and FLI1 were validated.ResultsThe expression of SENCR and FLI1 mRNA in A549/DDP cell were both upregulated and mainly localized in the nucleus. Compared with DDP‐sensitive tissues with disease relief, SENCR expression was higher in DDP‐resistant tissues with disease progression from LAD. Knockdown of SENCR in A549/DDP reduced proliferation ability and cisplatin resistance, consistent with the decreased levels of proteins PCNA, MDMX, and P‐gp. Besides, whatever without cisplatin or with 2 μg/ml cisplatin, knockdown of SENCR reduced the migration, invasion, and colony formation abilities of A549/DDP cell and promoted apoptosis. However, when SENCR was overexpressed in A549 cell, all above results were reversed. Mechanistically, FLI1 expression was reduced after knocking down SENCR, while overexpressing SENCR increased FLI1 expression.ConclusionSE‐LncRNA SENCR was upregulated in A549/DDP, which could promote cisplatin resistance and growth of NSCLC cell through upregulating FLI1 expression.     

mir-17-5p、mir-92a、let-7b表达水平与非小细胞肺癌顺铂耐药的关系

目的探讨mir-17-5p、mir-92a、let-7b表达水平与非小细胞肺癌顺铂耐药关系。 方法以人非小细胞肺癌细胞系A549及其耐药株A549/DDP为研究对象,采用RT-PCR法检测mir-17-5p、mir-92a及let-7b在细胞中的表达水平,采用cck8检测其细胞存活情况,采用细胞克隆平台方法,检测转染前后细胞的增殖情况,采用流式细胞仪检测转染前后细胞的凋亡情况。 结果（1） A549/DDP细胞mir-17-5p的表达水平是A549细胞的2.11±0.25倍（P＜0.05）;A549/DDP细胞mir-92a的表达水平是A549细胞的 7.40 ± 1.05 倍（P＜0.05）;而A549/DDP 细胞let-7b 的表达水平是A549 细胞的（26.54 ± 2.90）%（P＜0.05）;（2）A549 转染mir-17-5pmimic,mir-92a mimic 以及let-7b inhibitor 后对顺铂的敏感性下降（P＜0.05）;A549/ddp 转染mir-17-5p inhibitor, mir-92a inhibitor以及let-7b mimic后对顺铂的敏感性增加（P＜0.05）;（3）A549转染mir-17-5p mimic,mir-92a mimic以及let-7b inhibitor 后,细胞形成克隆集落数量数量多于对照组（P＜0.05）;而A549/ddp 转染mir-17-5p inhibitor,mir-92a inhibitor 以及 let-7b mimic 后,细胞形成克隆集落数量数量少于对照组（P＜0.05）;（4）A549 转染mir-17-5p mimic,mir-92a mimic 以及let-7b inhibitor后,细胞凋亡率明显低于对照组（P＜0.05）;而a549/ddp转染mir-17-5p inhibitor,mir-92a inhibitor以及let-7b mimic后, 细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.05）。结论Mir-17-5p、mir-92a表达水平升高,let-7b表达水平下降,可以促进肺癌细胞增殖, 抑制其凋亡以及使肺癌细胞对顺铂敏感性下降。      

Vinculin表达对非小细胞肺癌A549细胞生物学特征的影响

目的通过体外实验探讨非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞系的Vinculin表达对其生物学特征的影响。方法购买人NSCLC A549细胞系,体外培养,分为对照组、空白载体组以及高表达组三组,高表达组A549细胞系转染Vinculin过表达载体,空白载体组A549细胞系转染空白载体。体外培养48 h后,应用RT-PCR检测各组A549细胞系Vinculin mRNA表达情况,应用MTT法检测细胞活性,Ki-67免疫荧光检测细胞增殖能力,Transwell培养体系Hoechst染色观察A549细胞系迁移侵袭能力。结果 RT-PCR检测结果显示,与对照组、空白载体组比较,高表达组Vinculin mRNA表达量明显增高(P<0.01);MTT法检测结果显示,与对照组、空白载体组比较,高表达组的OD值明显降低(P<0.01);Ki-67免疫荧光检测结果显示,与对照组、空白载体组比较,高表达组Ki-67⁺细胞数量明显减少(P<0.01);Transwell培养体系Hoeschst染色结果显示,与对照组、空白载体组比较,高表达组迁移和侵袭的细胞数量明显减少...     

Low‐level EFCAB1 promoted progress by upregulated DNMT3B and could be as a potential biomarker in lung adenocarcinoma

BackgroundLung adenocarcinoma (LUAD) incidence is on the rise. We found that EFCAB1 (EF‐Hand Calcium Binding Domain 1) was significantly downregulated in LUAD tissues, but the mechanism of EFCAB1 is unknown.MethodsOne hundred and two LUAD samples and corresponding NT samples were prospectively collected from patients at the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, China, from August 2018 to August 2021.EFCAB1 expression was estimated in LUAD cells and tissues by qPCR. In‐vitro cytology assays were used to detect the role of EFCAB1 in LUAD cells.ResultsEFCAB1 expression level of LUAD was significantly lower than it''s adjacent cancer tissues and that of LUAD with big tumor size (>2 cm) was significantly lower than that of small tumor size (≤2 cm) group. It shown that expression levels of EFCAB1 from A549, HCC827, PC9 were lowly expressed. The cell migration, invasion, colony formation, proliferation ability of EFCAB1 OE A549, PC9 were lower than that of EFCAB1 OE A549, PC9 NC group, while the apoptotic cells percentage of the EFCAB1 OE A549, PC9 group were significantly increased. We found that DNMT1 mRNA expression level of PC9 was higher than that of BEAS‐2B, while these of A549, HCC827 decreased. Compared with BEAS‐2B, DNMT3A mRNA expression level of PC9 increased. DNMT3B mRNA expression level of PC9, HCC827 were higher than these of BEAS‐2B.ConclusionThe EFCAB1 mRNA in LUAD patients and cell lines were downregulated; EFCAB1 overexpression inhibited cell proliferation, migration, invasion, while promoted apoptosis. EFCAB1 was expected to become a biomarker of LUAD.     

破骨细胞外泌体miR-183-5p靶向程序性细胞死亡因子4促进肺腺癌细胞增殖及侵袭

目的 探讨破骨细胞来源外泌体(osteoclast-derived exosomes)中miR-183-5p靶向程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)对肺腺癌侵袭增殖的影响。方法 利用RAW264.7细胞诱导分化破骨细胞并提取外泌体,透射电镜及粒度仪对其进行鉴定。将外泌体与A549细胞共培养,通过CCK8法检测细胞活性,观察miR-183-5p对A549细胞增殖的作用;检测A549细胞周期分布,观察miR-183-5p对细胞周期的作用;利用Transwell侵袭实验,观察miR-183-5p对A549细胞侵袭能力的作用。Western blotting检测PDCD4、周期蛋白D1(Cyclin D1, CCND1)和周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase, CDK4)相对表达,观察miR-183-5p靶蛋白表达情况及其对A549细胞侵袭、增殖的影响。结果 外泌体呈边缘透亮清晰的椭圆形囊泡状结构,粒径分布范围30-200nm左右,荧光探针发现外泌体能够较快的被肺腺癌细胞A549摄取,并且共培养后A549细胞中miR-183-5p表达水平明显增高(p<0.01)。miR-183-5p高表达可以明显促进A549细胞的侵袭、细胞增殖和周期(p<0.05)。A549细胞中miR-183-5p过表达后,PDCD4表达降低,同时CCND1、CDK4也高表达(p<0.05)。结论 破骨细胞来源的外泌体与A549细胞共培养可提高细胞中miR-183-5p的表达,miR-183-5p通过靶向抑制PDCD4表达可促进肺腺癌细胞侵袭、增殖和迁移能力。