毒死蜱激活小胶质细胞对多巴胺能神经元的影响

小胶质细胞的激活可导致神经元损伤,从而导致神经退行性疾病如帕金森病的发病。为了探讨毒死蜱(CPF)对小胶质细胞激活、炎症因子表达分泌,以及对多巴胺能神经元存活率的影响,本研究采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测CPF刺激BV-2细胞(0、1、3、6、12、24h)后BV-2细胞形态的改变及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧化酶2(COX-2)mRNA和蛋白表达的变化;然后将BV-2细胞分为CPF组、DMSO对照组、NS对照组,分别刺激BV-2细胞12h后,将各BV-2细胞培养液加入SH-SY5Y细胞共培养24h。采用MTT方法检测经不同处理的BV-2细胞的条件培养液对SH-SY5Y存活率的影响。发现CPF作用下,BV-2小胶质细胞激活,炎症因子iNOS mRNA、COX-2mRNA及其蛋白表达水平均升高。激活的BV-2细胞通过分泌炎症因子造成神经元损伤。总之,CPF作用下小胶质细胞激活产生炎症因子,介导对神经元的损伤,进而可能参与了帕金森病的发病过程。     

SH-SY5Y细胞凋亡过程中Cpne5蛋白表达的变化

目的探讨Cpne5蛋白在SH-SY5Y细胞凋亡中表达量的变化。方法显微镜观察细胞形态及流式细胞术检测凋亡率,鉴定A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡及血清剥夺诱导凋亡的模型;免疫印迹法检测两种凋亡过程中Cpne5蛋白表达量的变化。结果 10μmol/L A23187诱导SH-SY5Y细胞24h,细胞出现皱缩、凋亡率增加。A23187诱导0.5h,Cpne5蛋白表达量即出现明显的上升,持续至12h;在24h时Cpne5蛋白表达量回落至诱导前水平。血清剥夺72h的SH-SY5Y细胞24份,凋亡率为23.2±2.1%,与对照组1.1±0.1%比,差异有统计学意义（P〈0.01）。免疫印迹结果表明,SH-SY5Y细胞分别经血清剥夺1h、6h、12h、24h、72h对Cpne5蛋白表达量无明显变化。结论 A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡早期Cpne5蛋白表达量有显著变化;提示Cpne5基因可能参与凋亡调控的钙信号通路。     

冈田酸诱导人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y损伤

目的 探索冈田酸(OA)诱导神经元微管蛋白相关蛋白(Tau)异常磷酸化对人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)损伤的影响。方法 将OA按照不同浓度(20和40 nmol/L)和/或时间(0、12、24、48和72 h)处理SH-SY5Y细胞;光学显微镜下观察细胞形态学;透射电子显微镜观察细胞超微结构;TUNEL法检测细胞凋亡;Western blot检测p-Tau和caspase3蛋白的表达;RT-qPCR检测细胞凋亡抑制家族蛋白(IAPs)的mRNA表达。结果 与对照组相比,OA显著增加SH-SY5Y细胞Tau蛋白磷酸化(P<0.001),促进细胞损伤凋亡(P<0.001),损伤线粒体结构,同时也可显著上调IAPs表达(P<0.05)。结论 OA诱导的SH-SY5Y细胞的Tau蛋白异常磷酸化可导致细胞损伤凋亡,抑制内源凋亡通路或上调IAPs可能作为阿尔茨海默病(AD)防治的重要靶标。     

腺相关病毒介导胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖诱导神经元凋亡的保护作用

目的 研究重组腺相关病毒(AAV)载体介导胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF Ⅰ)在体外神经元表达的情况,及其对高糖诱导神经元凋亡的保护作用.方法 利用分子克隆技术将大鼠IGF Ⅰ基因克隆到pSNAV2.0质粒上,构建包含重组质粒pSNAV2.0-IGF Ⅰ的杂合型重组AAV载体rAAV2/1-IGF Ⅰ.将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为正常组(A组)、无血清组(B组)、无血清高糖组(C组),无血清高糖+rAAV2/1-IGF Ⅰ组(D组),其中A组不做任何处理;B组使用无血清培养基培养;C组用含100mmol/L D-葡萄糖的无血清培养基培养;D组则先用rAAV2/1-IGF Ⅰ病毒载体感染后再用含100 mmol/LD-葡萄糖的无血清培养基处理.干预24 h后应用RT-PCR和Western免疫印迹检测各组IGF Ⅰ基因和蛋白的表达情况;应用Hoechst33342荧光染色法、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡.观察rAAV2/1-IGF Ⅰ感染后对高糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用.结果 成功构建rAAV2/1-IGF Ⅰ重组AAV载体.感染SH-SY5Y细胞后,RT-PCR显示SH-SY5Y能表达大鼠IGF Ⅰ基因;Western免疫印迹检测发现D组IGF Ⅰ蛋白的表达水平(0.44±0.04)显著高于其他3组(A组0.29±0.02,B组0.17+0.02,C组0.08±0.02,均P<0.05).rAAV2/1-IGF Ⅰ能明显降低高糖诱导细胞捌亡的凋亡率:Hoechst33342荧光染色检测总凋亡率分别为A组(2.71±1.03)%,B组(9.17±1.72)%,C组(25.63±1.81)%,D组(14.50±2.27)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪分析结果表明AnnexinV-FITC~+/PI~+的早期凋亡细胞加上AnnexinV-FITC~+/PI~+的晚期凋亡细胞的总细胞凋亡率A组为(5.01±1.17)%,B组为(9.87±1.38)%,C组为(27.56±2.25)%,D组为(17.34±2.08)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05).结论 rAAV2/1-IGF Ⅰ感染体外神经元SH-SY5Y细胞能显著表达IGF Ⅰ蛋白,并有效地降低高糖对神经元的诱导凋亡作用.     

丹参酮ⅡA 对树突状细胞表型的影响及对功能的调控

目的:提取小鼠骨髓树突状细胞(DCs),体外给予丹参酮ⅡA 干预,观察药物刺激后DCs 功能的改变,从而探讨丹参酮ⅡA 在免疫系统中的作用机制。方法:提取小鼠的骨髓DCs,体外给予10 ng/ ml GM-CSF 及IL-4 的完全培养液培养,并在第5 天,磁珠分选得到纯度90%以上的树突状细胞,体外给予一定浓度的丹参酮ⅡA 及LPS 刺激,收集细胞及上清,运用流式细胞技术检测DCs 表型,ELISA 方法检测细胞上清TNF-β、IL-12 含量变化,同种混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖及分化的能力。结果:在丹参酮ⅡA 浓度为500 ng/ ml 时,药物对DCs 抑制作用达到最大,因此选取该浓度为实验作用浓度;即在500 ng/ ml 作用下,实验组与对照组相比,DCs 表达MHCⅡ、CD86 及CD80 水平均显著降低(P<0.05);实验组DCs 分泌的TNF-β及IL-12 含量均显著降低(P<0.05);实验组DCs 刺激淋巴细胞增殖反应能力明显降低(P<0.05);实验组DCs 刺激T 淋巴细胞分泌IL-4 含量明显高于对照组,IFN-β含量明显低于对照组(P<0.05)。结论:丹参酮ⅡA 可以通过降低LPS 诱导的DCs 成熟状态,来参与免疫系统或自身免疫性疾病的发生发展。     

丹参酮ⅡA通过PI3K/AKT/ERK信号通路对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响北大核心CSCD

目的:探讨丹参酮ⅡA通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/细胞外调节激酶(ERK)信号通路对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法:取对数生长期的U251细胞,并分为空白组(未处理的U251细胞)、对照组(0.1%DMSO)、丹参酮ⅡA组(20μmol/L丹参酮ⅡA)、IGF-1组(100 ng/ml PI3K/AKT/ERK通路激活剂IGF-1)、丹参酮ⅡA+IGF-1组(20μmol/L丹参酮ⅡA与100 ng/ml IGF-1同时处理),倒置显微镜观察各组细胞形态;CCK-8法检测各组细胞增殖;流式细胞术检测各组细胞凋亡;Transwell实验检测各组细胞侵袭与迁移;Western blot检测各组细胞中细胞周期素D1(CyclinD1)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9及PI3K/AKT/ERK通路相关蛋白的表达。结果:与空白组、对照组比较,丹参酮ⅡA组U251细胞数量减少,细胞皱缩,出现大量细胞碎片,而IGF-1组U251细胞数量增多,细胞形态未发生改变;与丹参酮ⅡA组比较,丹参酮ⅡA+IGF-1组细胞数量增多,细胞贴壁性变强。与空白组、对照组比较,丹参酮ⅡA组U251细胞OD450值(24 h、48 h)、侵袭细胞数目、迁移细胞数目、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而IGF-1组U251细胞OD450值(24 h、48 h)、侵袭细胞数目、迁移细胞数目、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与丹参酮ⅡA组比较,丹参酮ⅡA+IGF-1组U251细胞OD450值(24 h、48 h)、侵袭细胞数目、迁移细胞数目、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:丹参酮ⅡA通过抑制PI3K/AKT/ERK通路抑制U251细胞增殖、侵袭、迁移,并诱导其凋亡。     

miR-449a过表达抑制人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖并促进其凋亡

目的探讨miR-449a对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的增殖和凋亡的影响。方法用Lipofectamine TM2000将miR-449a模似物或miR-449a对照转染至SH-SY5Y细胞,分为空白、miR-449a模似物和miR-449a对照SHSY5Y细胞组;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测各组细胞中miR-449a表达;CCK8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,Western blot检测c-Myc蛋白和Bax/Bcl-2蛋白表达。结果 miR-449a模似物瞬时转染SH-SY5Y细胞后,miR-449a的表达水平明显高于正常对照组(P0.05);SH-SY5Y细胞增殖能力受到明显抑制(P0.05);凋亡率明显增加(P0.05);c-Myc蛋白表达显著降低(P0.05);细胞促凋亡蛋白Bax表达升高;抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P0.05)。结论 miR-449a可通过c-Myc影响SH-SY5Y细胞的增殖和周期,通过调节Bax/Bcl-2影响其凋亡。     

胞外高浓度ATP诱导SH-SY5Y细胞的自噬和凋亡

 目的：观察胞外高浓度ATP损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,探讨损伤中自噬和凋亡发生的规律和特点。方法：培养的SH-SY5Y细胞按照加入ATP的浓度和作用时间进行分组。CCK-8法检测细胞生存率,单丹磺酰戊二胺染色检测自噬空泡的变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率变化,蛋白质印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ）的表达。结果：（1）与对照组相比,不同浓度（3、6、9、12、15 mmol/L）的ATP作用3 h均使SH-SY5Y细胞存活率明显降低,且呈剂量依赖性;不同作用时间（1、2、3、6 h）ATP（6 mmol/L）也可使SH-SY5Y细胞存活率明显降低,3 h达高峰,呈时间依赖性。（2）ATP作用1 h时SH-SY5Y细胞自噬空泡显著增多（P<005）,随时间延长,6 h时降到对照水平;ATP作用1 h时,LC3-Ⅱ表达显著增强（P<005）,形成高峰,与自噬空泡增多的时点重合,2 h、3 h时LC3-Ⅱ表达水平逐渐减弱,6 h时降到对照水平。（3）与对照组相比,ATP作用3 h后细胞凋亡率达高峰（P<005）,6 h时仍然保持在3 h的水平;cleaved caspase-3表达量同步增强（P<005）,6 h时达高峰。结论：胞外高浓度ATP能够诱导SH-SY5Y细胞自噬和凋亡;自噬增强在前,凋亡高潮在后;随着ATP作用时间的延长,凋亡占主导地位。     

雷公藤内酯醇对AD细胞模型海马神经元凋亡的影响

目的:研究雷公藤内酯醇对阿尔茨海默病(AD)细胞模型海马神经元凋亡的影响,探讨雷公藤内酯醇治疗AD的可能机制。方法:用凝聚态Aβ1-40(20μg/ml)刺激的小胶质细胞条件培养液(MCM)作用于培养的大鼠海马神经元,建立AD细胞模型,应用MTT法和TUNEL染色,观察不同剂量的雷公藤内酯醇(5μg/ml和25μg/ml)在不同时程(2 h和24 h)内对AD细胞模型海马神经元凋亡的影响。结果:加药后2 h除模型MCM组海马神经元凋亡数高于正常对照组和正常MCM组(P<0.05)外,其余各组之间海马神经元凋亡数无明显差异。加药后24 h,模型MCM组海马神经元凋亡数较正常对照组和正常MCM组显著增多(P<0.01);低剂量用药MCM组和高剂量用药MCM组海马神经元凋亡数与模型MCM组比较显著降低(P<0.05,P<0.01);高剂量用药MCM组海马神经元凋亡数较低剂量用药MCM组明显降低(P<0.01)。结论:雷公藤内酯醇对AD细胞模型海马神经元的凋亡具有抑制作用。     

白藜芦醇对体外培养的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞周期与凋亡的影响

目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对体外培养的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞周期与凋亡的影响。方法:通过不同浓度0.5～150μmol/L Res作用于体外培养的SH-SY5Y,72 h后用流式细胞术检测细胞周期构成比和细胞凋亡率,用Hochest染色观察细胞凋亡情况。结果:0.5～5μmol/L各组,进入G2/M期细胞所占活细胞比率逐渐升高;5～150μmol/L各组,随浓度升高,凋亡率呈现逐渐上升的趋势,而且显著高于对照组(P<0.01),其中150μmol/L组凋亡率为51.80±1.72%,进入G0/G1期间细胞为78.54±0.60%,显著高于对照组(P<0.01),而进入G2/M期细胞为0.48±0.50%,即大多细胞停留于DNA复制前期。结论:Res在0.5～150μmol/L浓度范围内对SH-SY5Y具有双向浓度依赖性,即在0.5～5μmol/L浓度范围内,Res促进SH-SY5Y细胞增殖,而在15～150μmol/L浓度范围内Res抑制SH-SY5Y细胞增殖并促进其凋亡;其中Res抑制SH-SY5Y细胞增殖并促进凋亡主要表现为阻止G1期细胞进入S期。     

mGluR4激动剂对氧糖剥夺SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究

目的:研究m GluR4在SH-SY5Y细胞氧糖剥夺模型中的预防作用,并探讨其相关机制。方法:维甲酸(RA)诱导体外培养SH-SY5Y并构建氧糖剥夺模型,将细胞分为对照组、氧糖剥夺组(OGD)、OGD+m GluR4激动剂VU0155041处理组、OGD+VU0155041+SB202190处理组。CCK8检测细胞存活率; Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,Western Blot检测蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞增殖。结果:RA诱导的SH-SY5Y细胞中广泛表达m GluR4,而m GluR4在小胶质瘤细胞中不表达; 10μmol/L的m GluR4激动剂VU0155041可显著预防OGD处理的SH-SY5Y细胞活力; m GluR4激动剂VU0155041可显著预防OGD引起的SH-SY5Y细胞凋亡,并且m GluR4激动剂VU0155041对细胞的保护作用与增殖无关; OGD可促进p-p38 MAPK通路的激活,并上调Cytc、active caspase 3水平;而m GluR4激动剂VU0155041可下调p-p38 MAPK水平,下调Cytc、active caspase 3水平,抑制细胞凋亡; p38 MAPK通路阻断剂SB202190可下调Cytc、active caspase 3水平、抑制细胞凋亡。m GluR4激动剂通过p38 MAPK通路调控SH-SY5Y细胞的存活。结论:m GluR4激动剂通过p38 MAPK通路调控SH-SY5Y细胞的存活。     

Survivin在MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡过程中的作用

目的探讨存活素(Survivin)能否抑制(1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP~+)诱导的神经元(SH-SY5Y细胞)的凋亡过程。方法运用1 mmol/L MPP~+处理SH-SY5Y细胞,诱导其发生凋亡,建立帕金森病的细胞模型,采用不同浓度的Survivin进行预处理,使用倒置显微镜观察细胞形态,采用MTT法、Real-time PCR、Western blot检测相关指标,进而评价Survivin对SH-SY5Y凋亡的作用。结果 1 mmol/L MPP~+作用24 h可诱导SH-SY5Y的凋亡,显著降低细胞存活率(F=13.32,P=0.000)。MPP~+作用前,预先经Survivin处理2 h的SH-SY5Y细胞的存活率显著提高(F=13.32,P=0.000,P=0.000,P=0.000),并呈剂量依赖性关系。Real-time PCR结果显示Survivin能够显著抑制SH-SY5Y细胞中凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的表达水平(F=61.57,P=0.000,P=0.000,P=0.000;F=54.26,P=0.001,P=0.000,P=0.000);Western blot结果亦显示Survivin能够显著抑制SH-SY5Y细胞中凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的表达水平。结论 Survivin能够剂量依赖性地抑制MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其机制可能与阻断Caspase信号通路相关。     

雷帕霉素减轻氧糖剥夺对SH-SY5Y细胞的损伤

目的:观察雷帕霉素(Rapa)对氧糖剥夺(OGD)的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的影响,并探讨自噬在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞随机分为4组:正常对照组(常规培养,不进行OGD处理)、Rapa组、OGD组(无糖培养基、1%O_2的三气培养箱内孵育细胞12 h)和Rapa+OGD组。进行形态学观察;MTT法检测细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)漏出率判断细胞损伤的程度;caspase-3活性检测试剂盒检测酶活性;原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡水平;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ及自噬调控蛋白beclin-1的表达。结果:与OGD组相比,Rapa+OGD组的细胞存活率明显升高(P0.05),LDH漏出率及caspase-3酶活性明显降低(P0.05)。TUNEL染色观察结果显示,与OGD组相比,Rapa+OGD组的细胞凋亡明显减少(P0.05);Western blot实验结果显示Rapa+OGD组的Bcl-2、beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平显著高于OGD组(P0.05),而Bax蛋白水平明显低于OGD组(P0.05)。结论:Rapa对OGD损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用,其机制可能与上调beclin-1蛋白、激活自噬有关。     

丹参酮ⅡA对Adriam诱导的人肾小球系膜细胞凋亡的保护作用

目的探究丹参酮ⅡA (TSⅡA)对阿霉素(Adriam)诱导的肾小球系膜细胞HMCL凋亡的作用。方法用不同浓度的TSⅡA处理HMCL细胞,确定安全用药范围;将细胞随机分为HMCL组、Adriamycin组、Adriam+TSⅡA(5μM)组、Adriam+TSⅡA(10μM)组和Adriam+TSⅡA(20μM)组。除HMCL组外,其余组均用Adriamycin处理细胞,Adriam+TSⅡA(5,10,20μM)组同时加入5、10、20μM的TSⅡA处理细胞,用CCK8法检测细胞增殖,流式和Hoechst染色检测细胞凋亡,Western blot检测Caspase-3和Caspase-9的表达。结果与HMCL组比较,Adriamycin组细胞增殖速度明显降低;与Adriamycin组比较,Adriam+TSⅡA (5,10,20μM)组细胞增殖速度明显升高;同时,Adriamycin组细胞凋亡率与HMCL组比较明显升高,Adriam+TSⅡA (5,10,20μM)组细胞凋亡率明显低于Adriamycin组;此外,Adriam能显著促进HMCL细胞Caspase-3和Caspase-9表达,TSⅡA能显著减弱Adriam促进Caspase-3和Caspase-9表达的作用。结论 TSⅡA能通过抑制凋亡相关蛋白的表达抑制Adriam诱导的肾小管系膜细胞凋亡。     

绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯对酒精诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用研究

目的：体外观察绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对酒精诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用,初步探讨EGCG治疗酒精性痴呆(alcohol-associated dementia,AAD)的可行性。方法：以SH-SY5Y神经元细胞为实验对象,酒精组给予100 mol/L酒精37℃培养24 h, EGCG+酒精组在其培养液中同时加入不同浓度的EGCG(1~100μmol/L)及100 mol/L酒精,37℃培养24 h;另设相同浓度的EGCG对照组(EGCG组)及空白对照组(对照组)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,以Annexin-V APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡及光镜下观察细胞形态。结果：MTT结果证实EGCG(25~100μmol/L)作用24 h后可明显促进SH-SY5Y细胞存活,并呈浓度依赖关系(P<0.001)。流式检测及细胞形态观察结果证实酒精组细胞凋亡率(21.82%±1.27%),明显高于对照组(4.90%±0.80%)(P<0.001)及EGCG组(7.82%±0.68%)(P<0.001);EGCG(100μmol/L)+酒精组细胞凋亡率(10.81%±0.31%),明显低于酒精组(P<0.001)。结论：EGCG可抑制酒精诱导SH-SY5Y细胞凋亡发生并促进细胞存活,提示EGCG对于AAD治疗具有潜在价值。     

应激和分子伴侣对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞毒性的保护作用

目的:本文探讨应激和分子伴侣(stress and chaperone,STCH)对鱼藤酮的神经毒性之于SH-SY5Y细胞的保护作用及其可能的作用机制。方法:采用不同浓度鱼藤酮处理SH-SY5Y-pcDNA 3.1和SH-SY5Y-pcDNA3.1-STCH稳定细胞株,并观察细胞形态;采用MTT法和Western蛋白印迹法检测MAPK通路相关的信号分子和凋亡相关蛋白变化。结果:与未处理组相比,鱼藤酮均能引起细胞活力显著下降(P<0.05);STCH对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有明显的保护作用(0.1μmol/L-5μmol/L),但10μmol/L浓度组与转染空载体组无显著差异。激活型caspase-3蛋白在鱼藤酮毒素处理后表达明显,p38磷酸化增强,过表达STCH在鱼藤酮处理后p38磷酸化受到明显抑制,裂解的caspase-3活性形式减少。结论:STCH对鱼藤酮诱导神经毒性的保护作用可能通过抑制p38磷酸化而实现。     

抑制miR-181a对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y多巴胺能细胞损伤的保护作用

目的:通过抑制mi R-181a表达研究其对鱼藤酮诱导SH-SY5Y的细胞损伤、内质网应激以及未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)的影响,为mi R-181a在帕金森病治疗方面提供初步的实验依据。方法:不同浓度的鱼藤酮诱导SH-SY5Y作用12、24、48、72 h;mi R-181a类似物和mi R-181a抑制剂及0.4μmol/L鱼藤酮诱导SH-SY5Y作用24 h;采用CCK-8法检测细胞存活率;Annexin V/PI双染检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测mi R-181a与葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 k D,GRP78)的靶标关系;q RT-PCR检测mi R-181a和GRP78 m RNA表达水平;Western Blot检测GRP78、肌醇需酶1α(inositol-requiring enzyme 1,IRE1α)、X-盒结合蛋白1(X box-binding protein 1,XBP1)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)的蛋白表达水平。结果:(1)CCK-8结果显示:随着鱼藤酮浓度(0.1μmol/L)增加,SH-SY5Y存活率降低,并存在浓度和时间依赖性;其中0.4μmol/L作用24 h后存活率已降为0.6(P0.05),加入mi R-181a抑制剂后细胞存活率升高达0.8(P0.05);(2)Annexin V/PI双染结果显示:抑制mi R-181a表达,细胞的凋亡降低至0.23(P0.05);(3)双荧光素酶报告基因检测显示:mi R-181a与GRP78存在直接的靶标关系;(4)q RT-PCR结果显示:0.4μmol/L鱼藤酮作用24 h后细胞mi R-181a呈高表达(P0.05),抑制mi R-181a表达可上调GRP78 m RNA水平(P0.05);(5)Western Blot结果显示:抑制mi R-181a表达可上调GRP78和下调p IRE1α、XBP1和CHOP的蛋白表达(P0.05)。结论:抑制mi R-181a表达可减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤,其机制可能通过上调GRP78进而调节内质网应激以及抑制UPR相关信号通路,从而发挥对神经元细胞的保护作用。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和LPS的刺激效果研究

目的研究肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激的反应效果,探讨急性肺损伤体外细胞模型最佳造模方法。方法体外培养的A549细胞分为正常对照组(normal control,NC组),10 ng/ml TNF-α刺激2 h组,10 ng/ml和100 ng/ml LPS分别刺激2、4、8、16 h组。Western blotting检测胞浆IκB-α含量和IκB-α、NF-κB p65磷酸化水平,qRT-PCR检测细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA转录水平,ELISA检测细胞培养上清IL-1β和IL-6质量浓度。结果 TNF-α刺激导致A549细胞大量凋亡或死亡,而LPS刺激对A549细胞生长形态无明显影响,且与LPS的刺激质量浓度和时间无关。TNF-α刺激可明显增加A549细胞内IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平(P<0.05),而LPS刺激对A549细胞内IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平无明显影响(P>0.05),且与LPS的刺激质量浓度和时间无关(P>0.05)。TNF-α刺激可显著增加A549细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA转录水平和培养上清中IL-1β、IL-6质量浓度(P<0.05),而LPS刺激对上述炎症因子的合成和分泌并无显著影响(P>0.05),且与LPS的刺激质量浓度和时间无关(P>0.05)。结论 TNF-α可以有效刺激A549产生过度炎症反应,而LPS不能刺激A549细胞产生炎症损伤,因此建立急性肺损伤体外细胞模型时可以考虑用TNF-α代替LPS刺激。     

红景天苷通过Nrf2/HO-1通路减轻6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的:研究红景天苷(salidroside,Sal)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及可能机制。方法:4-甲基偶氮唑蓝(MTT)检测SH-SY5Y细胞活性,CM-H2DCFDA染色检测活性氧(ROS);Western Blot检测核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)与血红素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表达;结果:与对照组比较,6-OHDA(150μmol/L)处理SH-SY5Y 24 h后,细胞存活率降低至44.1%±4.6%(P0.05),ROS水平增加;红景天苷(25,50μmol/L)预处理24 h后,与6-OHDA组比较,细胞存活率分别增加至68.3%±4.1%(P0.05)和80.0%±6.2%(P0.01)同时ROS减少。此外,6-OHDA(150μmol/L)可使细胞内Nrf2与HO-1的蛋白表达减少,红景天苷预处理24 h后,Nrf2与HO-1的蛋白表达依次增加。结论:Sal能减少细胞内ROS的水平,对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有浓度依赖性的保护作用,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。     

cdk5在LPS诱导培养实验大鼠腹主动脉内皮细胞凋亡中的可能作用

目的:探讨周期素依赖性蛋白激酶5(cdk5)在脂多糖(LPS)诱导培养血管内皮细胞(VEC)凋亡中的可能作用。方法:采用原代培养的大鼠腹主动脉EC,经LPS刺激培养不同时间后,ELISA测定cdk5和半氮酶酸蛋白酶-3(caspase-3)活性,同时观察cdk5特异性抑制Roscvitine(Ros)对caspase-3活性的影响;WesternBlot-ting检测cdk5蛋白表达。结果:培养的大鼠腹主动脉EC经LPS(10μg/ml)刺激培养4～24h,其caspase-3活性升高,cdk5活性也明显增强(P<0.05或P<0.01),Ros(25～50μM)可显著抑制LPS刺激培养后VECcaspase-3活性(P<0.05)。培养的EC胞浆及胞核均有cdk5蛋白表达,LPS刺激培养15～30min,cdk5由胞浆向胞核转位,1～8h胞浆及胞核cdk5表达均显著增强(P<0.05或P<0.01)。结论:cdk5可能参与LPS致VEC凋亡。