胃癌高表达cDNA片段W41的克隆及组织表达谱分析

目的：从人胃癌组织中克隆新的相关易感基因。方法：利用cDNA末端快速扩增PCR技术得到了扩增片段，将其克隆、核苷酸序列分析，并将序列在GenBank进行同源性比较。利用Northern杂交、多组织Northern及基因表达系列分析了所得基因片段的组织表达谱。结果：获得1条533bp带有poly(A)尾的cDNA片段，可见加尾信号AATAAA，与GenBank基因数据库同源比较，该序列未见与任何已知基因同源，登录GenBank(登录号为AF325202）。该序列在胃癌组织的表达强度高于对应正常组织，多组织Northern及基因表达系列分析表明该序列在多种肿瘤组织中高表达，在正常组织中表达减弱。结论：得到了1条与胃癌可能相关的新的cDNA序列。     

严重烧伤F344大鼠免疫细胞中一个EST全长序列的扩增

目的:探讨免疫细胞在大面积烧伤后全身免疫功能紊乱中的变化,对F344大鼠烧伤后血液淋巴细胞和单核细胞中的1个差异表达基因片段(AI764697.1)进一步研究。方法:根据该片段核苷酸序列设计双向引物和巢式引物,应用cDNA末端快速扩增技术(SMARTRACE)对该片段进行双向扩增,扩增后结果经测序,用Northernblot杂交验证。结果:设计的两对引物经扩增都得到了产物,克隆测序后得到1条长度为592bp的片段。Northernblot杂交在烧伤后得到1个长度约700bp的产物,在脾脏中表达水平较高,与RACE结果符合。该核苷酸序列已得到GenBank登录号AF244895。结论:在严重烧伤F344大鼠的血液淋巴细胞和单核细胞中分离并扩增出一个新的基因全长序列,其来源、定位和功能需要进一步研究。     

一个新的小鼠腭裂候选基因cDNA序列的克隆

目的 克隆并筛选与小鼠腭裂发生相关候选新基因。方法 利用聚合酶链反应改良扣除杂交技术，克隆正常组与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因，经反向点杂交鉴定后挑选阳性克隆并测序及同源性分析，Northern印迹杂交检测所获的新基因mRNA的全长。结果 经大规模测序后得4个新的表达序列标签，其中1个片段全长为809bp，Northern印迹杂交结果显示为该基因的eDNA全长。结论 获得一个新的与小鼠腭裂发生相关的候选基因的cDNA全长。     

人自然杀伤细胞抑制性受体P58.1基因的克隆与鉴定

目的 克隆及鉴定P58.1基因。方法 采用RT-PCR技术,从正常人外周血单个核细胞中扩增P58.1基因全长cDNA,经酶切后构建重组克隆载体,测序鉴定。结果 RT-PCR获得预期的扩增产物P58.1全长cDNA,成功构建pSPORT1-P58.1重组克隆载体,酶切、酶谱分析与预期结果相符。DNA测序结果与GenBank登记的人P58.1cDNA全长碱基序列一致。结论 pSPORT1-58.1重组克隆载体构建成功;P58.1基因序列与文献报道一致,为下一步构建表达载体和基因转染等工作打下良好的基础。     

人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3的克隆

目的：克隆人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3。方法：从已获得的小鼠稳睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的表达序列标签片段（BE644537）入手，构建人同源表达序列标签重叠群，应用基因特异性引物和载体特异性引物，在睾丸cDNA文库的DN或进行巢式PCR扩增、测序，对测序结果进行生物信息学分析。结果：从睾丸cDNA文库中分离出人类睾丸凋亡相关基因的5’末端而获得全长cDNA,命名为TSARG3，GenBank登录号为AF419291（保密期为1年），同时应用相同方法克隆了该基因在小鼠中的同源基因，GenBank登录号为AF419292。结论：获得人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3，该基因可能与人类睾丸生精细胞凋亡有关。     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的 克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备.方法 按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段.该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达.结果 扩增片段长度为285 bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确.Western印迹证实pEGFP-C1-APC11在真核细胞内表达.结论 成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP-C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础.     

人TALL-1基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的克隆人TALL-1基因全长及其胞外区片段，构建人TALL-1及其胞外区蛋白毕赤酵母分泌型表达载体。方法从人新鲜淋巴结组织中提取总RNA，利用RT-PCR技术扩增人TALL-1及其胞外区基因编码区序列，构建人TALL-1及其胞外区cDNA毕赤酵母表达载体，并进行序列测定。结果克隆获得的858bp和459bp片段与文献报道的人TALL-1全长及其胞外区基因编码区cDNA序列一致，将目的基因插入酵母表达载体pPiC-9Ka因子分泌信号肽下游。结论本实验为大量获得人TALL-1蛋白及其可溶性功能蛋白，以及探讨其生物学性能和未来在临床上的应用奠定了实验基础。     

胃癌及其癌前病变相关新基因GP1的生物信息学分析

目的 利用生物信息学方法对新克隆的GP1的基因和蛋白序列进行分析,推测其在胃癌发生、发展过程中的作用。方法 以人类基因组数据库为基础,利用Megablast工具和SAGE数据库对GP1进行染色体定位和组织表达分布分析;BLAST程序进行GP1的基因结构分析和相似序列搜索;ORF finder程序对GP1编码蛋白进行序列预测;应用ProParam、TMPRED等软件分析GP1编码蛋白质的理化性质、亚细胞定位及结构域等信息。结果 GP1基因全长1362bp,其最长开放读码框为801bp,编码267个氨基酸,相似性搜索发现GP1基因片段与人AF083246基因片段具有很高的相似性(100％)。在GP1蛋白上有一个与真核起始因子5C（eIF5C）具有低度同源性的结构域。SAGE结果显示GP1在多种组织中都有表达。RT-PCR验证了基因的组织表达谱。结论 生物信息学的分析表明GP1是一个胃癌相关基因,可能在胃癌的发生发展过程中起到一定的作用。     

刺激ECV304细胞增殖的新基因EOLA1的克隆和功能研究

目的 扩增内皮细胞受内毒素刺激后上调表达的新序列标签ST55（GenBank No．BMl21646）全长eDNA序列并研究其结构和生物学功能。方法 应用快速扩增cDNA末端技术延伸ST55获得其全长cDNA序列，以Noithem杂交检测其组织分布，通过酵母双杂交筛选其胞内相互作用蛋白，在ECV304细胞中稳定转染目的基因并强制表达后观察细胞生长变化。结果 获得1个全长为1404碱基的cDNA序列，作为人类新mRNA被GenBank接受（AY074889），命名为内皮高表达脂多糖相关因子1（endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1，EOLA1）。生物信息学分析显示EOLA1基因含5个外显子，定位于染色体Xq27．4，编码蛋白质由158个氨基酸组成，分子量为1789。Northern印迹显示EOLA1在人各组织和癌细胞系有不同的表达；以EOLA1 cDNA作为诱铒，进行酵母双杂交筛选人肝cDNA文库，鉴定了金属硫蛋白2A（metallothionein 2A，MT2A）为其相互作用蛋白并采用免疫共沉淀验证了这一结果。高表达EOLA1显著促进了ECV304细胞增殖。结论 EOLA1是人内皮活化相关新基因，EOLA1与MT2A的相互作用可能在炎症反应中细胞内保护方面发挥作用。     

MRP-1/CD9基因在胃癌及其癌前病变中的差异表达

目的　筛选和鉴定与胃癌发生、发展相关的基因片段 ,探讨胃癌的癌变分子机理。方法　应用荧光 m RNA差异显示技术对胃正常黏膜、癌前病变及癌组织的基因差异表达情况进行了分析。对其中的运动相关蛋白 (motility- related protein- 1,MRP- 1/CD9)基因 ,用 Northern印迹及逆转录 -聚合酶链反应技术分析在正常及不同病理状态下该基因表达的情况。结果　Northern印迹结果与 m RNA差异显示的结果相符合 ,逆转录 -聚合酶链反应显示 MRP- 1/CD9在胃癌组织中的表达 (0 .31± 0 .18)低于相应的正常胃黏膜 (0 .4 9± 0 .2 4 )及癌前病变组织 (0 .4 7± 0 .18) ,差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ;在胃癌中 ,MRP- 1/CD9在弥漫型胃癌中的表达 (0 .2 2± 0 .17)明显低于肠型胃癌 (0 .38± 0 .16 ) (P<0 .0 5 )。结论　与正常胃黏膜及癌前病变组织相比 ,MRP- 1/CD9基因在胃癌组织中表达明显降低 ,提示 MRP- 1/CD9基因的表达情况可能与胃癌的发病及其组织学分型有关。